不同動(dòng)物高免血清對(duì)豬肺炎支原體的代謝抑制作用研究

孫亞波，魏晶晶，劉富東，王芳，寧宜寶，孫曄,，王鳳霞，沈青春,*

(1.北京中海生物科技有限公司，北京 100081；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

不同動(dòng)物高免血清對(duì)豬肺炎支原體的代謝抑制作用研究

孫亞波1，魏晶晶1，劉富東1，王芳2，寧宜寶2，孫曄1,2，王鳳霞1，沈青春1,2*

(1.北京中海生物科技有限公司，北京 100081；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

選用豬、兔、雞、小鼠和豚鼠5種試驗(yàn)動(dòng)物分別制備豬肺炎支原體高免陽性血清，并測(cè)定了其對(duì)豬肺炎支原體的代謝抑制效價(jià)。再從兔高免血清中純化特異性抗體，比較抗體純化前后的代謝抑制效價(jià)是否發(fā)生變化。結(jié)果表明，5種試驗(yàn)動(dòng)物高免血清對(duì)豬肺炎支原體的代謝抑制價(jià)分別為0、104、103、105、102，純化后的抗體仍可抑制豬肺炎支原體的生長，代謝抑制價(jià)沒有明顯變化。由此可見，不同動(dòng)物來源的高免血清對(duì)豬肺炎支原體的代謝抑制價(jià)不同，代謝抑制作用的主要作用物質(zhì)為特異性抗體；首次證明病原靶動(dòng)物——豬的高免抗血清對(duì)豬肺炎支原體沒有代謝抑制作用，其他支原體是否也表現(xiàn)為對(duì)靶動(dòng)物(或人)抗血清的耐受性還有待進(jìn)一步研究。

豬肺炎支原體；代謝抑制作用；高免血清

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)是引起豬地方流行性肺炎(Swine enzootic pneumoniae,SEP)的病原，國內(nèi)稱為“豬喘氣病”。該病廣泛流行于世界各地，是嚴(yán)重危害全球養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的慢性疾病之一[1]。

支原體具有類似于病毒中和作用的代謝抑制(Metabolic inhibition, MI)特性，是細(xì)菌所不具有的特殊性質(zhì)[2]。該特性具有很強(qiáng)的種屬特異性，即抗一種支原體的高免血清只能抑制該種支原體的生長繁殖，而對(duì)其他種類的支原體不具有抑制作用，因而以該特性為基礎(chǔ)的代謝抑制試驗(yàn)和生長抑制試驗(yàn)已成為支原體鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)[3-5]。本實(shí)驗(yàn)室研究工作中發(fā)現(xiàn)，豬抗Mhp的高免血清對(duì)Mhp似乎不具有代謝抑制作用，而兔抗Mhp的高免血清則抑制作用較強(qiáng)，有關(guān)不同動(dòng)物的抗血清對(duì)支原體的代謝抑制作用的相關(guān)問題，在國內(nèi)外還沒有任何報(bào)道，甚至代謝抑制相關(guān)研究也僅有早期的少量報(bào)道。為了調(diào)查幾種常見試驗(yàn)動(dòng)物抗Mhp高免血清的代謝抑制作用情況，本實(shí)驗(yàn)選用了5種試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行了免疫和代謝抑制效價(jià)測(cè)定及相關(guān)研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌毒種 豬肺炎支原體232株，來自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基 PPLO、豬血清、馬血清等，購自GIBCO公司；Lps-5支原體液體培養(yǎng)基(含PPLO、葡萄糖、MEM等)和豬肺炎支原體間接血凝(IHA)抗原(批號(hào)：201501)，北京中海生物科技有限公司自制。IMS 1313水性佐劑，法國賽比克公司提供。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 BalB/C小鼠、豚鼠和清潔級(jí)健康家兔，來自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。SPF雞購自梅里亞。30～40日齡健康仔豬，購自保定某商品代豬場(chǎng)，豬肺炎支原體抗原、抗體陰性，豬瘟、豬偽狂犬、豬藍(lán)耳病抗原陰性。

