c-Met激酶抑制劑LY28對(duì)PC-3、NCI-H441、MDA-MB-231細(xì)胞和PC-3移植瘤的抑制作用

王瑩，井維娜，程捷，任剛，王敬章，劉玉剛

(1河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北邯鄲056002；2河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院)

c-Met激酶抑制劑LY28對(duì)PC-3、NCI-H441、MDA-MB-231細(xì)胞和PC-3移植瘤的抑制作用

王瑩1，井維娜2，程捷2，任剛2，王敬章1，劉玉剛2

(1河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河北邯鄲056002；2河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的 觀察肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(c-Met)酪氨酸激酶抑制劑LY28的抗腫瘤作用，并探討其機(jī)制。方法 ①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人前列腺癌PC-3細(xì)胞、人肺癌NCI-H441細(xì)胞及人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后分為1個(gè)對(duì)照組和14個(gè)實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組用0.04% DMSO的培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組分別用0.1、1、10、20、40、80、100 μmol/L的LY28、克唑替尼培養(yǎng)，每組3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中孵育72 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入0.5 mg/mL的MTT溶液100 μL。培養(yǎng)箱中孵育4 h，在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔光密度(OD)值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，采用Graphpad Prism5軟件計(jì)算LY28、克唑替尼抑制腫瘤細(xì)胞增殖的IC50值。② 制作PC-3細(xì)胞移植瘤裸鼠模型。挑選模型裸鼠40只，隨機(jī)分為模型組和給藥組(包括LY28 10 mg/kg組、LY28 20 mg/kg組、LY28 40 mg/kg組及克唑替尼組)，每組8只。給藥組分組當(dāng)天即開(kāi)始每天單次灌胃給予10 mg/kg的LY28、20 mg/kg的LY28、40 mg/kg的LY28、40 mg/kg的克唑替尼，周期21 d。模型組給予等量生理鹽水。末次給藥結(jié)束后處死裸鼠，剝離腫瘤組織。稱瘤重并計(jì)算抑瘤率。采用Western blotting法檢測(cè)腫瘤組織中的Met、p-Met、Akt、p-Akt、ERK1/2及p- ERK1/2。結(jié)果 LY28對(duì)PC-3、MDA-MB-231、NCI-H441細(xì)胞的IC50分別為(10.154±1.209)、(18.946±2.457)、(29.868±3.493)μmol/L，克唑替尼對(duì)PC-3、MDA-MB-231、NCI-H441細(xì)胞的IC50分別為(19.105±2.970)、(39.818±5.694)、(34.982±4.977)μmol/L。LY28對(duì)PC-3、MDA-MB-231、NCI-H441細(xì)胞的IC50均低于克唑替尼(P均<0.05)。LY28 10 mg/kg組、LY28 20 mg/kg組、LY28 40 mg/kg組、克唑替尼組抑瘤率分別為38.38%、67.17%、80.30%、77.27%。與模型組比較，LY28 10 mg/kg組、LY28 20 mg/kg組、LY28 40 mg/kg組及克唑替尼組p-MET及其下游信號(hào)p-Akt、p-ERK1/2水平降低(P均<0.05)，且LY28 40 mg/kg組

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑；克唑替尼；前列腺癌；肺癌；乳腺癌；半數(shù)抑制濃度；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體；蛋白激酶B；細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(c-Met)是原癌基因c-Met編碼的蛋白，屬于肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)特異性細(xì)胞膜受體[1]。生理情況下，HGF/c-Met信號(hào)通路在胚胎器官發(fā)育形成及肝臟等器官的再生和損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[2,3]。當(dāng)HGF/c-Met信號(hào)通路異常激活時(shí)，可導(dǎo)致c-Met的持續(xù)激活與磷酸化，從而持續(xù)激活下游信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖，誘導(dǎo)正常細(xì)胞發(fā)生癌變[4～6]。針對(duì)c-Met信號(hào)通路的藥物主要包括單克隆抗體和小分子激酶抑制劑。目前已有2個(gè)以c-Met為靶點(diǎn)的小分子靶向藥物克唑替尼和卡博替尼上市?？诉蛱婺崾且环NATP競(jìng)爭(zhēng)性c-Met及間變性淋巴瘤激酶(ALK)雙重抑制劑，用于治療ALK陽(yáng)性的局部晚期或轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌[7,8]。邯鄲市隆仁堂醫(yī)藥研究院以克唑替尼為母核進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，設(shè)計(jì)合成出c-Met酪氨酸激酶抑制劑LY28。前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，LY28在體外對(duì)c-Met激酶的IC50值為7 nmol/L，對(duì)人胃癌MKN-45、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG、人腎癌Caki-1、人前列腺癌PC-3細(xì)胞株的增殖及人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG裸鼠移植瘤均具有顯著抑制作用。本研究比較了LY28、克唑替尼對(duì)體外培養(yǎng)的人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、人肺癌細(xì)胞株NCI-H441增殖的影響，比較了不同濃度LY28灌胃的荷前列腺癌PC-3細(xì)胞移植瘤裸鼠的抑瘤率及腫瘤組織Met、磷酸化Met(p-Met)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表達(dá)，旨在觀察LY28的體內(nèi)外抗腫瘤作用并探討其機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞及主要材料 BALB/c裸鼠(SPF級(jí))購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)；人肺癌細(xì)胞株NCI-H441購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)。LY28和陽(yáng)性對(duì)照藥克唑替尼均由邯鄲市隆仁堂醫(yī)藥有限公司提供。F12K培養(yǎng)基、L15培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清及胰蛋白酶均為Gibco公司產(chǎn)品。Met、p-Met、Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2、β-actin抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自碧云天公司。

