恩諾沙星與乙酰甲喹聯(lián)用體外抗菌活性研究

蔣公建，駱世軍，雷元軍，范建彪，符華林，魏世軍

(1.重慶市萬(wàn)州區(qū)畜牧站，重慶萬(wàn)州 404100；2.重慶先鋒動(dòng)物藥業(yè)有限公司，重慶萬(wàn)州 404100；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸藥創(chuàng)新制劑工程技術(shù)研究中心，成都 611130；4.重慶市開州區(qū)畜牧獸醫(yī)局，重慶開州 405400)

恩諾沙星與乙酰甲喹聯(lián)用體外抗菌活性研究

蔣公建1,2，駱世軍2，雷元軍2，范建彪2，符華林3*，魏世軍4

(1.重慶市萬(wàn)州區(qū)畜牧站，重慶萬(wàn)州 404100；2.重慶先鋒動(dòng)物藥業(yè)有限公司，重慶萬(wàn)州 404100；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸藥創(chuàng)新制劑工程技術(shù)研究中心，成都 611130；4.重慶市開州區(qū)畜牧獸醫(yī)局，重慶開州 405400)

為考察恩諾沙星與乙酰甲喹的聯(lián)合抗菌活性，采用肉湯稀釋棋盤法測(cè)定了恩諾沙星與乙酰甲喹單用及聯(lián)用對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌臨床菌株的體外抗菌活性。結(jié)果顯示：恩諾沙星與乙酰甲喹單獨(dú)使用對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度為8 μg/mL和32 μg/mL，對(duì)沙門氏菌的最小抑菌濃度為16 μg/mL和256 μg/mL。兩藥聯(lián)用對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的FIC指數(shù)為0.5和0.75，分別表現(xiàn)為協(xié)同作用和相加作用。試驗(yàn)表明，恩諾沙星與乙酰甲喹聯(lián)用可以增強(qiáng)對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌感染的治療效果。

乙酰甲喹；恩諾沙星；聯(lián)合抗菌；FIC指數(shù)

恩諾沙星是第一個(gè)動(dòng)物專用的氟喹諾酮類抗菌藥物，1987年由德國(guó)拜耳公司投放市場(chǎng)，我國(guó)于1993年研制成功。恩諾沙星具有殺菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣、生物利用度高、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，近年已廣泛用于獸醫(yī)臨床，對(duì)于防治動(dòng)物大腸桿菌、巴氏桿菌、嗜血桿菌、霉形體感染等疾病有良好效果[1-3]。乙酰甲喹是我國(guó)首創(chuàng)的治療豬痢疾的首選和特效藥，具有用量小、見效快、療效高等優(yōu)點(diǎn)，其抗菌機(jī)理可能與抑制菌體DNA合成有關(guān)。除主治豬痢疾外，乙酰甲喹也是治療禽霍亂、仔豬黃痢和白痢、犢牛傷寒等疾病及多種畜禽消化道感染的主要藥物[4-5]。

隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化、集約化發(fā)展，抗菌藥物的大量使用、不合理應(yīng)用和濫用造成臨床產(chǎn)生了大量的耐藥菌株，給臨床感染性疾病的防治造成一定的困難。因此，尋求新的聯(lián)合用藥技術(shù)是目前獸醫(yī)臨床研究的熱點(diǎn)。恩諾沙星和乙酰甲喹均是對(duì)消化道感染性疾病具有較好療效的抗菌藥物，但由于廣泛使用，近年來(lái)耐藥菌株也不斷出現(xiàn)。為了提高臨床抗菌效果，近年來(lái)有人將恩諾沙星和乙酰甲喹聯(lián)合用于臨床，王傲雪報(bào)道了乙酰甲喹與諾氟沙星、恩諾沙星等藥聯(lián)用抗雞源沙門氏菌，但并未表現(xiàn)協(xié)同作用[7]。目前養(yǎng)豬業(yè)中將恩諾沙星與乙酰甲喹聯(lián)用治療大腸桿菌和沙門氏菌感染也較多，但未見二者對(duì)豬場(chǎng)臨床菌株聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的報(bào)道。本研究采用兩倍稀釋法和棋盤法測(cè)定乙酰甲喹和恩諾沙星單用及聯(lián)用對(duì)豬源大腸桿菌和沙門氏菌臨床株的體外抑菌活性，以期篩選出能明顯增強(qiáng)對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌抗菌活性的復(fù)方制劑，為臨床乙酰甲喹與恩諾沙星合理配伍提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 乙酰甲喹，含量99%，山西兆益生物有限公司，批號(hào)20130314；恩諾沙星，含量99.5%，浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司，批號(hào)20120321。M-H液體培養(yǎng)基、M-H瓊脂購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)菌株 大腸桿菌、沙門氏菌，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)藥物安全性評(píng)價(jià)研究室提供，系臨床分離致病菌,2014年6月分離于四川樂山某豬場(chǎng)。質(zhì)控菌為大腸桿菌ATCC25922，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 方法

1.3.1 菌液制備 將大腸桿菌和沙門氏菌分別接種于10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)6 h后10倍等比稀釋不同倍數(shù)后接種M-H瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)16～18 h后菌落計(jì)數(shù)，選擇菌落數(shù)在100～300的平板，計(jì)算菌懸液的濃度，將菌懸液稀釋至106CFU/mL待用。

1.3.2 藥液的配制 精密稱取乙酰甲喹和恩諾沙星，無(wú)菌操作配制成1024 μg/mL的藥液，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，各貯存液在一周內(nèi)用完。

1.3.3 單藥最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定 取經(jīng)滅菌過的96孔微型反應(yīng)板4塊，采用兩倍稀釋法分別測(cè)定乙酰甲喹和恩諾沙星對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度。將乙酰甲喹與恩諾沙星各自稀釋到濃度為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL后分別加入96孔板每排的第1～11孔，第12孔作為陽(yáng)性對(duì)照，各孔分別加入100 μL稀釋菌液。每藥做4組稀釋，其中第四組為陰性對(duì)照。將微孔板置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后觀察，結(jié)果取平均值，求得兩藥的MIC。從開始有細(xì)菌生長(zhǎng)的前一孔開始向前每孔用接種環(huán)接種試驗(yàn)液于瓊脂平板上，于37 ℃下培養(yǎng)24 h后觀察，求得MBC。

其中，F(xiàn)IC≤0.5 為協(xié)同作用；0.52為拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酰甲喹與恩諾沙星單用對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的MIC值 結(jié)果見表1?？梢钥闯?，乙酰甲喹和恩諾沙星對(duì)大腸桿菌的抑菌效果均優(yōu)于對(duì)沙門氏菌的抑菌效果，而對(duì)同種菌株而言，恩諾沙星的抑制效果均優(yōu)于乙酰甲喹。

表1 乙酰甲喹、恩諾沙星對(duì)大腸桿菌和 沙門氏菌的MIC值 μg/mL

將各藥MIC值的前三孔(包括最小抑菌濃度孔)的培養(yǎng)液接種于瓊脂平板上于37℃下培養(yǎng)24 h后觀察，測(cè)定各藥的MBC值，結(jié)果見表2。恩諾沙星和乙酰甲喹對(duì)兩種菌的殺菌濃度與抑菌濃度相隔很近，所以臨床上二者多用作殺菌藥。

表2 乙酰甲喹、恩諾沙星對(duì)大腸桿菌和 沙門氏菌的MBC值 μg/mL

兩種藥物單獨(dú)用藥的結(jié)果顯示，在對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的體外抑菌試驗(yàn)中，不論是MIC還是MBC，恩諾沙星均低于乙酰甲喹，在治療有大腸桿菌和沙門氏菌引起的疾病時(shí)恩諾沙星可能比乙酰甲喹有更好的療效。