1.2 抗原的制備 開啟豬肺炎支原體232株凍干菌種，使用Lps-5支原體液體培養(yǎng)基，按1/10的接種比例擴(kuò)大繁殖至5000 mL菌液，8000 r/min離心30 min后，使用PBS(pH 7.2±0.1)100 mL重懸，滅活后1313水性佐劑100 mL，低剪切力混合5～10 min，按照現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄要求進(jìn)行無菌檢驗(yàn)后，置2～8 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 陽性血清的制備與檢測(cè) BalB/C小鼠、豚鼠、家兔、SPF雞和仔豬5種動(dòng)物的數(shù)量分別為10只、5只、3只、3只和2頭，單次免疫劑量分別為0.2 mL/只、0.5 mL/只、1 mL/只、1 mL/只和2 mL/頭，首次免疫14日后，每隔一周使用相同劑量加強(qiáng)免疫一次，5次免疫后10日采血分離血清，進(jìn)行瓊擴(kuò)效價(jià)和IHA效價(jià)測(cè)定。

1.4 活菌滴度測(cè)定 取新鮮培養(yǎng)的豬肺炎支原體232株培養(yǎng)物，按照CCU50測(cè)定方法進(jìn)行活菌濃度測(cè)定[6]，用于代謝抑制試驗(yàn)的培養(yǎng)物CCU50滴度應(yīng)不低于10-8.0/mL，置-70 ℃以下凍存不超過3個(gè)月。

2.活躍課堂氣氛，改變陳舊的教學(xué)理念和模式，培養(yǎng)學(xué)生自覺思維能力。特別在課堂上要形成師生之間、生生之間的彼此交流、互相質(zhì)疑，讓學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)、創(chuàng)新思維能夠互相影響、互相激勵(lì)，產(chǎn)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

1.5 代謝抑制試驗(yàn) 使用Lps-5支原體液體培養(yǎng)基對(duì)經(jīng)CCU50測(cè)定的Mhp 232株培養(yǎng)物進(jìn)行10倍比稀釋至10-8，在10-6、10-7、10-8三個(gè)稀釋度各取1 mL，向其中分別加入1 mL含10%待測(cè)抗Mhp陽性血清的液體培養(yǎng)基，充分混勻，取10-6、10-7、10-8三個(gè)稀釋度各2 mL作為對(duì)照管。另設(shè)2 mL液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照組，于37℃培養(yǎng)14日后判定結(jié)果?？瞻讓?duì)照不變色，對(duì)照組3個(gè)滴度都變黃，試驗(yàn)組至少10-7、10-8兩個(gè)滴度不變色即可判定為豬肺炎支原體可被待測(cè)陽性血清所抑制。

1.6 代謝抑制效價(jià)測(cè)定 采用1.5的方法將Mhp 232株培養(yǎng)物10倍比稀釋至10-8，取10-1～10-8七個(gè)稀釋度各取1 mL，向其中分別加入1 mL含10%待測(cè)抗Mhp陽性血清的液體培養(yǎng)基，充分混勻，取10-6、10-7、10-8三個(gè)稀釋度各2 mL作為對(duì)照。另設(shè)2 mL液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照組，于37 ℃培養(yǎng)14 d后判定結(jié)果。空白對(duì)照不變色，3支對(duì)照管都變黃，記錄試驗(yàn)組最后一支變色小管的滴度，并計(jì)算出待測(cè)陽性血清的代謝抑制價(jià)，如10-1～10-3小管變色，10-4～10-7小管不變色，而測(cè)定菌液的CCU為108/mL，則共抑制了5個(gè)滴度，即待測(cè)陽性血清的代謝抑制價(jià)為105。

