大腸桿菌菌體O抗原單因子定型血清的制備

張媛，劉博，王秀麗，張磊，李建，彭國(guó)瑞，辛凌翔，蔣玉文

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

大腸桿菌菌體O抗原單因子定型血清的制備

張媛，劉博，王秀麗，張磊，李建，彭國(guó)瑞，辛凌翔，蔣玉文*

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

為研制大腸桿菌菌體O抗原單因子定型血清，以大腸桿菌參考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)為菌種制備抗原免疫家兔，獲得了定型原血清，并通過比較不同免疫程序及劑量?jī)?yōu)化了定型原血清的制備工藝。進(jìn)而按照優(yōu)化后的定型原血清制備工藝，以大腸桿菌參考菌株CVCC1343(O1)、CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1405(O64)、CVCC1414(O74)、CVCC1439(O100)、CVCC1442(O103)、CVCC1455(O116)、CVCC1466(O128)、CVCC3801(O154)為菌種制備抗原免疫家兔，獲得了10種O抗原型定型原血清。將定型原血清分別與180種微量凝集試驗(yàn)抗原逐一反應(yīng)，明確各原血清與非特異性抗原的交叉凝集價(jià)，通過用吸收抗原對(duì)原血清進(jìn)行吸收及稀釋的方法消除非特異性凝集，最終制備成大腸桿菌菌體O抗原單因子定型血清。血清質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果表明，新制備的單因子定型血清性狀為無色、淡黃色或黃色澄明液體，個(gè)別有少量絮狀物；無菌生長(zhǎng)；特異性良好；凝集效價(jià)為1︰2。研究結(jié)果顯示，制備的大腸桿菌O抗原單因子定型血清具有較好的特異性，可以用于對(duì)臨床分離大腸桿菌進(jìn)行O抗原血清型鑒定。

大腸桿菌；菌體抗原；單因子血清

大腸桿菌病是一類重要的人畜共患病，每一株大腸桿菌只具有單一菌體抗原型(O抗原型)，其O抗原型與菌株致病性相關(guān)，多項(xiàng)關(guān)于致病性大腸桿菌檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中都要求對(duì)其O抗原進(jìn)行血清學(xué)凝集試驗(yàn)，以確定其O抗原型[1-2]。目前丹麥國(guó)家血清研究院(SSI)等國(guó)外研究機(jī)構(gòu)可提供大腸桿菌O抗原單因子定型血清，但由于其血清產(chǎn)品在國(guó)內(nèi)售價(jià)昂貴限制了應(yīng)用。尤其是在獸醫(yī)領(lǐng)域進(jìn)行動(dòng)物源大腸桿菌O抗原型的鑒定，廣大獸醫(yī)工作者仍是使用國(guó)內(nèi)的血清產(chǎn)品[3-6]。但是，現(xiàn)今國(guó)內(nèi)相關(guān)產(chǎn)品由于制備工藝粗糙，產(chǎn)品質(zhì)量與國(guó)外血清仍有較大差距，用國(guó)內(nèi)血清往往鑒定不出菌株的單一血清型，以致目前許多養(yǎng)殖場(chǎng)及獸醫(yī)科研機(jī)構(gòu)面臨著國(guó)內(nèi)血清定不出型，國(guó)外血清買不起的尷尬局面。本課題組擬改進(jìn)大腸桿菌O抗原定型血清制備工藝，制備出可達(dá)到國(guó)外同類產(chǎn)品水平的定型血清。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大腸桿菌參考菌株CVCC1343(O1)、CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1405(O64)、CVCC1414(O74)、CVCC1439(O100)、CVCC1442(O103)、CVCC1455(O116)、CVCC1466(O128)、CVCC3801(O154)，由中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心提供；大腸桿菌臨床分離菌株，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所細(xì)菌制品檢測(cè)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通肉湯、普通瓊脂、硫乙醇酸鹽、酪胨、葡萄糖蛋白胨湯，購(gòu)自北京中海動(dòng)物保健科技公司。

