不同血瘀證亞型對小鼠移植瘤及肺轉移灶4T1細胞遷移及侵襲能力的影響

路晨雯郭 勇

·論著·

不同血瘀證亞型對小鼠移植瘤及肺轉移灶4T1細胞遷移及侵襲能力的影響

路晨雯1郭 勇2

目的觀察不同血瘀證亞型Balb/c小鼠移植瘤及肺轉移灶4T1細胞的遷移及侵襲能力。方法 將9只雌性8周齡Balb/c小鼠隨機分為單純荷瘤組、寒凝血瘀荷瘤組、熱毒血瘀荷瘤組，每組3只，分別造模。造模第43天處死小鼠，無菌條件下取移植瘤及肺轉移灶組織，通過細胞劃痕試驗、Transwell遷移及侵襲試驗分別檢測不同血瘀證亞型移植瘤及肺轉移灶中4T1細胞遷移及侵襲能力。同一證型造模組中移植瘤與肺轉移灶間采用t檢驗比較差異，同種組織來源部位（移植瘤或肺轉移灶）中三組證型造模組間采用方差分析比較差異。結果單純荷瘤組、寒凝血瘀荷瘤組、熱毒血瘀荷瘤組中，移植瘤與肺轉移灶的4T1細胞細胞劃痕試驗結果依次為（47.5±19.8）μm比（215.8± 145.7）μm、（59.0±8.5）μm比（577.3±70.5）μm、（118.8±15.2）μm比（663.4±23.8）μm，除單純荷瘤組外寒凝血瘀荷瘤組、熱毒血瘀荷瘤組肺轉移灶細胞遷移距離均大于移植瘤（P＜0.05）；Transwell遷移試驗結果為（13.5±8.4）個/視野比（25.9±12.8）個/視野、（17.5±3.8）個/視野比（49.0±9.7）個/視野、（38.5± 11.3）個/視野比（65.8±31.2）個/視野，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Transwell侵襲試驗結果為（15.8±5.6）個/視野比（45.1±16.1）個/視野、（38.0±18.1）個/視野比（129.2±47.6）個/視野、（48.6±19.4）個/視野比（83.5±46.7）個/視野，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。移植瘤及肺轉移灶中不同證型造模組組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論與移植瘤比較，同一證型造模組肺轉移灶4T1細胞總體具有更強遷移及侵襲能力；不同證型造模組間比較，寒凝血瘀證肺轉移灶4T1細胞侵襲力明顯增強，熱毒血瘀證移植瘤及肺轉移灶4T1細胞遷移力較強。不同血瘀證亞型對小鼠移植瘤及肺轉移灶4T1細胞遷移及侵襲能力影響存在差異。

小鼠；中醫(yī)證候；血瘀證；亞型；移植瘤；轉移灶；遷移；侵襲

腫瘤的治療手段多種多樣，但死亡率仍居高不下，其主要原因在于腫瘤的復發(fā)及轉移仍未能得到有效控制。目前腫瘤的治療大致分為手術期、輔助治療期、隨訪期和姑息治療期4個不同階段[1]。中醫(yī)藥在改善腫瘤患者微環(huán)境、預防或延緩腫瘤的復發(fā)及轉移方面有其優(yōu)勢，特別是在完成手術及輔助治療后的隨訪期，在現(xiàn)代醫(yī)學往往不加干預的這一階段，中醫(yī)藥的有效介入能很好地填補這一治療空白。目前中醫(yī)治療腫瘤的治則大多圍繞扶正祛邪進行，辨證施以健脾理氣、養(yǎng)陰清熱、軟堅散結、活血化瘀等。其中除活血化瘀法被質疑外，其余治則在正確辨證的前提下，多有較理想的臨床療效及安全性。多項研究[2]表明，活血化瘀法可改善血液高凝狀態(tài)及微循環(huán)障礙，發(fā)揮抑瘤作用,然而也有相關研究[3]發(fā)現(xiàn)，活血化瘀法能促進腫瘤的復發(fā)及轉移，亦或是由于腫瘤來源類型的不同，或活血化瘀藥物劑量的不同等，同種活血化瘀藥物出現(xiàn)抑制與促進腫瘤復發(fā)及轉移的雙向作用[4-5]。血瘀證廣泛存在于腫瘤患者中，有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者中合并血瘀證者占65.2%[6]。隨著對血瘀證研究的逐漸深入,越來越多的研究者意識到血瘀證的腫瘤相關研究存在諸多爭議,其根源或許是臨床上血瘀證不是一種單一證候,而是因病因病機的不完全相同存在氣虛血瘀、氣滯血瘀、寒凝血瘀、熱毒血瘀等諸多亞型。各亞型除存在微循環(huán)障礙或血液流變性異常等血瘀證共性外，又存在各自特性，若不加以區(qū)別，往往不能針對病因病機辨證施治，這或許是探索活血化瘀與腫瘤復發(fā)轉移間關系的關鍵所在。過往研究多針對于移植瘤腫瘤細胞開展,而本實驗研究意在通過體外實驗同時觀察移植瘤及肺轉移灶腫瘤細胞的生物學行為變化，比較之間可能存在的差異，從而對血瘀證有更深入的認識。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雌性8周齡Balb/c小鼠9只，體質量（20±2）g，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：SYXK（浙）2013-0184。SPF條件下飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心C區(qū)：溫度（24±2）°C，濕度（55±5）%，噪音＜50db，每12h 1次亮暗循環(huán)，2周更換1次敷料，滅菌水及飼料供動物自由攝入。

