水飛薊素逆轉(zhuǎn)人乳腺癌耐藥細胞株MCF－7/ADM耐藥性實驗研究

陸一丹 徐良額 裘嘉琪 毛丹漪 劉曉谷 王大維

水飛薊素逆轉(zhuǎn)人乳腺癌耐藥細胞株MCF－7/ADM耐藥性實驗研究

陸一丹 徐良額 裘嘉琪 毛丹漪 劉曉谷 王大維

目的觀察水飛薊素（Silymarin，Sily）對人乳腺癌耐藥細胞株MCF－7/ADM的逆轉(zhuǎn)耐藥作用。方法以CCK－8法測定阿霉素（Adm）對人乳腺癌敏感細胞株MCF－7/S和耐藥細胞株MCF－7/ ADM的毒性作用，計算出耐藥倍數(shù)。以無細胞毒性的Sily（10μg/mL）作為逆轉(zhuǎn)耐藥劑，聯(lián)合Adm觀察其對耐藥細胞株MCF－7/ADM的逆轉(zhuǎn)耐藥作用，計算得逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。結(jié)果（1）Adm對MCF－7/S和MCF－7/ADM的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為1．773μg/mL和43．812μg/mL，耐藥倍數(shù)為24．7倍。（2）Sily能夠增強ADM對MCF－7/ADM的細胞毒作用。以10μg/mL（抑制率為2．0%）的Sily聯(lián)合Adm作用于MCF－7/ADM 48h后，耐藥細胞株的IC50降至7．798μg/mL，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為5．6倍（P＜0．01）。結(jié)論Sily能夠逆轉(zhuǎn)人乳腺癌耐藥細胞株MCF－7/ADM的耐藥性。

乳腺癌；耐藥細胞株；水飛薊素；逆轉(zhuǎn)耐藥

乳腺癌是實體瘤中應(yīng)用化療最有效的腫瘤之一，但由于多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象的產(chǎn)生而導(dǎo)致化療失敗，并易引起的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，降低了許多抗癌藥如阿霉素（adriamycin，Adm）的臨床療效?？朔﨧DR的方法之一是使用逆轉(zhuǎn)劑，由于逆轉(zhuǎn)劑的人體生物利用度差或不良反應(yīng)嚴重，導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)劑在臨床舉步維艱[1]，尋找高效低毒的耐藥逆轉(zhuǎn)劑是當(dāng)前乳腺癌治療的研究熱點。本實驗從天然植物中選擇水飛薊素（Silymarin，Sily）開展對Adm耐藥性的研究。

1 材 料

1.1 細胞株 人乳腺癌細胞株MCF－7/S購自中科院上海細胞庫，具有多藥耐藥表型的耐阿霉素細胞株MCF－7/ADM由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腫瘤研究所提供。

1.2 藥物及試劑 Adm（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號H33021980）；Sily（80%）干粉（西安小草植物科技有限責(zé)任公司，批號XC20140423）。Adm用注射用葡萄糖水配成10mg/mL的工作母液，Sily干粉先用DMSO溶解為500mg/mL的工作母液（DMSO在無毒劑量內(nèi)），分裝后避光保存于－20℃冰箱，使用時用培養(yǎng)液配成相應(yīng)濃度應(yīng)用液。CCK－8（碧云天生物技術(shù)研究所，批號0703081421）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 將敏感細胞株MCF－7/S置于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、飽和濕度及5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。相應(yīng)耐藥株MCF－7/ADM連續(xù)培養(yǎng)在含1．0μg/mL的Adm的上述培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件相同。

2.2 MCF－7/ADM耐藥細胞株對Adm耐藥倍數(shù)的測定 實驗分MCF－7/S+Adm、MCF－7/ADM+Adm組、空白組（只含培養(yǎng)液）、陰性對照組四組。取對數(shù)生長的MCF－7/S、MCF－7/ADM細胞懸液100μL分別接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔細胞數(shù)均為2×105個，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12h后加入不同濃度的Adm溶液（用FBS（－）RM1640培養(yǎng)液將10mg/mL的工作母液配成相應(yīng)濃度應(yīng)用液），敏感組Adm終濃度分別為0．16、0．8、4、20μg/mL和耐藥組ADM終濃度分別為1、7、50、100μg/mL。同時設(shè)立只含RM1640培養(yǎng)液的空白對照和不加任何藥物的陰性對照組，每組均設(shè)3個復(fù)孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48h后棄去上清液，PBS清洗兩遍，加入含10%CCK－8的RM1640培養(yǎng)液100μL/孔，作用3h后用酶標儀檢測波長450nm時的OD值（吸光度）。計算Adm對敏感細胞、耐藥細胞的半數(shù)抑制量IC50和耐藥細胞對Adm的耐藥倍數(shù)（耐藥細胞IC50/敏感細胞IC50）。實驗平行重復(fù)6次。