1.1.3 試劑 大腸桿菌O抗原定型血清、180種大腸桿菌菌體微量凝集試驗(yàn)抗原，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所細(xì)菌制品檢測(cè)室提供；大腸桿菌O抗原單因子定型血清，購(gòu)自丹麥國(guó)家血清研究院(SSI)；206佐劑，由金宇保靈生物藥品有限公司惠贈(zèng)；含0.5%石碳酸生理鹽水，購(gòu)自北京中海動(dòng)物保健科技公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康家兔，1.5～2.0 kg，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.5 主要儀器設(shè)備 GNP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；THZ-C型恒溫振蕩器購(gòu)自太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Herasafe KS生物安全柜購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司；離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 方法 本試驗(yàn)利用大腸桿菌參考菌株CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1414(O74)制備免疫抗原，開展了免疫程序的研究，明確了定型原血清制備工藝。進(jìn)而按照定型原血清制備工藝，以大腸桿菌參考菌株CVCC1343(O1)、CVCC1345(O2)、CVCC1350(O7)、CVCC1405(O64)、CVCC1414(O74)、CVCC1439(O100)、CVCC1442(O103)、CVCC1455(O116)、CVCC1466(O128)、CVCC3801(O154)為菌種制備免疫抗原免疫家兔，制備了10種定型原血清。將定型原血清分別與180種微量凝集試驗(yàn)抗原逐一反應(yīng)，明確各原血清與非特異性抗原的交叉凝集價(jià)，通過制備吸收抗原對(duì)血清進(jìn)行吸收及稀釋的方法消除非特異性凝集，制備成大腸桿菌菌體O抗原單因子定型血清。并對(duì)新制備的血清進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)，具體試驗(yàn)方法如下：1.2.1 抗原濃度的確定 將大腸桿菌CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414株凍干菌種接種普通肉湯培養(yǎng)基復(fù)壯后，劃線接種普通瓊脂平皿，37 ℃培養(yǎng)20 h后，取單菌落接種普通肉湯100 mL，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)24 h后，通過活菌計(jì)數(shù)計(jì)算菌液濃度。每株菌均制備3批菌液，通過計(jì)算3株菌共9批菌液的濃度對(duì)數(shù)值的平均值及標(biāo)準(zhǔn)差確定抗原濃度。

1.2.2 抗血清的制備 免疫抗原的制備：將大腸桿菌CVCC1345、CVCC1350、CVCC1414株菌種制備的菌液的濃度調(diào)整至確定的抗原濃度范圍內(nèi)，121 ℃高壓1 h，待其恢復(fù)室溫后，按0.1%加入甲醛溶液，置2～8 ℃保存?zhèn)溆?。油佐劑抗原的制備：免疫抗原與206佐劑按1∶1(V/V)進(jìn)行乳化后置2～8 ℃保存?zhèn)溆?。免疫程序的?yōu)化：每種抗原免疫8只健康非免兔，免疫前采血，分離血清，將血清與180種反應(yīng)抗原進(jìn)行微量凝集試驗(yàn)，反應(yīng)體系為80 μL血清+80 μL抗原，反應(yīng)條件為51±1 ℃過夜。由于與180種抗原反應(yīng)需要約15 mL血清，為了不影響兔體健康狀況，每只兔僅采集少量血液，提取的血清進(jìn)行16倍稀釋后再與抗原反應(yīng)。而后將8只兔隨機(jī)分為2組，4只/組，其中第1組耳靜脈注射免疫抗原，免疫5次，每次間隔7 d，首免劑量為1 mL/只，以后逐次遞增1 mL，每次注射后第7天采血，分離血清，將血清進(jìn)行16倍稀釋后測(cè)血清效價(jià)；第2組皮下注射油佐劑抗原兩次，間隔21 d，第1次免疫1 mL/只，第2次免疫2 mL/只，第2次免疫后第14天起按照與第1組相同的免疫程序用免疫抗原進(jìn)行靜脈注射，分別于第1次免疫后7 d、14 d、21 d、第2次免疫后7 d、14 d及每次注射免疫抗原后第7天采血，分離血清，將血清進(jìn)行16倍稀釋后測(cè)血清效價(jià)。分別計(jì)算每組4只兔血清效價(jià)的幾何平均值，確定定型血清制備的免疫程序。

1.2.3 制備10種定型原血清 按照定型原血清制備工藝制備。

1.2.4 定型原血清交叉凝集素及交叉凝集效價(jià)的測(cè)定 使用U底96孔板將O1、O2、O7、O64、O74、O100、O103、O116、O128、O154 10種未進(jìn)行稀釋的定型原血清分別與180種反應(yīng)抗原進(jìn)行微量凝集試驗(yàn)?？椎壮霈F(xiàn)白色扣狀沉積為陰性，即血清與抗原不凝集；反之，未出現(xiàn)白色扣狀沉積為陽(yáng)性，即血清與抗原凝集；若孔底白色扣狀沉積與凝集顆粒同時(shí)出現(xiàn)，結(jié)果判為可疑。將與多于60種非特異性抗原發(fā)生交叉凝集的原血清淘汰，測(cè)定剩余原血清與非特異性抗原發(fā)生交叉凝集的效價(jià)。在U底96孔板的第1列每孔中加入血清原液160 μL，其余列每孔中加入含0.5 %石碳酸生理鹽水80 μL，然后從第1列吸出80 μl血清加入第2列中進(jìn)行對(duì)倍稀釋，混勻后再?gòu)牡?列吸出80 μL加入第3列中，以此方法進(jìn)行對(duì)倍系列稀釋至第11列，即稀釋210倍，從第11列中吸出80 μL棄去。第12列作為抗原對(duì)照。在每行的12個(gè)孔中加入與之發(fā)生非特異性凝集的抗原80 μL，振蕩均勻后蓋上板蓋，放置于濕盒中，于51 ℃反應(yīng)過夜。反應(yīng)完成后，取出96孔板，對(duì)光觀察結(jié)果。以出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)作為定型原血清與非特異性抗原的交叉凝集價(jià)。

