HPLC-PDA方法同時(shí)檢測(cè)黃連解毒散中非法添加的對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新

董玲玲，龔旭昊，王靜文，楊星，范強(qiáng)

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

HPLC-PDA方法同時(shí)檢測(cè)黃連解毒散中非法添加的對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新

董玲玲，龔旭昊，王靜文，楊星，范強(qiáng)*

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

為同時(shí)檢測(cè)黃連解毒散中非法添加的對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新，以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，1%冰醋酸溶液(用三乙胺調(diào)劑pH值至4.0)為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，波長(zhǎng)掃描范圍為210～400 nm，柱溫25 ℃，建立了HPLC-PAD檢測(cè)方法，并采用峰純度檢查和光譜相似度檢查輔助對(duì)照品比對(duì)方法，對(duì)非法添加藥物進(jìn)行確證。結(jié)果顯示，對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新的回收率分別為98.6%和99.4%，RSD分別為0.6%和0.2%；線性方程分別為y=43408x-401.96，R2=1和y=14331x-1682.4，R2=1；檢測(cè)限分別為1和5 mg/g；定量限分別為2和10 mg/g。本方法簡(jiǎn)潔、靈敏、可靠，可同時(shí)對(duì)黃連解毒散中非法添加的對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新違禁藥物進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。

對(duì)乙酰氨基酚；鹽酸溴己新；黃連解毒散；HPLC-PDA

黃連解毒散的主要成分有黃連、黃芩、黃柏、梔子,主治三焦實(shí)熱、瘡黃腫毒,適用于馬、牛、羊、豬、兔及家禽[1]，應(yīng)用廣泛。對(duì)乙酰氨基酚因其解熱鎮(zhèn)痛作用明顯，價(jià)格低廉，常被不法商家添加在獸藥中以“增強(qiáng)藥效”。鹽酸溴己新有較強(qiáng)的溶解黏痰作用，可使痰中的多糖纖維素裂解，稀化痰液[2]，常用做祛痰藥。在黃連解毒散中添加對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新，不僅違反了《獸藥管理?xiàng)l例》，也為動(dòng)物源性食品安全埋下了隱患。

有關(guān)獸藥中非法添加對(duì)乙酰氨基酚的檢測(cè)方法已有不少[3-5]，而針對(duì)獸藥中非法添加鹽酸溴己新的檢測(cè)方法卻鮮有報(bào)道，更沒(méi)有同時(shí)檢測(cè)獸藥中非法添加對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新的方法報(bào)道。而實(shí)際工作中已發(fā)現(xiàn)有市售黃連解毒散中非法添加了對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新的情況存在，因此有必要建立簡(jiǎn)潔、靈敏、可靠的方法檢測(cè)黃連解毒散中非法添加的對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的用于檢測(cè)鹽酸溴己新的方法最常用的是高效液相色譜法[2,6-7]，另外還有近紅外光譜法[8]、化學(xué)發(fā)光法[9]等。參考上述文獻(xiàn)，并綜合考慮對(duì)乙酰氨基酚、鹽酸溴己新的物理化學(xué)性質(zhì)及黃連解毒散的特點(diǎn)，本文擬建立一種快速、準(zhǔn)確、可靠的定性定量方法，以期廣泛應(yīng)用于非法添加的檢測(cè)工作。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters e2695液相系統(tǒng)、2998 PDA二極管陣列檢測(cè)器、Empower3色譜工作站軟件(美國(guó)Waters 公司)、Mettler AE240型十萬(wàn)分之一天平(美國(guó)Mettler Toledo公司)、MiliQ純水機(jī)、雷磁PHSJ-4A型pH 計(jì)。

1.2 試藥與試劑 對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品(含量：99.9%，批號(hào)：100018-201409，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，鹽酸溴己新對(duì)照品(含量：99.9%，批號(hào)：100427-201102，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；供試品：黃連解毒散空白樣品(自制散劑)；黃連解毒散陽(yáng)性樣品(批號(hào)：20150643)，甲醇(德國(guó)Merck公司，色譜純)，三乙胺(美國(guó)Fisher Scientific公司，色譜純)，冰醋酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)，去離子水(MiliQ純化系統(tǒng)制備的去離子水)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：資生堂MGⅡ C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相：1%冰醋酸溶液(用三乙胺調(diào)劑pH值至4.0)為流動(dòng)性A，甲醇為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫，流速：1.0 mL/min，柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量：10 μL，二極管陣列檢測(cè)器(PDA，檢測(cè)波長(zhǎng):210～400 nm，記錄248 nm波長(zhǎng)處的色譜圖)。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 黃連解毒散 空白儲(chǔ)備液取自制黃連解毒散2.0 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇50.0 mL，超聲處理15 min，靜置，濾過(guò)，作為黃連解毒散空白儲(chǔ)備液。