1.7 代謝抑制作用的機(jī)理初步研究

1.7.1 豬高免陽性血清中加入兔陰性血清后的代謝抑制價(jià)測(cè)定 將兔陰性血清與豬抗Mhp陽性血清按1∶1混合，再按照1.5項(xiàng)的方法進(jìn)行代謝抑制試驗(yàn)，以確定兔血清中是否存在某種特殊因子有助于抗體對(duì)Mhp的代謝抑制作用。

1.7.2 純化兔特異性抗體的代謝抑制效價(jià)測(cè)定 家兔高免血清表現(xiàn)出較強(qiáng)的代謝抑制作用，為了確定代謝抑制作用是由特異性抗體的結(jié)合引起，還是與其他因子共同作用的結(jié)果，本試驗(yàn)將20 mL家兔高免血清經(jīng)硫酸銨沉淀后用PBS復(fù)溶，經(jīng)分子篩過柱后，獲得純化抗體10 mL(濃度10.4 mg/mL)。將原倍和倍比稀釋物分別替代高免血清按1.6項(xiàng)方法進(jìn)行代謝抑制效價(jià)測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 抗原制備 用于抗原制備的豬肺炎支原體232株培養(yǎng)物共計(jì)5000 mL，取10 mL分裝成1 mL/支小管，共10支，置-70 ℃以下凍存，用于代謝抑制試驗(yàn)。其余培養(yǎng)物用于制備抗原，共獲得抗原195 mL，無菌檢驗(yàn)結(jié)果均符合規(guī)定。培養(yǎng)物的CCU50測(cè)定結(jié)果為1.72 × 108CCU50/mL。

2.2 陽性血清的制備與檢測(cè)結(jié)果 對(duì)制備的5種動(dòng)物的Mhp高免陽性血清進(jìn)行瓊擴(kuò)效價(jià)測(cè)定，同時(shí)按照現(xiàn)行《中國獸藥典》進(jìn)行豬支原體肺炎間接血凝試驗(yàn)，結(jié)果表明5種高免血清的效價(jià)均高于1∶10，即均為豬肺炎支原體陽性，其IHA效價(jià)和瓊擴(kuò)效價(jià)見表1。

表1 5種動(dòng)物的高免陽性血清制備結(jié)果

2.3 代謝抑制試驗(yàn) 代謝抑制試驗(yàn)結(jié)果表明BalB/C小鼠、豚鼠、家兔和SPF雞的高免陽性血清都可以不同程度地抑制豬肺炎支原體的生長，而仔豬高免血清的代謝抑制結(jié)果為三個(gè)稀釋度為均不變色，表現(xiàn)為不抑制，結(jié)果見表2。

表2 5種動(dòng)物的高免陽性血清代謝抑制試驗(yàn)結(jié)果

2.4 代謝抑制價(jià)的測(cè)定 為進(jìn)一步確定上述各動(dòng)物高免血清的代謝抑制能力，對(duì)其分別進(jìn)行代謝抑制價(jià)測(cè)定，結(jié)果見表3。

結(jié)果表明，小鼠的高免血清具有很強(qiáng)的代謝抑制特性，代謝抑制價(jià)最高，達(dá)到105，其次是家兔，可達(dá)104，IHA抗體效價(jià)最高的豚鼠陽性血清的代謝抑制價(jià)則比較低，而IHA抗體效價(jià)次高的仔豬的代謝抑制價(jià)結(jié)果為0，即無抑制。

表3 5種動(dòng)物的高免陽性血清代謝抑制價(jià)測(cè)定結(jié)果

上述結(jié)果表明，不同動(dòng)物的高免陽性血清對(duì)Mhp的代謝抑制能力不同，瓊擴(kuò)效價(jià)和IHA效價(jià)均不能很好地反映血清的代謝抑制能力，而本動(dòng)物——豬高免血清沒有表現(xiàn)出代謝抑制能力。出現(xiàn)上述結(jié)果是否與支原體的免疫逃避機(jī)制[7-8]有關(guān)需要進(jìn)一步的研究。