1.2.5 定型原血清交叉凝集素的吸收 選用交叉凝集價(jià)最高的非特異性抗原的生產(chǎn)菌株制備吸收抗原。取凍干菌種分別接種普通肉湯10 mL復(fù)蘇，37 ℃靜置培養(yǎng)20 h，再各劃線接種普通瓊脂平板2付，37 ℃培養(yǎng)20 h。從平板上挑取光滑圓整菌落分別密集劃線接種普通瓊脂中管斜面數(shù)支，37 ℃培養(yǎng) 24 h。每支中管斜面培養(yǎng)物用3 mL 0.5 %石炭酸生理鹽水洗下，分別混合置分裝瓶中，121 ℃高壓1 h后作為吸收抗原，待其恢復(fù)室溫后置2～8 ℃保存?zhèn)溆?。將待吸收血清?.5 %石炭酸生理鹽水進(jìn)行5倍稀釋后，按20 %(V/V)加入吸收抗原，置37 ℃ 200 r/min吸收3 h，然后置2～8 ℃繼續(xù)吸收24 h，3000 r/min離心15 min后吸取上清，作為待檢血清。取80 μL待檢血清與80 μL非特異性抗原通過微量凝集試驗(yàn)方法，測(cè)定待檢血清與非特異性抗原的交叉凝集情況，若非特異性交叉凝集情況已完全消除，則該血清為單因子血清；若待檢血清仍與部分非特異性抗原發(fā)生交叉凝集，但凝集價(jià)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其與特異性抗原的凝集價(jià)，則將血清進(jìn)行適當(dāng)稀釋至非特異性交叉凝集情況完全消除；若待檢血清仍與部分非特異性抗原發(fā)生交叉凝集，且凝集價(jià)和血清與特異性抗原的凝集價(jià)很接近，則需再次選取吸收抗原并再次進(jìn)行交叉凝集素的吸收，直至制備出單因子血清。將制備好的單因子血清效價(jià)稀釋至1︰2，過濾除菌后進(jìn)行無菌檢驗(yàn)[7]。檢驗(yàn)合格的血清定量分裝至玻璃瓶中，1 mL/瓶，置2～8 ℃保存。

1.2.6 單因子血清質(zhì)量檢驗(yàn) 常規(guī)方法進(jìn)行性狀及無菌檢驗(yàn)[7]。采用微量凝集試驗(yàn)方法進(jìn)行特異性檢查及效價(jià)測(cè)定。

1.2.7 鑒定臨床分離菌株血清型 用原有庫(kù)存定型血清、新制備的單因子定型血清、丹麥國(guó)家血清研究院生產(chǎn)的單因子定型血清同時(shí)對(duì)6株E.coli臨床分離菌株進(jìn)行O抗原血清型鑒定。原有庫(kù)存定型血清采用平板凝集與試管凝集相結(jié)合的方法；新制備的單因子定型血清與丹麥國(guó)家血清研究院生產(chǎn)的單因子定型血清采用微量凝集試驗(yàn)方法。

2 結(jié)果

2.1 抗原濃度的確定 3株大腸桿菌制備的9批菌液的濃度對(duì)數(shù)值的平均值為9.902，標(biāo)準(zhǔn)差為0.112，因此，抗原濃度確定為6.2×109～1.0×1010CFU/mL(表1)。

表1 大腸桿菌菌液活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2 免疫前后家兔血清效價(jià)檢測(cè)結(jié)果 免疫前24只家兔血清16倍稀釋液與180種反應(yīng)抗原均不凝集。僅注射免疫抗原及先用油佐劑抗原免疫再注射免疫抗原兩種免疫程序制備的血清效價(jià)差異不明顯，但僅注射免疫抗原免疫周期僅為35 d，而先注射油佐劑抗原再注射免疫抗原的免疫周期需要70 d，況且免疫抗原靜脈免疫4次后，血清效價(jià)即可滿足生產(chǎn)需要(表2)。