2.2 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 兩藥聯(lián)用對(duì)大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 乙酰甲喹、恩諾沙星聯(lián)合用藥對(duì)大腸桿菌的MIC值見表2?？梢钥闯?，當(dāng)乙酰甲喹與恩諾沙星聯(lián)合運(yùn)用時(shí)，乙酰甲喹和恩諾沙星對(duì)大腸桿菌的MIC分別為8 μg/mL和2 μg/mL，均小于單獨(dú)藥敏試驗(yàn)時(shí)的MIC。將所得MIC值代入FIC指數(shù)計(jì)算公式，求得兩藥聯(lián)用對(duì)大腸桿菌的FIC指數(shù)為0.5，表現(xiàn)為協(xié)同作用。

表2 恩諾沙星與乙酰甲喹對(duì)大腸桿菌的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

“+”表示有細(xì)菌生長(zhǎng)；“-”表示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)

2.2.2 兩藥聯(lián)用對(duì)沙門氏菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 乙酰甲喹、恩諾沙星聯(lián)合用藥對(duì)沙門氏菌的MIC值測(cè)定結(jié)果見表3?？梢钥闯?，當(dāng)乙酰甲喹與恩諾沙星聯(lián)合運(yùn)用時(shí)，乙酰甲喹和恩諾沙星對(duì)沙門氏菌的MIC分別為64 μg/mL和8 μg/mL，均小于單獨(dú)藥敏試驗(yàn)時(shí)的結(jié)果。將所得MIC值代入FIC指數(shù)計(jì)算公式，求得兩藥聯(lián)用對(duì)沙門氏菌的FIC指數(shù)為0.75，表現(xiàn)為相加作用。

表3 恩諾沙星與乙酰甲喹對(duì)沙門氏菌的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

“+”表示有細(xì)菌生長(zhǎng)；“-”表示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)

3 討 論

腸道感染是獸醫(yī)臨床中常見的疾病，可由病毒和細(xì)菌感染引起，其中大腸桿菌和沙門氏菌是引起腸道感染的主要病原，目前針對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌引起的腸道感染主要采取抗菌藥物來(lái)進(jìn)行治療。但是，獸醫(yī)臨床在使用抗菌藥物時(shí)常常針對(duì)性不強(qiáng)，濫用藥物現(xiàn)象比較嚴(yán)重，由此帶來(lái)的賴藥性使抗菌藥物的效果越來(lái)越差。同時(shí)，我國(guó)腸道感染疾病多呈混合感染或者繼發(fā)感染，單一抗感染藥物往往無(wú)法控制多種病原體混合感染的局面，因此，聯(lián)合用藥已成為克服單一抗感染藥物抗菌范圍有限而不能有效防治混合感染的缺陷的一種較好方案。

恩諾沙星與乙酰甲喹是獸醫(yī)臨床常用的治療腸道感染的抗菌藥物。恩諾沙星抗菌譜廣，殺菌活性強(qiáng)，能有效殺死靜止期和生長(zhǎng)期的細(xì)菌，對(duì)多種革蘭氏陰性桿菌如大腸桿菌、沙門氏菌以及球菌都能起到良好的抗菌效果[8-9]。但是由于使用廣泛其耐藥性報(bào)道日益增多，特別沙門氏菌的耐藥性比較明顯[2,10-11]。乙酰甲喹對(duì)革蘭陰性菌作用更強(qiáng)，廣泛用于治療雞或豬的腸道細(xì)菌性疾病[5]。近年來(lái)為了增強(qiáng)抗菌效果及降低毒性，常將乙酰甲喹與其他藥物聯(lián)合使用。