2.2.2 黃連解毒散空白溶液 取黃連解毒散空白儲(chǔ)備液1.0 mL，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，作為黃連解毒散空白溶液。

2.2.3 對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品儲(chǔ)備液 取對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1 mg/mL的對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品儲(chǔ)備液A。精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得0.02 mg/mL的對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品儲(chǔ)備液B。

2.2.4 鹽酸溴己新對(duì)照品儲(chǔ)備液 取鹽酸溴己新對(duì)照品25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1 mg/mL的鹽酸溴己新對(duì)照品儲(chǔ)備液A。精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得0.1 mg/mL的鹽酸溴己新對(duì)照品儲(chǔ)備液B。

2.2.5 系統(tǒng)適用性溶液 取黃連解毒散空白儲(chǔ)備液1.0 mL，置50 mL量瓶中，加對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品儲(chǔ)備液A和鹽酸溴己新對(duì)照品儲(chǔ)備液A各5 mL，加初始流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 供試品本底及干擾 精密量取黃連解毒散空白溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖和光譜指數(shù)圖，另取系統(tǒng)適用性溶液10 μL，同法操作，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2，表明黃連解毒散本底在對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新相應(yīng)位置不產(chǎn)生干擾。

圖1 黃連解毒散空白溶液光譜色譜圖

圖2 系統(tǒng)適用性溶液光譜色譜圖

2.3.2 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品儲(chǔ)備液A和鹽酸溴己新對(duì)照品儲(chǔ)備液A各2.5 mL，置同一50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取1、3、5、7、9 mL，置10 mL容量瓶中，加初始流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得濃度為5、15、25、35、45 μg/mL的對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，測(cè)定。按各對(duì)照品峰面積與對(duì)應(yīng)的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。對(duì)乙酰氨基酚的回歸方程為y=43408x-401.96,R2=1；鹽酸溴己新的回歸方程為y=14331x-1682.4,R2=1，表明對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新在5～45 μg/mL濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 檢測(cè)限與定量限 檢測(cè)限溶液制備：取黃連解毒散空白儲(chǔ)備液1 mL,置50 mL容量瓶中，分別精密加入對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品儲(chǔ)備液B適量(1、2、3 mL),加初始流動(dòng)相稀釋至刻度。另取黃連解毒散空白儲(chǔ)備液1 mL,置50 mL容量瓶中，分別精密加入鹽酸溴己新對(duì)照品儲(chǔ)備液B適量(1、2、3 mL),加初始流動(dòng)相稀釋至刻度。以光譜圖失真的最大濃度作為方法的檢測(cè)限(圖3-圖4)，S/N≥10的濃度為定量限。該色譜條件下對(duì)乙酰氨基酚的檢測(cè)限為1 mg/g，定量限為2 mg/g；鹽酸溴己新的檢測(cè)限為5 mg/g，定量限為10 mg/g。為達(dá)到“藥效”，有時(shí)獸藥中非法添加其它藥物的量非常大，本方法所制定的檢測(cè)限和定量限能夠滿足實(shí)際工作需要。

圖3 對(duì)乙酰氨基酚檢測(cè)限光譜色譜圖

圖4 鹽酸溴己新檢測(cè)限光譜色譜圖

2.3.4 準(zhǔn)確度 以黃連解毒散空白中添加對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新對(duì)照品做回收率試驗(yàn)來(lái)考察方法的準(zhǔn)確度。儲(chǔ)備液加對(duì)照品做回收率試驗(yàn)來(lái)考察方法的準(zhǔn)確度?；厥章试囼?yàn)溶液配制：取自制黃連解毒散2.0 g，置50 mL量瓶中，取對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品50 mg、鹽酸溴己新對(duì)照品50 mg，分別精密稱定，置上述量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min使溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。平行配制6份，結(jié)果見(jiàn)表2.對(duì)乙酰氨基酚回收率為98.6%，RSD為0.6%；鹽酸溴己新回收率為99.4%，RSD為0.2%。

表2 回收率結(jié)果

2.3.5 耐用性 以系統(tǒng)適用性溶液作為供試品溶液，從柱溫、色譜柱兩個(gè)方面考察方法的耐用性。保持其它檢測(cè)條件不變，調(diào)節(jié)柱溫為20 ℃、25 ℃、30 ℃，發(fā)現(xiàn)隨著柱溫升高，保留時(shí)間提前，但其與相鄰色譜峰的分離度大于1.5；選擇三款不同品牌色譜柱，考察不同色譜柱對(duì)測(cè)定的影響，結(jié)果如表3所示：三種品牌色譜柱均可用于該檢查。結(jié)果表明方法耐用性較好。