2.5 代謝抑制作用的機(jī)理初步研究

2.5.1 混合血清的代謝抑制效價(jià)測(cè)定 家兔高免血清表現(xiàn)出較強(qiáng)的代謝抑制作用，而豬的高免血清盡管瓊擴(kuò)效價(jià)和IHA效價(jià)均高，但代謝抑制價(jià)測(cè)定結(jié)果為0，是否說明代謝抑制作用不僅僅與抗體有關(guān)，還與存在于兔血清中的其他因子參與其中，本實(shí)驗(yàn)將豬陽性血清等比例混合兔陰性血清后進(jìn)行代謝抑制價(jià)測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 豬、兔混合血清的代謝抑制價(jià)測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，兔陰性血清并沒有改變仔豬高免陽性血清的代謝抑制效價(jià)，由此可見兔陰性血清中不含與代謝抑制有關(guān)的成分。2.6 純化的兔特異性抗體的代謝抑制效價(jià)測(cè)定 本試驗(yàn)共獲得純化抗體10 mL(濃度10.4 mg/mL)。將原倍和倍比稀釋物的純化家兔特異性抗體分別替代高免血清按1.6項(xiàng)方法進(jìn)行代謝抑制效價(jià)測(cè)定，結(jié)果見表5。

表5 兔純化抗體的代謝抑制價(jià)測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，兔抗豬肺炎支原體抗體可獨(dú)立抑制豬肺炎支原體的生長，抑制作用的強(qiáng)弱與抗體濃度直接相關(guān)，抗體濃度降低一半后，代謝抑制作用下降了2個(gè)滴度，由此可見二者似乎不呈線性關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

支原體是自然中能獨(dú)立生長繁殖的最小生物，其結(jié)構(gòu)簡單，無細(xì)胞壁。其代謝抑制特性是在人類發(fā)現(xiàn)病毒的抗體中和作用之后發(fā)現(xiàn)的，美國科學(xué)家1958年首次發(fā)現(xiàn)用柯賽基病毒B組抗體可抑制該病毒的感染，即病毒中和作用[9]。1966年，Purcell R H等首次發(fā)現(xiàn)兔抗支原體高免血清對(duì)相應(yīng)支原體具有顯著抑制其生長繁殖的作用[2,10]。

本研究需要對(duì)不同動(dòng)物高免血清對(duì)支原體的代謝抑制作用的強(qiáng)弱進(jìn)行評(píng)價(jià)，首次引入了“代謝抑制效價(jià)”的概念及其測(cè)定方法，而此前國內(nèi)外還沒有任何支原體抗血清的代謝抑制強(qiáng)弱及其評(píng)價(jià)方法的報(bào)道，實(shí)驗(yàn)證明“代謝抑制效價(jià)”能很好地評(píng)價(jià)各血清樣品的代謝抑制作用強(qiáng)弱，而且測(cè)定方法較為簡單。一直以來國內(nèi)外用于代謝抑制試驗(yàn)所用的抗血清多采用兔高免血清，而這可能與家兔容易飼養(yǎng)，并能得到足夠量的血清有關(guān)，本研究結(jié)果表明在所制備的豬肺炎支原體的高免血清中，鼠高免血清相比兔具有更高的代謝抑制效價(jià)，但相比家兔，小鼠血清制備較為困難，單只所得血清量少。

病毒的中和試驗(yàn)基本原理是特異性抗體主要通過封閉病毒與細(xì)胞的結(jié)合受體使其失去感染性[11]。支原體的代謝抑制特性是否與病毒的中和特性相似？本研究采用了純化后的兔源特異性抗體進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其可以抑制豬肺炎支原體的生長，但為何豬的高免血清對(duì)Mhp又不具有代謝抑制作用？是因?yàn)椴煌瑒?dòng)物抗體在種屬特異性結(jié)構(gòu)上的差異，還是其他原因造成這樣的結(jié)果，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究予以解答。

