丹參酮ⅡA對大鼠肺纖維化細胞TGF-β1/Smads信號通路的影響

邵 笑祝 驥趙峻峰許穎齡張穎穎楊建清盧德趙

丹參酮ⅡA對大鼠肺纖維化細胞TGF-β1/Smads信號通路的影響

邵 笑1祝 驥1趙峻峰1許穎齡2張穎穎2楊建清2盧德趙2

目的觀察丹參酮ⅡA對TGF-β1誘導大鼠肺成纖維細胞TGF-β1/Smads信號通路的影響，探討丹參酮ⅡA干預肺纖維化的機制。方法體外培養(yǎng)大鼠肺成纖維細胞（HFL-1），選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞分為正常組、TGF-β1組及丹參酮ⅡA低（L）、中（M）、高（H）劑量組。除正常組外，余四組予以10ng/mL TGF-β1誘導HFL-1纖維化24h，同時丹參酮ⅡA低、中、高劑量組分別予2μmol/L、5μmol/L和10μmol/L丹參酮ⅡA處理24h，ELISA法測定各組細胞中TGF-β1受體表達，熒光定量PCR法及免疫印跡法檢測Smad2、Smad7表達情況。結果與正常組比較，HLF-1細胞經(jīng)10ng/mL TGF-β1誘導后細胞TGF-β1受體和Smad2表達量增加[（0.19±0.23）比（1.41± 0.12）、（1.00±0.12）比（1.90±0.12），P＜0.01]，Smad7表達量降低[（1.00±0.15）比（0.57±0.09），P＜0.01]；與TGF-β1組比較，10μmol/L丹參酮ⅡA處理后TGF-β1受體和Smad2的表達量均有下降趨勢[（1.90±0.23）比（1.53±0.12），（1.90±0.12）比（1.38±0.06），P＜0.01]，Smad7表達量升高[（0.57±0.08）比（0.74±0.11），P＜0.01]。結論丹參酮ⅡA可以抑制TGF-β1誘導的大鼠肺成纖維細胞增殖和Smad2 及TGF-β1受體表達，增強抑制性信號蛋白Smad7的表達，從而發(fā)揮抑制肺纖維化的作用。

大鼠；肺纖維化；HFL-1；丹參酮ⅡA；轉化生長因子β

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一個復雜的病理過程，包括慢性炎癥反應、成纖維細胞增殖以及異常的膠原沉積所導致的損傷過度修復，至今發(fā)病機制不明，且沒有理想的治療方法[1-3]。目前認為轉化生長因子β（transforming growth factor beta1，TGF-β1）是導致纖維化的關鍵性細胞因子，其介導的Smad通路是纖維化發(fā)生的可能機制之一[4]。Smad家族中的Smad2是TGF-β/Smads信號通路活化蛋白，而其正常表達與肺纖維化的形成直接相關[5]，而Smad7是其抑制性信號。丹參是常見的活血化瘀中藥，丹參酮ⅡA是其最主要的有效成分之一。近年許多研究[6-7]表明，丹參酮ⅡA具有抗纖維化作用，但其具體機制尚未明確。本研究旨在觀察丹參酮ⅡA對TGF-β1誘導的大鼠肺成纖維細胞TGF-β1/Smads信號通路的影響，闡明丹參酮ⅡA干預肺成纖維細胞纖維化的機制。

1 材料與方法

1.1 材 料 HFL-1細胞株購于中國科學院上海細胞庫；丹參酮ⅡA（批號14031278）購于安徽甙爾塔公司；RPMI1640培養(yǎng)基（批號14051103）、胎牛血清（批號1414876）購自杭州四季青生物工程材料研究所；氯化鎘（批號10005416）購于國藥集團化學試劑有限公司；Smad2（批號3103S）、Smad7（批號YHN0211061）、actin（批號0017150S）一抗均購于SANTA CRUZ公司。Elisa試劑盒（批號E12010503）購于上海ELISA生物科技有限公司。蛋白濃度測定試劑盒（批號00071501）購于康為世紀有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及細胞增殖活力檢測 HLF-1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，每2～3天傳代1次，將生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞以1×104個/孔濃度傳代培養(yǎng)于96孔板中，并加入不同劑量的丹參酮ⅡA，使其終濃度為0、2、4、6、7、8、10、12、16μmol/L，每個濃度設6個重復，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，利用MTT法在波長490nm處檢測各組樣品吸光度值（A490）。