表3 三種色譜柱耐用性考察結(jié)果表

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果 取黃連解毒散陽(yáng)性樣品2.0 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇50.0 mL，超聲處理15 min，靜置，濾過(guò)；取續(xù)濾液1.0 mL，置50 mL量瓶中，加初始流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，用建立的HPLC-PDA法對(duì)該樣品中非法添加物進(jìn)行測(cè)定，供試品色譜圖中保留時(shí)間4.72 min的色譜峰與對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品保留時(shí)間一致，18.47 min的色譜峰與鹽酸溴己新對(duì)照品保留時(shí)間一致，且與各自對(duì)照品光譜圖及最大吸收波長(zhǎng)一致，匹配角度均小于匹配閾值，光譜相似。表明供試品中添加了對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新，結(jié)果分別為42.76 mg/g和24.50 mg/g，供試品色譜光譜圖見(jiàn)圖5，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 黃連解毒散陽(yáng)性樣品檢測(cè)結(jié)果

圖5 黃連解毒散陽(yáng)性樣品光譜色譜圖

3 討論與小結(jié)

3.1 流動(dòng)相的選擇 鹽酸溴己新為2個(gè)氨基取代的二溴苯甲胺結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)氨基的2個(gè)氫原子被甲基和環(huán)己基取代，由此可知其在C18固定相中的保留能力較強(qiáng)，應(yīng)用高比例有機(jī)相才能將其洗脫。而對(duì)乙酰氨基酚極性大，在固定相中保留弱，洗脫快?？紤]到對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新的極性差別和黃連解毒散的復(fù)雜成分，在等度條件下實(shí)現(xiàn)三者的分離較困難。因此，需采用梯度洗脫方法實(shí)現(xiàn)對(duì)黃連解毒散中非法添加對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新的檢測(cè)。根據(jù)文獻(xiàn)[3-4]，獸藥中非法添加對(duì)乙酰氨基酚檢查方法常采用高比例磷酸鹽溶液，嘗試調(diào)高有機(jī)相比例以盡快洗脫鹽酸溴己新，但高比例的有機(jī)相易導(dǎo)致磷酸鹽析出堵塞高效液相色譜儀和色譜柱。嘗試以冰醋酸溶液作為水相[2]，加入三乙胺調(diào)節(jié)pH值。選擇不同濃度的冰醋酸溶液，調(diào)至不同的pH值。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，最終確定以1%冰醋酸溶液作為水相，調(diào)節(jié)pH值至4.0，既能實(shí)現(xiàn)有效分離，也能保證峰型良好。

3.2 提取條件的選擇 在非法添加高通量篩查工作中常以甲醇作為溶劑，雖然甲醇提取黃連解毒散有效成分的能力也較強(qiáng)，但考慮到對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新在甲醇中的溶解性良好，因此，仍選取甲醇作為提取溶劑。同時(shí)為了盡可能少提取黃連解毒散的有效成分，并保證對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新完全溶解，因此選擇超聲處理15 min，作為提取條件。

3.3 提取波長(zhǎng)的選擇 在此測(cè)定條件下，對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新對(duì)照品在210～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的最大吸收波長(zhǎng)分別為244.7、248.3、316.1 nm。黃連解毒散中含有黃芩、黃連、黃柏、梔子等，主要有效成分黃芩苷、小檗堿、梔子苷、黃柏酮等均有紫外吸收，最大吸收波長(zhǎng)分別為278、345、238和212 nm[10-11]。為最大限度的排除黃連解毒散有效成分及測(cè)定溶劑等對(duì)紫外吸收的干擾，選擇248 nm作為提取波長(zhǎng)。

3.4 峰純度檢查和光譜相似度檢查 峰純度檢查可以作為判斷色譜峰是否為單一物質(zhì)峰的重要指標(biāo)，無(wú)論是在方法優(yōu)化過(guò)程中，還是在供試品非法添加物檢查中都能發(fā)揮重要作用。根據(jù)色譜工作站處理軟件(Waters Empower3)對(duì)色譜峰的處理結(jié)果顯示對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新的純度角度均小于純度閾值，說(shuō)明未包裹共流出物，在對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新出峰處無(wú)其他干擾峰，均為單一物質(zhì)峰；光譜相似度檢查可以將供試品中相應(yīng)添加物的光譜與對(duì)照品進(jìn)行匹配，以排除保留時(shí)間一致但紫外光譜不同的添加物的干擾。以對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新對(duì)照品溶液作為建立光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的溶液，將供試品中非法添加物色譜峰的光譜與光譜庫(kù)進(jìn)行匹配，匹配角度均小于匹配閾值，說(shuō)明供試溶液中相應(yīng)色譜峰的光譜與對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新對(duì)照品的光譜非常相似。峰純度檢查配合光譜相似度檢查，比單純的供試品與對(duì)照品比對(duì)法更有說(shuō)服力。本文采用峰純度檢查和光譜相似度檢查輔助對(duì)照品比對(duì)方法，對(duì)黃連解毒散中非法添加對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新進(jìn)行確證，結(jié)果可靠。