1.2 不同濃度LY28、克唑替尼對(duì)PC-3、MDA-MB-231、NCI-H441細(xì)胞的增殖抑制率測(cè)算 PC-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基中，MDA-MB-231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的L15培養(yǎng)基中，NCI-H441細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。各細(xì)胞株均置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每3～4 d以1∶4傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后配成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至3×104/mL接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后分為1個(gè)對(duì)照組和14個(gè)實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組用0.04% DMSO的培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組分別用0.1、1、10、20、40、80、100 μmol/L的LY28、克唑替尼培養(yǎng)，每組3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中孵育72 h后棄培養(yǎng)基，每孔加入0.5 mg/mL的MTT溶液100 μL。培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄去溶液，每孔加入200 μL的DMSO溶解甲臜，微量振蕩器振蕩使結(jié)晶完全溶解，在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔光密度(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。采用Graphpad Prism5軟件計(jì)算LY28抑制腫瘤細(xì)胞增殖的IC50值。

1.3 不同濃度LY28灌胃的荷前列腺癌PC-3細(xì)胞移植瘤裸鼠抑瘤率測(cè)算及腫瘤組織Met、p-Met、Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)檢測(cè) 在50只6周齡裸鼠于皮下接種PC-3細(xì)胞，每只接種5×106個(gè)細(xì)胞。接種后10 d左右采用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤體積。腫瘤體積(V)=1/2×長(zhǎng)×寬2。挑選腫瘤體積在100～200 mm3的裸鼠40只，隨機(jī)分為模型組和給藥組(包括LY28 10 mg/kg組、LY28 20 mg/kg組、LY28 40 mg/kg組及克唑替尼組)，每組8只。給藥組分組當(dāng)天即開(kāi)始每天單次灌胃給予10 mg/kg的LY28、20 mg/kg的LY28、40 mg/kg的LY28、40 mg/kg的克唑替尼，給藥體積為0.1 mL/10 g，周期21 d。模型組給予等量生理鹽水。每3 d稱體重并測(cè)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。末次給藥結(jié)束后處死裸鼠，剝離腫瘤組織。①稱瘤重并計(jì)算抑瘤率。抑瘤率(%)=(1-給藥組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%。②采用Western blotting法檢測(cè)腫瘤組織中的Met、p-Met、Akt、p-Akt、ERK1/2及p- ERK1/2。腫瘤組織剪碎置于液氮中研磨，研磨后的粉末加入蛋白裂解液提取總蛋白，蛋白定量，沸水變性后分裝，-80 ℃保存。10%SDS-PAGE膠電泳，電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，時(shí)間60 min。用含5%脫脂奶粉的TBST在室溫下封閉1 h。一抗4 ℃孵育過(guò)夜(稀釋比例為1∶1 000)。TBST漂洗3次，10 min /次。二抗室溫孵育1 h(稀釋比例均為1∶10 000)。TBST漂洗3次，10 min /次。加入超敏發(fā)光液，反應(yīng)1～2 min，置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中成像。采用Quantity One軟件進(jìn)行灰密度掃描，以目的蛋白條帶灰密度值與內(nèi)參照β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LY28、克唑替尼對(duì)PC-3、MDA-MB-231、NCI-H441細(xì)胞的增殖抑制率比較 不同濃度LY28、克唑替尼對(duì)PC-3、MDA-MB-231、NCI-H441細(xì)胞的增殖抑制率見(jiàn)表1。LY28對(duì)PC-3、MDA-MB-231、NCI-H441細(xì)胞的IC50分別為(10.154±1.209)、(18.946±2.457)、(29.868±3.493)μmol/L，克唑替尼對(duì)PC-3、MDA-MB-231、NCI-H441細(xì)胞的IC50分別為(19.105±2.970)、(39.818±5.694)、(34.982±4.977)μmol/L。LY28對(duì)PC-3、MDA-MB-231、NCI-H441細(xì)胞的IC50均低于克唑替尼(P均<0.05)。

