環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在病原微生物檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

林茂銳，楊華文 綜述 曹東林 審校

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環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在病原微生物檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

林茂銳，楊華文 綜述 曹東林 審校

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）是一項(xiàng)新的核酸快速擴(kuò)增技術(shù)，具有特異性高、速度快、操作簡單等特點(diǎn)，非常適用于現(xiàn)場檢測和基層檢測，在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中將起重要的作用。筆者簡要概述了LAMP技術(shù)在病原微生物檢測中的應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；病原微生物

近年來，新發(fā)傳染病如寨卡病毒病、中東呼吸綜合征、傳染性非典型肺炎、登革熱等頻頻暴發(fā)，這些新發(fā)疾病既對我國傳染病的防控提出了更高要求，也警示我國傳染病的防控、診治依然是公共衛(wèi)生問題的重要挑戰(zhàn)之一。建立和發(fā)展重大傳染病病原體快速、早期的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)平臺并標(biāo)準(zhǔn)化，能及早明確傳染病病原體的類別及流行病學(xué)數(shù)據(jù)，為傳染病的預(yù)警、及時(shí)高效的防控及采取恰當(dāng)?shù)膽?yīng)急方案提供理論依據(jù)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 （loop-mediated isothermal amplification， LAMP）技術(shù)是由日本科學(xué)家Notomi等［1］新開發(fā)的一種核酸等溫?cái)U(kuò)增方法。世界各國的微生物科研工作者運(yùn)用LAMP技術(shù)及其衍生技術(shù)在臨床細(xì)菌、病毒、寄生蟲的快速檢測，食物中毒致病菌，動(dòng)植物檢疫、環(huán)境及畜牧業(yè)等病原體的檢測方面已取得重大進(jìn)展，隨著其技術(shù)體系的完善并與其他核酸擴(kuò)增技術(shù)的交叉互補(bǔ)，可以預(yù)見該技術(shù)在傳染性疾病的初篩中將發(fā)揮極大作用。筆者簡要概述了LAMP技術(shù)在病原微生物檢測中的應(yīng)用。

1 LAMP簡介

1.1 技術(shù)原理 利用Bst脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid， DNA）聚合酶和根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)兩對（四條）特殊的內(nèi)、外引物，特異性識別靶序列上的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，在等溫條件（60～65 ℃）啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)保溫30～60 min，可擴(kuò)增出超過109拷貝的靶序列，同時(shí)產(chǎn)生肉眼可見的白色沉淀（焦磷酸鎂）。反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，內(nèi)引物與目標(biāo)DNA雜交后，啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，產(chǎn)生啞鈴狀DNA。隨后以自身為模板，進(jìn)行DNA合成延伸，形成莖-環(huán)DNA結(jié)構(gòu)，此為LAMP循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。由于內(nèi)引物雜交在莖-環(huán)的環(huán)上，引物鏈置換合成DNA產(chǎn)生一個(gè)有缺口的莖-環(huán)DNA中間媒介，在莖上附有目標(biāo)序列。然后，再通過外引物，在莖的末端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始，從而形成有多環(huán)的、花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物，達(dá)到靶序列擴(kuò)增的目的［1］。

1.2 技術(shù)優(yōu)勢 LAMP 技術(shù)是類似于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction， PCR）的一種核酸快速高效擴(kuò)增方法，其優(yōu)勢主要有：（1）擴(kuò)增溫度恒定，無需變性DNA 雙鏈；（2）高特異性，針對靶基因片段的6個(gè)區(qū)域，設(shè)計(jì)4條引物，事先需明確這6個(gè)區(qū)域的順序；（3）靈敏度高，擴(kuò)增DNA模板只需10個(gè)拷貝或更少，檢測線性范圍達(dá)5個(gè)數(shù)量級；（4）快速、高效擴(kuò)增，目的DNA擴(kuò)增時(shí)間為30～40 min，若在引物上再進(jìn)一步改進(jìn)，可大大提高其擴(kuò)增效率，甚至可在20 min內(nèi)完成，而且擴(kuò)增DNA產(chǎn)率很高，肉眼即可觀察到白色沉淀；（5）操作簡便，一種方法為肉眼或添加熒光染料觀察，另一種方法利用濁度儀檢測擴(kuò)增產(chǎn)物濁度；（6）成本低廉，無需特殊的培訓(xùn)和設(shè)備，只需一個(gè)水浴鍋即可，適合大規(guī)模篩檢和基層衛(wèi)生醫(yī)療機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)［2］。