2.3 測定無細胞毒性劑量的Sily對MCF－7/ADM耐藥細胞的逆轉(zhuǎn)作用 實驗分MCF－7/ADM+Adm、MCF－7/ADM+Adm+Sily、MCF－7/ADM+Sily三組。Sily劑量參考文獻，定為10μg/mL[2]，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔；空白和陰性對照組及余法同2．2．1。計算Adm對MCF－7/ADM細胞的IC50，與Sily的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)（逆轉(zhuǎn)前IC50/逆轉(zhuǎn)后IC50）。實驗平行重復(fù)6次。

3 結(jié) 果

3.1 Adm對MCF－7/S，MCF－7/ADM的細胞毒性Adm對人乳腺癌MCF－7細胞系的細胞毒性作用與濃度呈正相關(guān)，但對敏感株和耐藥株的效價差異巨大，如Adm在0．8μg/mL以上時就對MCF－7/S具有明顯的細胞毒性作用（抑制率28．24%），而到50μg/ mL時對MCF－7/ADM的誘導(dǎo)凋亡作用仍較前者弱（抑制率14．69%）。見表1～2。MCF－7/ADM對Adm的抗腫瘤作用有明顯的耐受性，耐藥倍數(shù)（resistance index，RI）為24．7倍，見表4。

表1 Adm對MCF－7/S生長的影響（±s）

表1 Adm對MCF－7/S生長的影響（±s）

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表2 Adm對MCF－7/ADM生長的影響（±s）

表2 Adm對MCF－7/ADM生長的影響（±s）

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3.2Sily對MCF－7/ADM耐藥細胞的逆轉(zhuǎn)作用 MCF－7/ADM+Sily（10μg/mL）組結(jié)果是抑制率僅為2．0%，Sily10μg/mL對MCF－7/ADM為無細胞毒性劑量，排除了藥物協(xié)同作用的干擾。Adm對MCF－7/ADM的細胞毒性作用因MDR被削弱，與Sily聯(lián)合用藥后，Adm的效價顯著提高，見表3。IC50下降至7．798μg/ mL。Sily增強了Adm對MCF－7/ADM細胞的殺傷作用，提高細胞對Adm的敏感性，逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)（reversalfold，RF）為5．6倍，見表4。

表3 Sily對Adm抑制MCF－7/ADM生長的影響（±s）

表3 Sily對Adm抑制MCF－7/ADM生長的影響（±s）

表4 Sily逆轉(zhuǎn)MCF－7對Adm耐藥的結(jié)果（±s）

表4 Sily逆轉(zhuǎn)MCF－7對Adm耐藥的結(jié)果（±s）

注：與MCF7/S組比較，△△P＜0．01；與MCF－7/ADM組比較，**P＜0．01

4 討 論

水飛薊素是從菊科藥用植物水飛薊Silybum marianum L．Gaertn.種子的種皮中提取出來的一種黃酮木脂素類化合物，主要成分有水飛薊賓、異水飛薊賓、水飛薊寧和水飛薊亭等黃酮類物質(zhì)。研究[2－4]表明它具有促進膽汁分泌和消炎、保護肝臟、強抗氧化等作用。近年來，進一步研究發(fā)現(xiàn)Sily對膀胱癌、肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等均具有良好的抑制作用，其抗癌機制呈現(xiàn)多步驟、多靶點、全方位特點，并能增強動物機體細胞免疫功能，適合用于臨床抗腫瘤藥物研發(fā)。如Sily Sadava等[5]近期在人小細胞肺癌作用的研究中發(fā)現(xiàn)水飛薊賓對人小細胞肺癌細胞株H69和耐藥細胞株VPA17有近似的細胞毒性，IC50在60μM左右，沒有耐藥性，主要引起細胞G1期生長抑制，不影響細胞周期參數(shù)，通過激活caspase3的方式啟動凋亡程序，誘導(dǎo)細胞凋亡；劉志剛等[6]研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊素可誘導(dǎo)人膀胱癌細胞 TCC、T－24的表達，使CDK2、CDK4和相關(guān)激酶的活性降低，使細胞周期阻滯在G1期，抑制細胞增殖；此外，水飛薊素還能誘導(dǎo)腫瘤細胞分化、抑制腫瘤血管生成、抑制TNF所誘導(dǎo)的NF－kB激活等[7]；韓月恒等[1]經(jīng)體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)水飛薊素對乳腺癌MCF－7細胞有一定的抑制作用（IC50＜0．2%）；Rastegar等[8]在人乳腺癌MCF－7細胞系實驗中，發(fā)現(xiàn)75μg Sily和Adm有協(xié)同效應(yīng)，能夠增強Adm的治療效果，因此，Sily在較高劑量時能夠抑制腫瘤細胞的增殖、影響其細胞周期的分布或誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，并對乳腺癌細胞有一定的抑制作用。