2.2 各組裸鼠抑瘤率及腫瘤組織Met、p-Met、Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)比較 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)裸鼠死亡，無(wú)體質(zhì)量明顯減輕。LY2 810 mg/kg組、LY2 820 mg/kg組、LY2 840 mg/kg組、克唑替尼組抑瘤率分別為38.38%、67.17%、80.30%、77.27%,提示LY28的抑瘤作用具有明顯的劑量依賴性。各組裸鼠腫瘤組織Met、p-Met、Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，與模型組比較，LY2 810 mg/kg組、LY2 820 mg/kg組、LY28 40 mg/kg組及克唑替尼組p-MET及其下游信號(hào)p-Akt、p-ERK1/2水平降低(P<0.05)，且LY28 40 mg/kg組

表1 不同濃度LY28、克唑替尼對(duì)PC-3、MDA-MB-231、NCI-H441細(xì)胞的增殖抑制率

表2 各組裸鼠腫瘤組織Met、p-Met、Akt、p-Akt、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)比較

注：與模型組比較，＊P<0.05。

3 討論

我們自主研發(fā)的LY28即為ATP競(jìng)爭(zhēng)性的小分子c-Met抑制劑。前期研究表明，LY28對(duì)c-Met激酶的IC50值為7 nmol/L。人前列腺癌PC-3細(xì)胞、人肺癌NCI-H441細(xì)胞及人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞均為c-Met高表達(dá)細(xì)胞株。本研究結(jié)果顯示，LY28能顯著抑制PC-3、MDA-MB-231、NCI-H441的生長(zhǎng)，IC50值分別為(10.154±1.209)μmol/L、(18.946±2.457)μmol/L和(29.868±3.493)μmol/L。LY28對(duì)上述三種細(xì)胞的IC50均低于克唑替尼(P均<0.05)，顯示出強(qiáng)大的抑制細(xì)胞增殖作用。

本研究結(jié)果顯示，LY28 10 mg/kg組、LY28 20 mg/kg組、LY28 40 mg/kg組、克唑替尼組抑瘤率分別為38.38%、67.17%、80.30%、77.27%，提示LY28的抑瘤作用具有明顯的劑量依賴性。40 mg/kg LY28 的抑瘤率達(dá)到了80.30%，高于等劑量的克唑替尼。實(shí)驗(yàn)中荷瘤鼠對(duì)LY28能夠較好的耐受，沒(méi)有體質(zhì)量減輕等癥狀發(fā)生。本研究結(jié)果中克唑替尼的的體內(nèi)外抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道相近[15]，證實(shí)了實(shí)驗(yàn)方法合理、結(jié)果可信。c-Met激活后的信號(hào)可通過(guò)Ras-Raf-Mek-ERK/MAPK通路介導(dǎo)細(xì)胞的增殖，同時(shí)也可通過(guò)PDK-Akt-mTOR通路介導(dǎo)細(xì)胞的存活[16, 17]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，LY28 10 mg/kg組、LY28 20 mg/kg組、LY28 40 mg/kg組及克唑替尼組p-Met及其下游信號(hào)p-Akt、p-ERK1/2水平降低，提示LY28和克唑替尼可以抑制Met及其下游信號(hào)Akt、ERK1/2的磷酸化；p-MET及其下游信號(hào)p-Akt、p-ERK1/2水平LY28 40 mg/kg組

活化的c-Met通路可以通過(guò)多種機(jī)制引起腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移：誘導(dǎo)誘導(dǎo)多種底物蛋白的磷酸化[9]；影響腫瘤細(xì)胞間的黏附，破壞細(xì)胞骨架的連接，造成腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[10]；刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、形成血管樣結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)腫瘤血管生成[11]。在c-Met通路激活并誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，ATP介導(dǎo)的 c-Met磷酸化是重要的一個(gè)環(huán)節(jié)[12～14]。當(dāng)HGF與c-Met結(jié)合后，由于ATP的存在， c-Met靠近胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸殘基Y1234, Y1235發(fā)生自身磷酸化，同時(shí)c末端的位點(diǎn)Y1349、Y1356發(fā)生磷酸化，為信號(hào)分子提供結(jié)合位點(diǎn)。募集下游的接頭蛋白1、接頭蛋白2、SH2包含蛋白等銜接蛋白，接著通過(guò)一系列的磷酸化反應(yīng)活化Akt、ERK1/2及磷脂酰肌醇-3激酶、磷酸脂酶C-γ、蛋白酪氨酸磷酸酶、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子等重要的信號(hào)分子及相應(yīng)的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。因此，我們推測(cè)LY28可能通過(guò)阻斷ATP介導(dǎo)的 c-Met磷酸化，可以有效抑制c-Met通路的激活，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。

[1] Naldini L, Vigna E, Narsimhan RP, et al. Hepatocyte growth factor (HGF) stimulates the tyrosine kinase activity of the receptor encoded by the proto-oncogene c-MET [J]. Oncogene, 1991,6(4): 501-504.