1.3 細胞分組處理 選取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細胞5瓶，分為五組，正常組：HFL-1細胞正常境況24h；TGF-β1組：10ng/mL TGF-β1處理HFL-1細胞24h；丹參酮ⅡA（L）：10ng/mL TGF-β1+2μmol/L丹參酮ⅡA處理細胞24h；丹參酮ⅡA（M）：10ng/mL TGF-β1+5μmol/L丹參酮ⅡA處理細胞24h；丹參酮ⅡA（H）：10ng/mL TGF-β1+10μmol/L丹參酮ⅡA處理細胞24h，提取細胞總RNA及總蛋白質，定量后置于-20℃保存。

1.4 Elisa檢測TGF-β1受體表達 用Elisa試劑盒，將標準品、待測樣品各50μL于反應孔立即加入50μL的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45min。清洗4次，每孔加入100μL的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30 min。清洗4次后，每孔加入底物A、B各50μL，輕輕振蕩混勻，37℃避光溫育5min，迅速加入50μL終止液，在450nm波長處測定各孔的OD值。

1.5 熒光定量PCR法檢測Smad2、Smad7 mRNA表達 細胞孵育后，收集各實驗組細胞，按TRIZOL試劑盒說明書提取細胞總RNA并將總RNA逆轉錄合成cDNA。取產(chǎn)物以β-actin為內參照進行定量PCR擴增。Actin引物：上游5-CCGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3，下游：5-CGGACTCATCGTACTCCTGCT-3，擴增產(chǎn)物長度為230bp；Smad2引物：上游5-TTTGCGGAATAATCGTGT-3，下游5-AAGGTGCTTTAATTGATGAGAC-3，PCR擴增產(chǎn)物長度為414bp；Smad7引物序列：上游：5-TTTTGAGGTGTGGTGGGT-3，下游：5-GAGGCAGTAAGACAGGGATGA-3，擴增產(chǎn)物長度為478bp。反應結束后進行軟件分析。

1.6 Western blot檢測Smad2、Smad7蛋白質表達蛋白質樣品先用8%SDS-PAGE凝膠進行分離，后用濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上，再將膜進行封閉，β-actin（1:600）兔抗鼠的一抗孵育，1:1000羊抗兔的二抗孵育、Smad7（1：250）、Smad2（1:600）鼠抗人的一抗孵育，1：1000兔抗鼠的二抗孵育及ECL顯色。

2 結果

2.1 丹參酮ⅡA對HFL-1細胞增殖活力的影響MTT法檢測丹參酮ⅡA對HLF-1細胞增殖活力的影響，≤10μmol/L丹參酮ⅡA對細胞增殖活力沒有顯著影響（P＞0.05），12μmol/L丹參酮ⅡA可以顯著抑制HLF-1細胞的增殖（P＜0.01）。見表1。

2.2 丹參酮ⅡA對TGF-β1誘導的HFL-1細胞TGF-β1受體表達的影響 與正常級比較，10ng/mL TGF-β1處理HFL-1細胞后，TGF-β1受體表達量顯著增加（P＜0.05），10μmol/L丹參酮ⅡA能明顯降低TGF-β1受體的表達，并有一定的量效關系，見表2。

2.3 丹參酮ⅡA對TGF-β1誘導的HFL-1細胞Smad2和Smad7 mRNA表達的影響 與正常組比較，TGF-β1誘導HFL-1細胞24h后，細胞中Smad2 mRNA增加，而Smad7 mRNA含量顯著減少。經(jīng)5、10μmol/L丹參酮ⅡA處理后，Smad2 mRNA含量降低，而Smad7 mRNA含量相對增加，見表3。