1.2 細胞系及主要藥品及試劑 小鼠乳腺癌細胞：4T1，購自浙江中醫(yī)藥大學實驗室。0.1%腎上腺素注射液購自上海禾豐制藥有限公司；Lipopolysaccharides（LPS）購自SIGMA公司；RPMI1640培養(yǎng)基、PBS、Hanks試劑購自杭州科易生物技術有限公司；青-鏈霉素溶液、0.25%胰酶-EDTA、4%多聚甲醛購自吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司，結晶紫（Crystal violet）購自Solarbio公司；胎牛血清購自GIBCO公司產品；Matrigel購自BD公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及動物模型制備 4T1細胞復蘇后于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內。將SPF條件下培養(yǎng)的9只健康雌性8周齡Balb/c小鼠采用隨機分組法分成單純荷瘤組、寒凝血瘀荷瘤組、熱毒血瘀荷瘤組，每組3只。單純荷瘤組小鼠自由攝食飲水，第15天小鼠乳房脂肪墊下原位注射4T1細胞懸液0.1mL/只（細胞密度約5×106/mL）。寒凝血瘀證荷瘤組小鼠每天定點皮下注射0.1%腎上腺素0.08mL/kg（用生理鹽水稀釋到0.2mL），分兩次注射，第一次注射0.1mL，1h后進行冰?。?～6℃）4min，然后進行再次皮下注射0.1mL，連續(xù)14天，第15天小鼠乳房脂肪墊下原位注射4T1細胞懸液0.1mL/只（細胞密度約5× 106/mL）[7]。熱毒血瘀證荷瘤組小鼠每只首次以3mg/ kg的劑量行尾靜脈注射LPS溶液0.1mL，20h后起以2mg/kg的劑量行腹腔注射0.1mL，隔天1次，連續(xù)14天，第15天小鼠乳房脂肪墊下原位注射4T1細胞懸液0.1mL/只（細胞密度約5×106/mL）[8]。

1.4 細胞原代培養(yǎng) 造模第43天處死三組小鼠,無菌條件下取乳腺移植瘤體組織及肺轉移灶組織，采用組織塊接種法移植回培養(yǎng)瓶中予含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，2天后移去小瘤塊，換液后繼續(xù)培養(yǎng)以擴大細胞總量。

1.5 細胞劃痕實驗 待細胞進入對數(shù)生長期后，取每組細胞接種于6孔板中，每孔細胞數(shù)約5×105個。當細胞密集度達90%時，用20μL槍尖垂直劃痕，PBS洗去劃掉的細胞，加入無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)，分別于0、6、12、24h顯微鏡下拍照，遷移距離的大小表明細胞遷移能力的強弱。計算公式：遷移距離=（0h時劃痕寬度-24h劃痕寬度）。

1.6 Transwell侵襲及遷移實驗

1.6.1 Transwell侵襲實驗 用100μL Matrigel稀釋液（1：9）包被Transwell小室。取各組對數(shù)生長期的細胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞，100μL（含細胞總數(shù)5×104個）細胞懸液加于上室，下室加含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液600μL，每組重復3孔，培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)24h。取出小室，用棉簽擦去上室內的未侵襲細胞，倒置，風干，用0.1%結晶紫對小室背面發(fā)生侵襲的細胞染色，顯微鏡下取10個視野拍照計數(shù)。