本實(shí)驗(yàn)采用體外聯(lián)合藥敏的方法考察了恩諾沙星與乙酰甲喹聯(lián)合運(yùn)用對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的MIC的變化。兩藥單獨(dú)使用時(shí)恩諾沙星和乙酰甲喹對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抗菌活性都較強(qiáng)，但恩諾沙星的抗菌效果明顯優(yōu)于乙酰甲喹，是乙酰甲喹的4～16倍；兩藥對(duì)大腸桿菌的效果也優(yōu)于其對(duì)沙門氏菌的效果，這與部分文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果比較一致[2]，只是恩諾沙星與乙酰甲喹對(duì)兩株菌的MIC值跟文獻(xiàn)報(bào)道稍有差異，這可能跟細(xì)菌的血清型或者區(qū)域用藥習(xí)慣有關(guān)[4,12-13]。恩諾沙星與乙酰甲喹聯(lián)用對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌臨床株的FIC指數(shù)分別為0.5和0.75，說明恩諾沙星和乙酰甲喹對(duì)兩種菌的抗菌作用呈協(xié)同或者相加效應(yīng)。對(duì)大腸桿菌聯(lián)合應(yīng)用時(shí)恩諾沙星和乙酰甲喹的MIC均為其單獨(dú)使用時(shí)MIC的1/4，說明臨床中兩藥聯(lián)合用于治療由大腸桿菌引起的疾病時(shí)，在保證治療效果的前提下，可降低恩諾沙星和乙酰甲喹的用量，降低用藥成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。同樣，在對(duì)沙門氏菌聯(lián)合應(yīng)用時(shí)恩諾沙星的MIC為其單獨(dú)使用的1/2，乙酰甲喹為其單獨(dú)用藥的1/4，說明臨床中兩藥也可以聯(lián)合用于治療由沙門氏菌引起的疾病。

乙酰甲喹和恩諾沙星都是獸醫(yī)臨床治療中常用的廣譜抗菌藥物，其良好的治療效果得到廣大獸醫(yī)工作者的好評(píng)。恩諾沙星與乙酰甲喹呈協(xié)同作用，臨床聯(lián)合用藥時(shí)可以大大減少藥物用量，從而有效防止耐藥菌的產(chǎn)生。同時(shí)，隨著藥物用量的減少，也可減少藥物在肉食品、土壤和水中的殘留，從而減輕給人畜健康造成傷害。

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(編輯：李文平)

Study on the Antibacterial Activity of Enrofloxacin Combined with Mequindoxinvitro

JIANG Gong-jian1,2,LUO Shi-jun2,LEI Yuan-jun2,FAN Jian-biao2, FU Hua-lin3*,WEI Shi-jun4

(1.AnimalHusbandryBureauofWanzhouDistrict,Wanzhou,Chongqing404100,China;2.PioneersAnimalsPharmaceuticalCo.Ltd.ofChongqing,Wanzhou,Chongqing404100,China;3.InnovativeEngineeringResearchCenterofVeterinaryPharmaceutics,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu625014,China；4.AnimalHusbandryandVeterinaryBureauofKaizhouDistrict,Kaizhou,Chongqing405400,China)

In order to study on the combined antibacterial activity of enrofloxacin and mequindox,Broth microdilution checkerboard method was used to detect theinvitroantibacterial activity of enrofloxacin alone and combined with mequindox againstEscherichiacoliandSalmonellaisolates.Results showed that MIC of enrofloxacin and mequindox againstEscherichiacoliwas 8 μg/mL and 32 μg/mL when they were used alone,and MIC of them againstSalmonellawas 16 μg/mL and 256 μg/mL.When enrofloxacin and mequindox were combined,the FIC againstEscherichiacoliandSalmonellaisolates was 0.5 and 0.75 respectively,which indicated the synergic action onEscherichiacoliand additive effect onSalmonella.The results suggest that the combined use of enrofloxacin and mequindox can enhance the treatment effect ofEscherichiacoliandSalmonellainfections.

mequindox; enrofloxacin; combined antibacterial activity; FIC index

蔣公建，高級(jí)獸醫(yī)師，從事獸藥研發(fā)與推廣工作。

2016-07-30

A

1002-1280 (2016) 12-0019-05

S859.79