表1 丹參酮ⅡA對HFL-1細胞增殖活力的影響（±s）

表1 丹參酮ⅡA對HFL-1細胞增殖活力的影響（±s）

注：與丹參酮ⅡA零濃度比較，**P＜0.01；HFL-1細胞：大鼠肺成纖維細胞

丹參酮ⅡA濃度（μmol/L） 孔數(shù)0 2 4 6 8 1 0 12 16 6 6 6 6 6 6 6 6細胞相對增殖情況（OD490）0.34±0.012 0.35±0.023 0.36±0.017 0.39±0.015 0.37±0.009 0.36±0.021 0.26±0.022** 0.22±0.015**

表2 四組大鼠HFL-1細胞TGF-β1誘導后TGF-β1受體表達比較（±s）

表2 四組大鼠HFL-1細胞TGF-β1誘導后TGF-β1受體表達比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與TGF-β1組比較，△△P＜0.01；HFL-1細胞：大鼠肺成纖維細胞；TGF-β1：轉化生長因子

組別正常組TGF-β1組丹參酮ⅡA（L）丹參酮ⅡA（M）丹參酮ⅡA（H）孔數(shù)3 3 3 3 3 TGF-β1受體相對表達量（OD450）1.41±0.12 1.90±0.23** 1.83±0.09** 1.77±0.18** 1.53±0.12*△△

表3 四組大鼠HFL-1細胞TGF-β1誘導后HFL-1細胞Smad2和Smad7 mRNA表達比較（±s）

表3 四組大鼠HFL-1細胞TGF-β1誘導后HFL-1細胞Smad2和Smad7 mRNA表達比較（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與TGF-β1組比較，△△P＜0.01；HFL-1細胞：大鼠肺成纖維細胞；TGF-β1：轉化生長因子

組別正常組TGF-β1組丹參酮ⅡA（L）丹參酮ⅡA（M）丹參酮ⅡA（H）孔數(shù)3 3 3 3 3 Smad2 mRNA相對表達水平1.00±0.12 1.90±0.12** 1.82±0.25** 1.60±0.19** 1.38±0.06**△△Smad7 mRNA相對表達水平1.00±0.15 0.57±0.09** 0.60±0.06** 0.67±0.07** 0.74±0.11**

2.4 丹參酮ⅡA對TGF-β1誘導的HFL-1細胞Smad2和Smad7蛋白質表達的影響 TGF-β1誘導HFL-1細胞24h后，細胞中Smad2蛋白質表達增加，Smad7蛋白質表達下降。丹參酮ⅡA可以下調Smad2蛋白質表達，提高Smad7蛋白質表達，見圖1。

圖1 丹參酮ⅡA對TGF-β1誘導的HFL-1細胞Smad2和Smad7蛋白質表達的影響

3 討論

肺纖維化是一種原因不明、以彌漫性肺泡炎癥和肺泡結構紊亂最終導致肺間質纖維化為特征的疾病[8]。轉化生長因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）被公認為纖維化形成與發(fā)展的啟動樞紐，是關鍵性細胞因子，能啟動成纖維細胞的增殖分裂，導致膠原蛋白的大量合成，最終形成肺間質的膠原沉積等纖維化的組織病理學改變。TGF-β1發(fā)揮生物學調節(jié)功能依賴于其在細胞膜表面的特異性受體，Smad家族蛋白介導了TGF-β1對基因表達的調控。TGF-β1首先與相應的TβRⅡ相結合，再連接TβRⅠ共同形成復合物。接著磷酸化激活R-Smads某一成員，該成員再和Co-Smads結合形成復合物轉入核內調節(jié)下游基因的轉錄。Smad蛋白有8種，分為3個亞型：（1）膜受體激活型Smad（R-Smads），主要包括Smad2、Smad3。（2）共同通路型Smad（Co-Smads），主要是Smad4，可同R-Smads結合，是TGF-β1信號傳導必需的中轉分子。（3）抑制性Smad（I-Smads），包括Smad6，Smad7?？膳cR-Smads競爭TGF-β1受體，對信號傳遞起負調控作用。Smad2、Smad3是纖維化疾病的重要介導者，大量事實表明，TGF-β1介導的細胞外基質（ECM）的表達上升是Smads依賴性的過程[9-10]。Smad7為TGF-β/Smad信號通路的抑制分子，可與R-Smads競爭性結合受體，阻止R-Smads磷酸化而阻斷TGF-β的信號傳遞。因此，調控TGF-β/Smad通路各分子的表達成為肺纖維化治療的一種新途徑[11]。