試驗(yàn)所建立的方法中黃連解毒散各有效成分對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，通過(guò)與對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，以及峰純度檢查和光譜匹相似度檢查來(lái)判定黃連解毒散中是否添加了對(duì)乙酰氨基酚和鹽酸溴己新，方法簡(jiǎn)便、可靠、重復(fù)性好，可廣泛應(yīng)用于獸藥非法添加檢測(cè)工作，為獸藥質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)保障。

[1] 中國(guó)獸藥典委員會(huì). 中國(guó)獸藥典二〇一〇年版二部[S].

[2] 陳睿,田蘭,劉惠軍. 高效液相色譜法測(cè)定鹽酸溴己新及其片劑的含量和有關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析雜志,2007,1:132-134.

[3] 董玲玲,楊星,范強(qiáng),等. 氟喹諾酮類制劑中非法添加對(duì)乙酰氨基酚和安乃近的測(cè)定方法研究[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2015,51(8):93-95.

[4] 郝利華,于曉輝,董玲玲,等. HPLC-PDA法同時(shí)測(cè)定黃芪多糖注射液中非法添加的四種解熱鎮(zhèn)痛類藥物[J]. 中國(guó)獸藥雜志, 2012,46(8):28-31.

[5] 朱小紅,李濤,馬鵬飛, 等. 氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法快速篩查保健食品及中成藥中8種非甾體抗炎藥[J].藥物分析雜志, 2012,32(10):1847-1852.

[6] 劉淑華,趙志剛. HPLC法測(cè)定鹽酸溴己新及其片劑的含量[J].中國(guó)藥事,2008,22(1):68-69.

[7] Pai P N, Rao G K, Murthy M S,etal. Simultaneous determination of salbutamol sulphate and bromhexine hydrochloride in tablets by reverse phase liquid chromatography[J]. Indian J Pharm Sci, 2009, 71(1):53-56.

[8] 謝洪平,徐乃玉,李一林,等.近紅外光譜法快速測(cè)定復(fù)方氯丙那林溴己新膠囊的3種有效成分[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2006, 10 (26):1194-1196.

[9] 劉梅,崔香.流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定鹽酸溴己新[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2011,28(5):2373-2375.

[10]馬志英.獸藥黃連解毒散中黃芩苷和鹽酸小檗堿含量的HPLC法測(cè)定[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2011,41(10):1080-1084.

[11]蘇靜華,張超,孫磊,等.HPLC法同時(shí)測(cè)定黃連上清片的黃芩-黃連-黃柏藥對(duì)中9個(gè)指標(biāo)性成分的含量[J].藥物分析雜志,2015,35(11):1940-1945.

(編輯：陳希)

Simultaneous Determination of Acetaminophen and Bromhexine Hydrochloride Illegally Added in the Huanglian Jiedu Powder by HPLC-PDA

DONG Ling-ling, WANG Jing-wen, GONG Xu-hao,YANG Xing，F(xiàn)AN Qiang*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

A method for the simultaneous determination of acetaminophen and bromhexine hydrochloride illegally added in the Huanglian Jiedu Powder was developed by the high performance liquid chromatography with photo-diode array detector (HPLC-PDA). It was tested with C18 column, using 1% acetic acid solution(adjusting pH to 4.0 by triethylamine) and methanol with gradient elutionas the mobile phase. The scanning wavelength was from 210 to 400 nm.Peak purity test and spectrum similarity test were used to identify the illegally added drugs.The mean recoveries of acetaminophen and bromhexine hydrochloride was 98.6% and 99.4%, respectively.RSDwas 0.6% and 0.2%, respectively. In conclusion, the method is simple, accurate and reliable for the determination of acetaminophen and bromhexine hydrochloride in the Huanglian Jiedu Powder.

acetaminophen; bromhexine hydrochloride;Huanglian Jiedu Powder; HPLC-PDA

"十二五"科技支撐計(jì)劃(2015BAD11B03-4)

董玲玲，碩士研究生，從事藥品檢驗(yàn)工作。

范強(qiáng)。E-mail:fanqiang@ivde.gov.cn

2016-02-15

A

1002-1280 (2016) 05-0019-05

S853.7