1.6.2 Transwell遷移實驗 遷移實驗與侵襲實驗方法相同,取100μL（含細胞總數(shù)3×104個）細胞懸液加于上室，Transwell小室底部膜的內表面上未鋪Matrigel。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包，所有數(shù)據均采用均數(shù)±標準差（s） 表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗、多組間均數(shù)比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞劃痕試驗 單純荷瘤組、寒凝血瘀荷瘤組、熱毒血瘀荷瘤組移植瘤及肺轉移灶4T1細胞0至24h平均遷移距離如圖1（封三）所示，具體數(shù)據見表1。除單純荷瘤組外,寒凝血瘀荷瘤組、熱毒血瘀荷瘤組肺轉移灶中細胞遷移距離均大于移植瘤中遷移距離，差異有統(tǒng)計學意義（t=-1.618，P＞0.05；t=-10.318，P＜0.05；t=-27.278，P＜0.05）；在移植瘤中，三組證型造模組間遷移距離存在統(tǒng)計學差異（F=12.629，P＜0.05），熱毒血瘀荷瘤組明顯大于其余兩組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），單純荷瘤組與寒凝血瘀荷瘤組之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；在肺轉移灶中,三組證型造模組間存在統(tǒng)計學差異（F=12.640，P＜0.05），寒凝血瘀荷瘤組、熱毒血瘀荷瘤組遷移距離均大于單純荷瘤組（P＜0.05），熱毒血瘀荷瘤組較寒凝血瘀荷瘤組遷移距離有增大趨勢,但兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組細胞平均遷移距離比較（μm，±s）

表1 各組細胞平均遷移距離比較（μm，±s）

注：與移植瘤比較，*P＜0.05；與單純荷瘤組和寒凝血瘀組比較，△P＜0.05；與單純荷瘤組比較，▲P＜0.05

2.2 Transwell遷移試驗 單純荷瘤組、寒凝血瘀荷瘤組、熱毒血瘀荷瘤組移植瘤及肺轉移灶4T1細胞24h穿過小室濾膜的細胞數(shù)如圖2（封三）所示，具體數(shù)據見表2。在同一證型造模組中，肺轉移灶4T1細胞24h穿過小室濾膜的細胞數(shù)均高于移植瘤中4T1細胞穿過數(shù)，差異有統(tǒng)計學意義（t=-2.289，P＜0.05；t=-8.585，P＜0.05；t=-2.573，P＜0.05）；在移植瘤中，三組證型造模組間存在統(tǒng)計學差異（F=21.932，P＜0.05），熱毒血瘀荷瘤組24h穿過小室濾膜細胞數(shù)明顯高于單純荷瘤組與寒凝血瘀荷瘤組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），單純荷瘤組與寒凝血瘀荷瘤組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在肺轉移灶中，三組證型造模組間存在統(tǒng)計學差異（F=7.803，P＜0.05），寒凝血瘀荷瘤組、熱毒血瘀荷瘤組24h穿過小室濾膜細胞數(shù)均高于單純荷瘤組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組平均細胞遷移數(shù)比較（個/視野±s）

表2 各組平均細胞遷移數(shù)比較（個/視野±s）

注：與移植瘤比較，*P＜0.05；與單純荷瘤組和寒凝血瘀組比較，△P＜0.05；與單純荷瘤組比較，▲P＜0.05

2.3 Transwell侵襲試驗 單純荷瘤組、寒凝血瘀荷瘤組、熱毒血瘀荷瘤組移植瘤及肺轉移灶4T1細胞24h穿過小室濾膜的細胞數(shù)如圖3（封三）所示，具體數(shù)據見表3。在同一證型造模組中，肺轉移灶4T1細胞24h穿過小室濾膜的細胞數(shù)均多于移植瘤中4T1細胞穿過數(shù)，差異有統(tǒng)計學意義（t=-3.880，P＜0.05；t=-5.479，P＜0.05；t=-2.183，P＜0.05）；在移植瘤中，三組證型造模組間存在統(tǒng)計學差異（F=6.11，P＜0.05），寒凝血瘀荷瘤組與熱毒血瘀荷瘤組24h穿過小室濾膜細胞數(shù)均多于單純荷瘤組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但該兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在肺轉移灶中，三組證型造模組間細胞侵襲數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義（F=21.932，P＜0.05），寒凝血瘀荷瘤組、熱毒血瘀荷瘤組4T1細胞24h穿過小室濾膜細胞數(shù)大于單純荷瘤組（P＜0.05）。