丹參酮ⅡA（Tanshinone IIA）是從丹參中提取出的脂溶性成分之一，是近年來國內外學者對中藥單體中研究較多的活性成分，其在丹參酮中含量最高，也是最為穩(wěn)定的有效活性成分，其具有明確的分子結構。已有實驗證實[12-13]，丹參酮ⅡA不僅具有清除氧自由基和抗炎的作用，還具有抗腫瘤等多種藥學活性。同時，丹參酮ⅡA磺酸鈉對急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷具有保護作用[14]。然而，目前關于丹參酮ⅡA如何作用于肺間質纖維化，其相關的具體生物學機制尚不十分清楚。

我們采用TGF-β1誘導大鼠肺成纖維細胞纖維化，正常組HLF-1細胞梭形或扁的星狀，胞質透明，胞核較大，可見核仁。經(jīng)TGF-β1誘導后細胞伸出多個突起，并連接成網(wǎng)狀，細胞密集成放射狀分布。Elisa檢測顯示TGF-β1受體濃度上升，定量PCR和免疫印跡法檢測顯示丹參酮ⅡA可以降低Smad2表達，并提高Smad7的表達量。

綜上所述，TGF-β1可以上調TGF-β1受體和Smad2表達，并下調Smad7，促進肺纖維化；丹參酮ⅡA可能通過調節(jié)TGF-β1/Smads信號傳導通路，緩解成纖維細胞的纖維化，從而起到防治肺纖維化作用。

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（收稿：2015-08-20 修回：2015-11-19）

Effect of TanshinoneⅡA on TGF-β1/Smads Signaling Pathway in Pulmonary Fibrosis Cellsof Rats

SHAO Xiao1,ZHU Ji1,ZHAO Junfeng1,XU Yingling2,ZHANG Yingying2,YANG Jianqing2,LU Dezhao2. 1 Clinical Laboratory,Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310005),China;2 College of Life Science,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

ObjectiveTo investigate the protection effect of tanshinoneⅡA on transform growth factor（TGF）-β1/Smads pathway in pulmonary fibrosis cells of rats.MethodsHLF-1 cells were cultivated in vitro and induced to pulmonary fibrosis cells with 10ng/mL TGF-β1,then the cells were treated with 2μmol/L,5μmol/L and 10μmol/ L tanshinoneⅡA,respectively,for 24h.The method of Elisa was used to measure the expression of TGF-β1 receptors.The expression of Smad 2 and Smad 7 was determined with the method of fluorogenic quantitative PCR and Western Blotting.Results10ng/mL TGF-β1increased the expression of TGF-β1 receptors（1.41±0.12 vs 0.19± 0.23）and Smad 2（1.90±0.12 vs 1.00±0.12）,and decreased the expression of Smad 7（0.57±0.09 vs 1.00±0.15）in the HLF-1 cells（all P＜0.05）.When the cells were treated withtanshinoneⅡA,TGF-β1 receptors（1.53±0.12）and Smad 2（1.38±0.06）expressed with a downward trend while the expression of Smad 7（0.74±0.11）was increased （all P＜0.05）.ConclusionTGF-β1 can promote pulmonary fibrosis through upregulating the expression of TGF-β1 receptors and Smad 2 and downregulatingthe expression of Smad 7.TanshinoneⅡA can regulate the TGF-β1/ Smads signaling pathway,which plays a preventive role in pulmonary fibrosis.

Rats;Pulmonary fibrosis;HFL-1;TanshinoneⅡA;Transform growth factor β

國家自然科學基金項目（No.81102841，81403133）；浙江省自然科學基金項目（No.LY13H270005，No.LQ14H280004）；中國博士后科學基金（No.2013M541800）

1浙江中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院檢驗科（杭州 310005）；2浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院（杭州 310053）

盧德趙，Tel：13588769151；E-mail：ludezhao@126.com