[2] Liu X, Newton RC, Scherle PA. Developing c-MET pathway inhibitors for cancer therapy: progress and challenges [J]. Trends Mol Med, 2010,16(1):37-45.

[3] Lu Y, Yao HP, Wang MH. Multiple variants of the RON receptor tyrosine kinase: biochemical properties, tumorigenic activities, and potential drug targets [J]. Cancer Lett, 2007,257(2):157-164.

[4] Goyal L, Muzumdar MD, Zhu AX. Targeting the HGF/c-MET pathway in hepatocellular carcinoma [J]. Clin Cancer Res, 2013,19(9): 2310-2318.

[5] Trovato M, Torre ML, Ragonese M, et al. HGF/c-met system targeting PI3K/AKT and STAT3/phosphorylated-STAT3 pathways in pituitary adenomas: an immunohistochemical characterization in view of targeted therapies [J]. Endocrine, 2013,44(3):735-743.

[6] Engelman JA, Zejnullahu K, Mitsudomi T, et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling [J]. Science, 2007,316(5827):1039-1043.

[7] Cui JJ, Tran-Dube M, Shen H, et al. Structure Based drug design of crizotinib (PF-02341066), a potent and selective dual inhibitor of mesenchymal-epithelial transition factor (c-MET) kinase and anaplastic lymphoma kinase (ALK) [J]. J Med Chem, 2011,54(18):6342-6363.

[8] Solomon BJ, Mok T, Kim DW, et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer [J]. N Engl J Med, 2014, 371(23):2167-2177.

[9] Mizuno S, Nakamura T. HGF-MET cascade, a key target for inhibiting cancer metastasis: the impact of NK4 discovery on cancer biology and therapeutics [J]. Int J Mol Sci, 2013,14(1):888-919.

[10] Murai M, Shen X, Huang L, et al. Overexpression of c-met in oral SCC promotes hepatocyte growth factor-induced disruption of cadherin junctions and invasion [J]. Int J Oncol, 2004,25(4):831-840.

[11] Zhang YW, Su Y, Volpert OV, et al. Hepatocyte growth factor/scatter factor mediates angiogenesis through positive VEGF and negative thrombospondin 1 regulation[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003,100(22):12718-12723.

[12] Hanna JA, Bordeaux J, Rimm DL, et al. The function, proteolytic processing, and histopathology of Met in cancer [J]. Adv Cancer Res, 2009,10(3):1-23.

[13] Trusolino L, Bertotti A, Comoglio PM. MET signalling: principles and functions in development, organ regeneration and cancer [J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2010,11(12):834-848.

[14] Gherardi E, Birchmeier W, Birchmeier C, et al. Targeting MET in cancer: rationale and progress [J]. Nat Rev Cancer, 2012,12(2):89-103.

[15] Zou HY, Li Q, Lee JH, et al. An Orally Available Small-Molecule Inhibitor of c-Met, PF-2341066, Exhibits Cytoreductive Antitumor Efficacy through Antiproliferative and Antiangiogenic Mechanisms [J]. Cancer Res, 2007,67(9):4408-4417.

[16] Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF. Met receptor tyrosine kinase: enhanced signaling through adapter proteins [J]. Oncogene, 2000,19(49):5582-5589.

[17] Johnson GL, Lapadat R. Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases [J]. Science, 2002,298(5600):1911-1912.

[18] Nijman SM, Friend SH. Cancer. Potential of the synthetic lethality principle [J]. Science, 2013,342(6160):809-811.

[19] Robinson KW, Sandler AB. The role of MET receptor tyrosine kinase in non-small cell lung cancer and clinical development of targeted anti-MET agents [J]. Oncologist, 2013,18(2):115-122.

[20] Lee JC, Jang SH, Lee KY, et al. Treatment of Non-small Cell Lung Carcinoma after Failure of Epidermal Growth Factor Receptor Tyrosine Kinase Inhibitor [J]. Cancer Res Treat, 2013,45(2):79-85.

邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(1423108064-7)。

劉玉剛(E-mail： liuyugang1983@yeah.net)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.47.013

R965.1

B

1002-266X(2016)47-0044-04

2016-08-12)