2 LAMP在病原微生物快速檢測中的運(yùn)用

2.1 病毒檢測 Nyan等［3］利用LAMP方法檢測臨床血清樣本中乙肝病毒的基因亞型A-F，模板DNA采用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒提取或直接將血清加熱后用于擴(kuò)增，并與乙肝病毒標(biāo)準(zhǔn)血清盤比較，LAMP法最低檢測限可達(dá)10 U，特異性100%，適用于臨床標(biāo)本檢測。Poon等［4］設(shè)計(jì)特異性引物、建立環(huán)介導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（reversetranscription loop-mediated isothermal amplification， RTLAMP），臨床樣本檢出率為64%，其較實(shí)時(shí)定量PCR靈敏度稍低，但高于常規(guī)PCR方法，成本較低，顯示具有在發(fā)展中國家或床邊檢測潛力。Rudolph等［5］首次證明采用RT-LAMP方法可快速檢出急性人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus， HIV）感染，具體方法是針對HIV-1 HXB2基因片段設(shè)計(jì)引物，采用RT-LAMP技術(shù)對HIV感染細(xì)胞株和病例血清進(jìn)行檢測，并與抗體快速檢測及通過美國食品藥品管理局認(rèn)證的其他免疫學(xué)方法比較，在更早的感染階段（早于2周）即可檢測出，還建議向即時(shí)檢驗(yàn)方向發(fā)展，對于急性HIV感染的檢出和感染隨時(shí)監(jiān)控具有重要意義。而Ocwieja等［6］運(yùn)用生物信息學(xué)的方法針對HIV多種亞型（A、B、C、D、G）設(shè)計(jì)了一系列引物并篩選出最佳引物后，建立了RT-LAMP的方法，為后續(xù)建立即時(shí)檢驗(yàn)方法打下了良好基礎(chǔ)。一種新的禽流感病毒于2013年在中國暴發(fā)后，Bao等［7］通過RT-LAMP技術(shù)建立了快速診斷方法，能有效從不同樣本來源（雞、鴿子、人及環(huán)境）擴(kuò)增出目的基因，其最低檢測限可達(dá)到0.01 pfu，是RT-PCR法的10倍，也具有良好特異性，約30 min即可完成實(shí)驗(yàn)，并在臨床標(biāo)本中得到很好驗(yàn)證。之后，Luo等［8］采用類似的RT-LAMP法建立快速檢測禽流感病毒，均顯示良好的有效性和快速性。Kaneko等［9］利用LAMP技術(shù)檢測單純皰疹病毒HSV-1、HSV-2及水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus，VZV），其敏感性10倍于PCR方法。此外，LAMP技術(shù)在檢測登革病毒［10］、EV71手足口病毒［11］、中東呼吸綜合征冠狀病毒［12］、星狀病毒［13］等方面均有報(bào)道，無論是DNA還是核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）病毒，LAMP均能快速檢測，尤其是在檢測RNA病毒時(shí)，省去了RT-PCR法中費(fèi)時(shí)的反轉(zhuǎn)錄步驟，減少了交叉污染的機(jī)會(huì)，更加快捷方便。