表3 各組平均細胞侵襲數(shù)比較（個/視野±s）

表3 各組平均細胞侵襲數(shù)比較（個/視野±s）

注：與移植瘤比較，*P＜0.05；與單純荷瘤組比較，▲P＜0.05

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3 討論

寒為陰邪，寒性凝滯、收引?！饵S帝內經》提到，“寒邪博擊，易損肌膚脈絡臟腑”，“寒獨留則血凝泣、凝則脈不通，寒則凝，凝則成瘀?！焙龀Ｒ蛲飧谢騼壬?，寒邪客于血脈，氣機凝滯，血行不暢而致血脈凝滯，脈道瘀塞。熱為陽邪，易傷津耗氣，迫血妄行，灼傷脈絡?！督饏T要略》指出：“熱之所過，其血必凝”。熱毒血瘀常因感受火熱之邪，火熱內熾，劫耗津血，血行壅滯，脈道瘀塞，血熱迫血妄行甚則出血。

有研究[9]發(fā)現(xiàn)，寒凝血瘀證球結膜微循環(huán)改變特點突出表現(xiàn)為血管扭曲、缺血區(qū)、色調暗。熱毒血瘀證球結膜微循環(huán)改變特點可突出表現(xiàn)為網狀畸形、血管增粗、血管壁滲血?，F(xiàn)代醫(yī)學認為寒凝血瘀證的形成是在長期寒冷刺激下，血管收縮，局部血流量減少，微小動脈及毛細血管代償性地擴張收縮，引起血管內皮損傷，血小板活化功能亢進，出現(xiàn)血液高凝狀態(tài)。由于微血管的退行改變，內皮細胞出現(xiàn)水腫、核質凝集、壞死脫落等一系列變化，管徑縮小、管腔閉鎖、毛細血管斷裂、致使毛細血管吸收，形成缺血區(qū)。而熱毒血瘀證由于內毒素直接損傷血管內皮細胞，致血管壁通透性增強，血細胞外滲。并在長期炎癥因素作用下，組織嗜堿細胞顆粒釋放物、膠原纖維的裂解產物及組織胺等都能促進內皮細胞的增殖，致使新生血管連通，微血管數(shù)量增多，從而形成網格結構。

本實驗結果發(fā)現(xiàn)，在各造模組中，肺轉移灶腫瘤細胞侵襲及遷移能力總體強于移植瘤中腫瘤細胞。這可能是由于肺轉移灶中這部分腫瘤細胞是從移植瘤中脫落,在血液循環(huán)中經過篩選，到達肺臟增殖而來。在此過程中，具有較高遷移力與侵襲力的這部分4T1細胞才能到達肺臟進而形成轉移灶，故可見肺轉移灶中4T1細胞遷移侵襲能力強于移植瘤中4T1細胞。

此外我們觀察到，寒凝血瘀荷瘤組中肺轉移灶4T1細胞侵襲能力大幅增強，這也許與寒凝血瘀證中微血管的退行改變有關。寒凝血瘀證中血管量減少，可能一定程度上對腫瘤細胞的侵襲轉移形成阻礙，從而致使侵襲至肺轉移灶的這部分腫瘤細胞具有更強的侵襲能力。而在熱毒血瘀荷瘤組中，我們發(fā)現(xiàn)移植瘤與肺轉移灶腫瘤細胞具有較強的遷移能力。這可能與熱毒血瘀證的形成機制有關。目前普遍認為炎癥反應與熱毒血瘀證關系較為密切。實驗研究[10]也證實熱毒血瘀組中TNF-α明顯高于其他血瘀證亞型。炎癥調節(jié)因子和炎癥細胞涉及惡性細胞的遷移、侵襲和轉移過程。趨化因子受體及其配體通過影響細胞運動性、侵襲力和存活，趨化了炎癥、腫瘤和組織穩(wěn)態(tài)過程中細胞的運動。細胞在轉化時表達趨化因子受體，在趨化因子幫助下移行并存活于原發(fā)腫瘤的遠距離位點。故炎癥調節(jié)因子和炎癥細胞能一定程度上影響腫瘤細胞遷移力[11]。