表2 免疫后家兔血清效價(jià)幾何平均值

免疫程序Ⅰ為僅注射免疫抗原；免疫程序Ⅱ?yàn)橄茸⑸溆妥魟┛乖僮⑸涿庖呖乖?；?”表示未進(jìn)行檢測(cè)；“-”表示血清與抗原不凝集

將凍干菌種接種普通肉湯培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)20 h，取肉湯培養(yǎng)物劃線接種普通瓊脂平皿，37 ℃培養(yǎng)20 h，取單菌落接種普通肉湯100 mL，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。將菌液濃度調(diào)整至6.2×109～1.0×1010CFU/mL 范圍內(nèi)，121 ℃高壓1 h，待其恢復(fù)室溫后，按0.1 %加入甲醛溶液，此為免疫抗原，置2～8 ℃保存?zhèn)溆谩６夓o脈注射免疫抗原4次，免疫劑量分別為1 mL、2 mL、3 mL、4 mL，每次免疫間隔7 d。最后一次免疫后第4天試血，若血清效價(jià)不低于1∶64對(duì)免疫兔進(jìn)行心臟采血致死，提取血清；若血清效價(jià)低于1∶64，則用相同的抗原5 mL以相同的注射途徑加強(qiáng)免疫一次，并于加強(qiáng)免疫后第4天試血，若血清效價(jià)不低于1∶64則采血；若血清效價(jià)仍低于1∶64則淘汰該兔。

2.3 制備10種定型原血清 按照定型原血清制備工藝，每種抗原免疫2只家兔，免疫CVCC1405(O64)、CVCC1414(O74)及CVCC1442(O103)抗原的家兔各有1只在加強(qiáng)免疫后血清效價(jià)仍低于1∶64予以淘汰。制備了O1、O2、O7、O64、O74、O100、O103、O116、O128、O154共10個(gè)血清型的大腸桿菌菌體O抗原定型原血清。

2.4 定型原血清交叉凝集素及凝集價(jià)的測(cè)定 不同原血清與非特異性抗原交叉凝集情況不一，最少僅與1種非特異性抗原發(fā)生交叉凝集，而最多與168種抗原發(fā)生交叉凝集。即使同一抗原免疫不同家兔獲得的原血清與非特異性抗原的交叉凝集情況也不一致。將與多于60種非特異性抗原發(fā)生交叉凝集的原血清淘汰，測(cè)定剩余原血清與非特異性抗原發(fā)生交叉凝集的效價(jià)(表3)。

表3 原血清與180種反應(yīng)抗原微量凝集試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

加下劃線的抗原表示同一血清型的2份原血清共有的交叉凝集抗原；黑體突出顯示的抗原表示為吸收抗原

2.5 單因子定型血清的制備 采用吸收與稀釋相結(jié)合的方法制備了10種大腸桿菌菌體O抗原單因子定型血清(表4)。

表4 單因子定型血清制備

2.6 單因子血清質(zhì)量檢驗(yàn) 大腸桿菌菌體O抗原單因子定型血清性狀為無色、淡黃色或黃色澄明液體，個(gè)別有少量絮狀物；無菌生長(zhǎng)；特異性良好；凝集效價(jià)為1∶2(表5)。

表5 單因子定型血清檢驗(yàn)結(jié)果

2.7 鑒定臨床分離菌株血清型 用原有庫(kù)存血清對(duì)6株臨床分離菌株進(jìn)行O抗原血清型鑒定，鑒定結(jié)果分別為O2和O74混合型、O103和O154混合型、O7和O116混合型、O1和O128混合型、O2和O64混合型、O100和O154混合型，用新制備的單因子定型血清和丹麥國(guó)家血清研究院生產(chǎn)的單因子定型血清對(duì)6株臨床分離菌株進(jìn)行O抗原血清型鑒定，鑒定結(jié)果均為O2、O103、O116、O1、O2、O100(表6)，表明新制備的定型單因子血清可用于大腸桿菌的O抗原定型，并具有良好的特異性，定型結(jié)果與丹麥血清完全一致。