2.2 細(xì)菌檢測 Maruyama等［14］最先應(yīng)用LAMP技術(shù)檢測大腸桿菌O157：H7細(xì)胞中的stxA2基因，建立了原位LAMP（In Situ LAMP），與原位PCR比較，其擴(kuò)增溫度更低，細(xì)胞損傷更小，擴(kuò)增后的圖像也更清晰。曹東林等［15］建立了實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測結(jié)核分枝桿菌的方法，此擴(kuò)增法對結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測的敏感性和特異性均為100%，最低檢測限可達(dá)102個(gè)菌/ml；檢測的敏感性為94.64%，特異性為96.55%，與定量PCR相比，其特異性相似，但敏感性更高。Li等［16］以具有呼吸病臨床癥狀患者的痰液為研究對象，證明了Rv2461c基因是LAMP方法檢測結(jié)核分枝桿菌的一個(gè)非常有效而明確的核酸擴(kuò)增測試靶標(biāo)，具有很高的敏感性和特異度。另外，Ou等［17］及Joon等［18］分別就肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者標(biāo)本建立LAMP檢測方法，以期能快速、早期診斷結(jié)核桿菌的感染。朱水榮等［19］針對嗜肺軍團(tuán)菌mip基因設(shè)計(jì)5條引物，對血清型嗜肺軍團(tuán)菌和非嗜肺軍團(tuán)菌及其他細(xì)菌進(jìn)行檢測，結(jié)果證明LAMP方法的檢出率高于傳統(tǒng)培養(yǎng)分離方法及定量PCR，適合基層檢驗(yàn)部門及小型實(shí)驗(yàn)室與現(xiàn)場監(jiān)測等使用。Felsenstein等［20］針對兒童常見鏈球菌感染致咽炎，建立LAMP檢測方法，與特異抗原檢測及常規(guī)培養(yǎng)比較，具有更高的敏感性和特異性。此外，目前LAMP還成功用于志賀菌、碳青霉烯類抗生素耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌、大腸桿菌等細(xì)菌類病原微生物［21-23］，以上細(xì)菌研究結(jié)果均表明，與定量PCR比較，LAMP技術(shù)擴(kuò)增速度更快、敏感性和特異性也很高。

2.3 寄生蟲檢測 Cook等［24］在對無臨床癥狀的瘧原蟲感染者，通過LAMP法進(jìn)行大規(guī)模的篩選，并與膠體金快檢法、定量PCR法比較，證明了LAMP法和PCR法均具有較高的陽性檢出率，但是LAMP法更快捷，儀器要求更低。楊秋林等［25］利用LAMP法擴(kuò)增日本血吸蟲尾蚴DNA，以華支睪吸蟲為陰性對照，建立方便快捷的檢測方法。Matovu等［26］分別采用LAMP和PCR方法對患者血液標(biāo)本中的錐蟲進(jìn)行檢測，結(jié)果表明PCR法用時(shí)約長于LAMP法5倍。另外，F(xiàn)allahi等［27］對剛地弓形蟲RE和B1基因分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增和巢式PCR，結(jié)果兩種方法特異性都很高，近乎100%，但前者的敏感性更高。Ocker等［28］對150例連續(xù)性瘧疾患者標(biāo)本分別采用LAMP法、顯微鏡觀察法、巢式PCR法檢測，結(jié)果顯示LAMP法的敏感性和特異性與巢式PCR法高度一致。此外，LAMP還可用于真菌的檢測，如白色念珠菌及支原體的檢測［29，30］。

3 拓 展

3.1 擴(kuò)增模板的拓展 針對細(xì)菌檢測，LAMP主要檢測其相應(yīng)特異、保守的基因（DNA片段），而一些RNA病毒則需在反應(yīng)體系中增加反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)，但一般為避免交叉污染，反轉(zhuǎn)錄與LAMP反應(yīng)在同一體系中進(jìn)行并最終形成RT-LAMP法［31］。對于病原體標(biāo)本，LAMP法對模板要求不高，無需對樣本的核酸提取純化。部分廠家為了應(yīng)對快速檢測的要求，甚至對一些標(biāo)本采用一次性注射器加入核酸提取試劑，不進(jìn)行復(fù)雜提取過程即可行LAMP擴(kuò)增，在應(yīng)用中更快速、簡便，減少交叉污染的機(jī)會(huì)。