本實驗研究證實了不同血瘀證候下小鼠移植瘤及肺轉移灶4T1細胞侵襲遷移能力存在差異。在同一證型中，肺轉移灶中4T1細胞較之移植瘤總體具有更強的侵襲遷移力。不同證型間，寒凝血瘀證下肺轉移灶中4T1細胞具有較強侵襲力，熱毒血瘀證下移植瘤及肺轉移灶中4T1細胞具有較強遷移力。該實驗研究結果提示不同血瘀證亞型微環(huán)境對腫瘤細胞的生物學行為存在不同影響，但目前只能說明4T1細胞在該造模方法下會出現(xiàn)如上差異，要更全面地說明問題仍需要更貼合臨床的實驗研究。在血瘀證患者中，其轉移灶腫瘤細胞是否具有更強的侵襲遷移力，不同血瘀證亞型下腫瘤細胞生物學行為是否存在差異，有待更深入研究。

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（收稿：2015-08-11 修回：2015-12-05）

Effect of Different Subtypes of Blood Stasis Syndrome on the Migration and Invasion of 4T1 Cell Line in Mice with Transplanted Tumor and Pulmonary Metastases

LU Chenwen1,GUO Yong2. 1 Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China;2 The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the migration and invasion of 4T1 cell line in Balb/c mice with transplanted tumor and pulmonary metastases with different subtypes of blood stasis syndrome.MethodsNine 8-week-old female Balb/c mice were equally randomized into 3 groups:cancer group,cold coagulation blood stasis-cancer group,heat toxin blood stasis-cancer group.The mice were killed in 43 days after modeling,then the transplanted tumor and tissue specimen from pulmonary metastatic lesion were taken out under aseptic condition.The migration and invasion abilities of 4T1 cells in transplanted tumor and pulmonary metastases in 3 groups were detected with Wound healing assays,Transwell migration,and invasion assays.The data of transplanted tumor and pulmonary metastases in one group were analyzed by t test.The data of the 3 groups in a same tissue origin（transplanted tumor or pulmonary metastases）were analyzed by analysis of variance.ResultsIn cancer group,cold coagulation，blood stasis-cancer group,and heat toxin blood stasis-cancer group,the results of transplanted tumor and pulmonary metastases with the Wound healing assays were as follows:47.5±19.8μm vs 215.8±145.7μm,59.0±8.5μm vs 577.3±70.5μm,118.8±15.2μm vs 663.4±23.8μm;the migration distance was significantly longer in pulmonary metastases than in transplanted tumor in cold coagulation blood stasis-cancer group and heat toxin blood stasiscancer group（P＜0.05）.The results of Transwell migration assay showed significant differences between transplanted tumor and pulmonary metastases in all groups（13.5±8.4/field of vision vs 25.9±12.8/field of vision,17.5±3.8/field of vision vs 49.0±9.7/field of vision,38.5±11.3/field of vision vs 65.8±31.2/field of vision;all P＜0.05）.The results of Transwell invasion assay also showed significant difference in the invasion capability of 4T1 cells between transplanted tumor and pulmonary metastases in all groups（15.8±5.6/field of vision vs 45.1±16.1/field of vision,38.0± 18.1/field of vision vs 129.2±47.6/field of vision,48.6±19.4/field of vision vs 83.5±46.7/field of vision;all P＜0.05）. Significant differences were found in the migration and invasion abilities of 4T1 cells in transplanted tumor and pulmonary metastases among different groups（all P＜0.05）.ConclusionIn the same modeling group,the migration and invasion abilities of 4T1 cells in pulmonary metastases were significantly higher than those in transplanted tumor.The invasion ability of 4T1 cells in pulmonary metastases in cold coagulation blood stasis-cancer group were enhanced,while the migration ability of 4T1 cells both in transplanted tumor and pulmonary metastases in heat toxin blood stasis-cancer group were increased.Different subtypes of blood stasis syndrome have different effects on the migration and invasion of 4T1 cell line in transplanted tumor and pulmonary metastases in mice.

mice;TCM syndrome;blood stasis syndrome;subtypes;transplanted tumor;metastases;migration; invasion

浙江省自然科學基金（No.LY13H290015）；浙江省中醫(yī)藥科學研究基金項目（No.2012ZA049）

1浙江中醫(yī)藥大學（杭州 310006）；2浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科（杭州 310006）

郭勇，Tel：0571-86620316；E-mail：lushen20002000@126.com