Mhp對(duì)其靶動(dòng)物——豬的抗Mhp高免血清幾乎沒有代謝抑制作用的結(jié)論，就引出了一個(gè)新問題，豬支原體肺炎當(dāng)前最主要的防治手段是免疫預(yù)防，即接種弱毒活疫苗和滅活疫苗，弱毒活疫苗能產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，獲得很好的免疫保護(hù)力容易理解，而滅活疫苗則主要產(chǎn)生體液免疫，即產(chǎn)生針對(duì)Mhp的抗體。病毒疫苗的體液免疫主要通過中和作用實(shí)現(xiàn)抗感染，而從本文結(jié)論可知豬支原體肺炎疫苗似乎不太可能是通過特異性抗體的代謝抑制作用實(shí)現(xiàn)抗感染。Mhp滅活疫苗是當(dāng)前全球用于預(yù)防豬支原體肺炎最主要的工具之一，事實(shí)證明可以使豬體產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)力[12-13]，其產(chǎn)生抗感染的作用的產(chǎn)生可能與代謝抑制沒有直接關(guān)系，而與細(xì)菌疫苗的抗感染作用相似。

豬陽性血清對(duì)Mhp不具有代謝抑制作用，將對(duì)Mhp的培養(yǎng)具有很好的應(yīng)用參考價(jià)值，一些文獻(xiàn)要求配制用于培養(yǎng)豬肺炎支原體的培養(yǎng)基所使用的豬血清為Mhp抗體陰性[14]，而Mhp抗體陰性的成年豬極難找到，得到大量陰性血清非常困難[15]。本研究的結(jié)果顯示試驗(yàn)Mhp抗體陽性的豬血清對(duì)Mhp不具有代謝抑制作用，因而不影響Mhp的生長繁殖，即用于Mhp培養(yǎng)的豬血清無需要求Mhp抗體陰性。

本研究首次報(bào)到了Mhp的靶動(dòng)物——豬的抗Mhp高免血清對(duì)Mhp不具有代謝抑制作用，兔抗Mhp特異性抗體可獨(dú)立抑制Mhp的生長。其他支原體是否也對(duì)靶動(dòng)物(或人)的高免抗血清具有耐受性，該特性是否與代謝抑制作用的機(jī)理有關(guān)，還有待進(jìn)一步的研究。

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(編輯：李文平)

Metabolic Inhibition Studies on Different Animal Hyperimmune Antiserum againstMycoplasmahyopneumoniae

SUN Ya-bo1,WEI Jing-jing1,LIU Fu-dong1,WANG Fang2,NING Yi-bao2,SUN Ye1,2,WANG Feng-xia1, SHEN Qing-chun1,2*

(1.BeijingZhonghaiBiotechCo.Ltd.,Beijing100081,China; 2.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

Five kinds of experimental animals, including pig, rabbit, chicken, mice and guinea pig were immuned repeatedly to prepare hyperimmune serum againstMycoplasmahyopneumoniae(Mhp), and the metabolic inhibition potency of the sera were determined. The purified specific antibody from rabbit hyperimmune sera was used for the potency determination,too.The results showed that the metabolic inhibitory potency to Mhp of the hyperimmune sera from five kinds of animals were 0,104,103,105and 102, respectively.The purified specific antibody could inhibit the growth of Mhp, and the potency was 104. Therefore, the metabolic inhibitory potency against Mhp of the hyperimmune serum from different animals was different. The main effective material of metabolic inhibition was the specific antibody. The agent target animal —— pig’s hyperimmune antiserum against Mhp could not inhibit the growth of Mhp. Whether or not the other mycoplasma has the tolerance to antiserum from target animals (or human) needs to be further studied.

Mycoplasmahyopneumoniae; metabolic inhibition; hyperimmune antiserum

孫亞波，本科，從事獸用生物制品的研制工作。

2016-09-27

A

1002-1280 (2016) 12-0007-05

S858.28