表6 臨床分離菌株O抗原血清型鑒定結(jié)果

3 討論

典型的脂多糖分子(lipopolysaccharide，LPS)由O特異性多糖鏈、核心多糖和類脂A三個(gè)部分共價(jià)連接而成。O特異性多糖鏈又稱O抗原多糖鏈，簡(jiǎn)稱O抗原。O抗原結(jié)合在核心多糖上，位于脂多糖分子的最外層，是細(xì)菌細(xì)胞主要的表面抗原。O抗原由寡糖單位組成，每個(gè)重復(fù)單位通常由4～6個(gè)糖組成。這些糖通常為中性糖、氨基糖，有時(shí)為罕見的脫氧糖。單糖的不同，單糖數(shù)量的不同，單糖間鍵的不同，和寡糖單位之間聯(lián)接鍵的不同構(gòu)成了多糖的多樣性[8]。大腸桿菌有180種不同結(jié)構(gòu)的O抗原。O抗原構(gòu)成革蘭氏陰性菌的菌體抗原，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。一般合成O抗原的基因成簇分布在細(xì)菌的基因組上，在大腸桿菌中O抗原基因簇位于galF和gnd基因之間[9]。在O抗原基因簇中，一般含有三種基因：?jiǎn)翁呛铣擅富颍腔D(zhuǎn)移酶基因，寡糖單位處理酶基因。寡糖單位處理酶基因帶有特定的序基，或有特殊的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，從而決定了O抗原定型血清的特異性。但是，單糖合成酶基因較高的同源性，又導(dǎo)致了不同型O抗原免疫動(dòng)物制備的抗血清間存在交叉凝集[10]。本研究對(duì)臨床分離菌株O抗原血清型鑒定時(shí)，使用了原有庫(kù)存血清、新制血清和丹麥血清進(jìn)行了比較，其中原有庫(kù)存血清為未進(jìn)行非特異性凝集消除的原血清，用其對(duì)臨床菌株進(jìn)行O抗原血清型鑒定時(shí)常無法確定單一血清型，而新制備的血清以及丹麥血清均為去除抗血清的非特異凝集后的單因子血清，試驗(yàn)結(jié)果表明用此二種血清對(duì)用原有庫(kù)存血清無法定型的菌株進(jìn)行O抗原血清型鑒定，可以鑒定出單一血清型。

抗血清的特異性是決定試驗(yàn)方法可靠性的重要因素，這也是眾多研究者試圖解決的問題。吸收是消除抗血清非特異性凝集的經(jīng)典方法，稀釋的方法也常被應(yīng)用到細(xì)菌抗血清的制備中[11-12]。本研究采用吸收與稀釋相結(jié)合的方法去除抗血清的非特異性凝集，從而獲得特異性較高的單因子血清。

本研究確定了大腸桿菌O抗原定型血清的制備工藝，所制備的O抗原定型血清各項(xiàng)指標(biāo)經(jīng)檢測(cè)均合格，無菌、特異，達(dá)到國(guó)外同類產(chǎn)品水平，可用于大腸桿菌O抗原血清型的鑒定。

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(編輯：李文平)

Preparation of Mono-specific Anti-O-antigen Serum ofE.coli

ZHANG Yuan, LIU Bo, WANG Xiu-li, ZHANG Lei, LI Jian,PENG Guo-rui, XIN Ling-xiang, JIANG Yu-wen*

(ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

Mono-specific anti-O-antigen serum ofEscherichiacoli(E.coli) was developed and prepared in this research. Firstly, antigens were prepared usingE.coli

trains of CVCC1345 (O2), CVCC1350 (O7) and CVCC1414 (O74) respectively and raw sera were obtained from rabbits immunized with the antigens above separately. Productive technology of raw serum was optimized by comparing different immune procedures and doses of the three antigens. Then ten raw sera were harvested using the optimized productive technology by immunizing rabbits with antigens prepared from 10E.colireference strains CVCC1343(O1)，CVCC1345(O2)，CVCC1350(O7)，CVCC1405(O64)，CVCC1414(O74)，CVCC1439(O100)，CVCC1442(O103)，CVCC1455(O116)，CVCC1466(O128)，CVCC3801(O154). Cross-agglutination was detected by reacting sera with 180 micro-agglutination test antigens respectively and eliminated by absorption with non-specific antigens and dilution. Finally mono-specific anti-O-antigen sera ofE.coliwere obtained. Quality evaluation of sera showed that newly prepared mono-specific anti-O-antigen sera were colorless, pale yellow or yellow clear sterilized liquid with good specificity. Only a few had a little floccule. Agglutination titer was 1∶2. All the results suggested that newly prepared mono-specific anti-O-antigen sera could be applied in serotype identification of clinical isolatedE.colistrains with their good specificity.

Escherichiacoli; somatic antigen; mono-specific serum

張媛，副研究員，從事需氧菌類生物制品檢測(cè)工作。

2016-09-18

A

1002-1280 (2016) 11-0009-08

S855.1