盡管如此，關(guān)于Sily對乳腺癌化療逆轉(zhuǎn)耐藥性的研究鮮有報道，經(jīng)本實驗證實，Adm作用于MCF－7/ S、MCF－7/ADM時用量相差懸殊，說明體外培養(yǎng)的細胞狀態(tài)下乳腺癌細胞的確存在對Adm耐藥的情況；Sily能夠逆轉(zhuǎn)人乳腺癌耐藥細胞MCF－7/ADM對Adm的耐藥性，水飛薊素與Adm聯(lián)合用藥后，增強Adm對乳腺癌耐藥細胞株的殺傷作用，提高耐藥細胞株對Adm的敏感性，相比其他文獻記載中常用的一些逆轉(zhuǎn)耐藥中藥制劑，如大黃素耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2．86[9]，粉防己堿為2．0[10]，西藥中10μmol/L環(huán)孢素A 和1μmol/L雷帕霉素耐藥逆轉(zhuǎn)倍數(shù)均為1．6[11]，與本研究水飛薊素的逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)5．7相差懸殊?？梢娝w薊素具有高效的逆轉(zhuǎn)耐藥作用。

此外，我們選用Sily 10μg/mL（抑制率2%）作為逆轉(zhuǎn)耐藥實驗的研究劑量，結(jié)合文獻記載粉防己堿在不產(chǎn)生細胞毒性時用藥濃度一般在（抑制率≤5%）0．625μg/mL[10]，延胡索乙素則為2．5μg/mL[12]，遠低于中藥水飛薊素。說明在不產(chǎn)生細胞毒性條件下，中藥水飛薊素用藥濃度大于其他逆轉(zhuǎn)耐藥劑濃度，具有低毒的特點。Sily主要成分為有強抗氧化性的類黃酮，Soria等[13]通過研究Sily在砷（As）對乳腺癌細胞系MCF－7和ZR－75－1的抗癌作用發(fā)現(xiàn)，其能減少As對正常細胞的毒性作用而不干擾其抗腫瘤作用，建議Sily作為膳食抗氧化劑輔助癌癥化療。

綜上，中藥水飛薊素不僅具有逆轉(zhuǎn)乳腺癌耐藥性，而且具有目前臨床藥物所缺乏的高效、低毒優(yōu)勢，有很大的研究價值。

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（收稿：2015－10－13 修回：2015－10－23）

Reversal Effect of Silymarin on Drug Resistant Breast CancerCell MCF-7/ADM

LU Yidan,XU Liange,QIUJiaqi,MAO Danyi,LIU Xiaogu,WANG Dawei．Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou（310053）,China

ObjectiveTo investigate the effect of silymarin on drug resistance of breast cancer cell line MCF－7/ADM．MethodsThe toxicant effect of adriamycin to MCF－7/S（sensitive strain）and MCF－7/ADM（drug－resistant strain）was measured by CCK－8 in vitrofor resistant index．Silymarin was screened in advance and the dose of 10 μg/ml was nontoxicant to MCF－7/ADM,then MCF－7/ADM was treated with this dose of silymarin（10μg/ml）to observe the reversal effect of silymarin．ResultsIC50 of adriamycin to MCF－7/S and MCF－7/ADM were 1．773 μg/ ml and 43．812μg/ml,respectively．Drug－resistant index of MCF－7/ADM was 24．7．Silymarin increased cell toxic effect of adriamycin．After treated with 10μg/mlsilymarin（inhibition rate was 2．0%）combining with adriamycin for 48h,IC50of adriamycine declined to 7．798μg/ml,and the reversal index was 5．6（P＜0．01）．ConclusionSilymarin could partly reverse drug－resistance of MCF－7/ADMto adriamycinein vitro．

breast carcinoma;drug resistance;silymarin;reversingdrug－resistance

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃（新苗人才計劃）項目（No．2014R410038）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（No．2016ZB030）

浙江中醫(yī)藥大學(xué)（杭州 310053）

毛丹漪，Tel：18957130865；E－mail:danyimao@163．com劉曉谷，Tel：18858133126；E－mail：liuxiaogu@126．com