3.2 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法的變化 對于LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測目前主要有4種方法：（1）經(jīng)瓊脂糖電泳，溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色觀察梯度條帶。LAMP反應(yīng)中的產(chǎn)物是一系列具有不同長度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA混合物，用凝膠電泳分析時(shí)會(huì)產(chǎn)生特異的梯狀條帶。（2）肉眼觀察。在產(chǎn)物中加入SYBR Green I染料，呈現(xiàn)綠色即說明有目的擴(kuò)增產(chǎn)物，這為現(xiàn)場病原體快速初篩提供了思路和可能。（3）通過對LAMP擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀形成的渾濁程度進(jìn)行判斷。目前，已有公司成功開發(fā)出一種實(shí)時(shí)濁度檢測儀，對靶序列可進(jìn)行定量分析。（4）在LAMP擴(kuò)增過程中加入染料，通過儀器實(shí)時(shí)觀察顏色的變化而對靶序列進(jìn)行定量分析。

3.3 與其他分子生物學(xué)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用 LAMP技術(shù)可聯(lián)合其他分子生物學(xué)技術(shù)。2013年，Wang等［32］應(yīng)用原位LAMP，用于檢測食物樣本中的食源性副溶血性弧菌，與常規(guī)LAMP、PCR法進(jìn)行了比較，結(jié)果證明原位LAMP是一種高敏感、高特異的檢測方法。而Lang等［33］以Her-2/neu （c-erbB2）基因?yàn)榘袠?biāo)，通過LAMP進(jìn)行基因擴(kuò)增后利用熒光原位雜交的方法來檢測乳腺癌的早期診斷，成本低廉。Hsieh等［34］采用一步法在現(xiàn)場利用微流控裝置與LAMP技術(shù)結(jié)合進(jìn)行沙門氏菌DNA的擴(kuò)增，擴(kuò)增過程實(shí)時(shí)監(jiān)控，擴(kuò)增時(shí)間少于1 h，建立了一種快速、敏感、定量的病原體DNA擴(kuò)增方法。

目前，LAMP技術(shù)的研究重點(diǎn)是如何篩選特異性高的擴(kuò)增引物，以及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測的簡便性、實(shí)時(shí)監(jiān)控、準(zhǔn)確性和反應(yīng)速度。而標(biāo)本核酸提取便捷性亦是科研工作者著力想解決的一個(gè)問題。LAMP技術(shù)具有操作簡單、高特異性、高擴(kuò)增效率、目的DNA判斷簡易、無需昂貴的儀器和試劑等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于即時(shí)檢驗(yàn)初篩及現(xiàn)場的快速應(yīng)急檢測，是核酸研究領(lǐng)域的重要技術(shù)手段，在病原微生物的應(yīng)急檢測中必將發(fā)揮越來越大的作用。

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（2016-06-14 收稿 2016-09-08 修回）

（責(zé)任編輯 潘奕婷）

Progress on the application of loop-mediated isothermal amplification in detection of pathogenic microorganism

LIN Maorui， YANG Huawen， and CAO
Donglin. Department of Clinical Laboratory， The Second People's Hospital of Guangdong Province， Guangzhou 510317， China

CAO Donglin， E-mail： caodl@126.com

Loop-mediated isothermal amplification （LAMP） technology is a new nucleic acid isothermal amplification technology developed in recent years. Because of its high specificity， rapidity， and simplicity， it is very suitable for field detection and basic level detection and play an important role in public health emergencies. In this paper， the application of LAMP technology in detection of pathogenic microorganisms are briefly summarized.

loop-mediated isothermal amplification； pathogenic microorganism

R44

10.13919/j.issn.2095-6274.2016.10.014

2013年度廣東省級財(cái)政技術(shù)研究開發(fā)與推廣應(yīng)用專項(xiàng)資金項(xiàng)目（粵財(cái)工［2013］401號）

林茂銳，本科學(xué)歷，主管技師，E-mail： 269160833@qq.com

510317 廣州，廣東省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

曹東林，E-mail： caodl@126.com