化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒檢測(cè)牛肝、牛肉中阿維菌素類藥物的殘留

黨娟，謝體波，劉紅，何進(jìn)，吳紫潔，何方洋

(1.貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司, 貴陽(yáng) 550009; 2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司, 北京 100012)

化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒檢測(cè)牛肝、牛肉中阿維菌素類藥物的殘留

黨娟1，謝體波1，劉紅1，何進(jìn)1，吳紫潔1，何方洋2

(1.貴州勤邦食品安全科學(xué)技術(shù)有限公司, 貴陽(yáng) 550009; 2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司, 北京 100012)

為驗(yàn)證自主研發(fā)的阿維菌素類藥物化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒的檢測(cè)效果，采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法和液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)牛肝、牛肉樣品中阿維菌素類藥物殘留量進(jìn)行檢測(cè)，并比對(duì)2種方法試驗(yàn)結(jié)果的差異。結(jié)果表明：這種試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線IC50值的波動(dòng)范圍為14.805～26.235 ng/L，對(duì)牛肝、牛肉樣品在2、4、8 μg/kg 3個(gè)水平做加標(biāo)回收試驗(yàn)，其回收率均在95.25%～104.55%之間，變異系數(shù)CV均小于15%，對(duì)牛肝、牛肉樣品的最低檢測(cè)限分別為1.463、1.392 ng/kg。這種方法與液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)實(shí)際樣品的陰、陽(yáng)性判斷結(jié)果一致。該方法高效、可靠，可滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)動(dòng)物組織中阿維菌素類藥物殘留的需要。

阿維菌素類藥物；化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法；液相色譜-質(zhì)譜法

阿維菌素類藥物(Avermectins，AVMs)是由放線菌產(chǎn)生的一組大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，包括阿維菌素(AVM)、伊維菌素(IVM)、多拉菌素(DOR)等[1]。商品化的阿維菌素為8個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)相近的化合物中活性最強(qiáng)的兩個(gè)同體系的混合物，是一種優(yōu)良的新型農(nóng)畜兩用抗生素[2-3]。阿維菌素對(duì)絕大多數(shù)有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值動(dòng)物中的寄生蟲和節(jié)肢動(dòng)物均有很強(qiáng)的抑殺作用，其作用機(jī)制獨(dú)特，使用方便，被譽(yù)為近幾十年來抗寄生蟲藥物研究的重大突破[4-6]。阿維菌素作為脂溶性藥物，生物體均能很好地吸收，其廣泛分布于全身組織，且殘留時(shí)間較長(zhǎng)，消除緩慢。阿維菌素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害最為多見，嚴(yán)重者可因頻繁抽搐窒息或出現(xiàn)室顫而死亡[7-8]，因而WHO將其列為高毒化合物，其動(dòng)物源食品中的殘留檢測(cè)工作引起各國(guó)的極大關(guān)注[9]。2002年12月我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)文件規(guī)定在所食用牛的脂肪、肝中的最高殘留量為100 μg/kg，腎的最高殘留量為50 μg/kg，將檢測(cè)阿維菌素類藥物的殘留量列為殘留監(jiān)控重點(diǎn)[10]。

目前，國(guó)外阿維菌素化學(xué)發(fā)光微粒子免疫試劑盒研發(fā)處于成熟期，原裝進(jìn)口的產(chǎn)品價(jià)格昂貴，導(dǎo)致檢測(cè)成本過高。由于阿維菌素類藥物本身有很多種，開發(fā)出可以同時(shí)檢測(cè)阿維菌素類的多種藥物的試劑盒，這種試劑盒在檢測(cè)單一藥物殘留的同時(shí)也可以對(duì)一類藥物的總殘留檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)獸藥殘留檢測(cè)的集成化，大大降低檢測(cè)成本等。常見的檢測(cè)阿維菌素類藥物殘留量的方法主要是以熒光衍生化檢測(cè)為基礎(chǔ)的高效液相色譜法(HPLC)[11-12]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等[13-15]。本研究采用快速篩選方法對(duì)樣品篩查后，檢測(cè)為陽(yáng)性的樣本，再用液質(zhì)聯(lián)用的方法確證，可對(duì)大量樣本實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品與試劑 牛肝、牛肉購(gòu)買于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、菜市場(chǎng)、街邊攤販；阿維菌素類藥物試劑盒(自主研發(fā))；阿維菌素、埃普菌素標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；乙腈(色譜純)；冰乙酸、三乙胺、中性氧化鋁分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 磁免疫全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(自主研發(fā))，高速電動(dòng)勻漿機(jī)(FSH-Ⅱ型，江蘇中大儀器廠)，恒溫振蕩器(CHZ-82A，上海百典儀器設(shè)備有限公司)，高速離心機(jī)(GT16-3A，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)，渦旋儀(QL-901，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，分析天平(ESJ200-4，沈陽(yáng)龍騰電子有限公司)，微量移液器(單道20～200 μL、100～1000 μL、多道250 μL，美國(guó)Thermo公司)，LC-MS液質(zhì)聯(lián)用儀(TSQ Quantum Ultra，美國(guó)Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本，稱取5.0±0.05 g均質(zhì)物至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入10 mL甲醇，用渦旋儀渦動(dòng)1 min，再用振蕩器振蕩10 min；3000 g以上，15 ℃離心10 min；移取上清液20 μL至2 mL聚苯乙烯離心管中，加入復(fù)溶工作液按1∶9體積比進(jìn)行稀釋(20 μL樣本+180 μL復(fù)溶工作液)，取20 μL用于分析。

1.2.2 樣品檢測(cè)方法 分別吸取20 μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣本，然后加入20 μL發(fā)光標(biāo)記物，再加20 μL熒光素標(biāo)記物，充分混勻后，37 ℃溫育15 min；加入包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠80 μL，混勻后在37 ℃溫育5 min；用磁分離架分離5 min，棄上清后用清洗液300 μL沖洗復(fù)合物沉淀；上述清洗步驟重復(fù)2～4次；所得分離好的復(fù)合物直接放入測(cè)量暗箱，加入激發(fā)底物1和激發(fā)底物2，延遲3 s后檢測(cè)發(fā)出的發(fā)光值。

1.2.3 阿維菌素類藥物濃度的計(jì)算 百分吸光率的計(jì)算[16]，標(biāo)準(zhǔn)品或樣品百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度值的平均值除以空白溶液的吸光度值的平均值，再乘以100%，即百分吸光率(%)=B/B0×100%，B-標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液的平均吸光度值，B0-空白溶液的平均吸光度值。將樣品的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品所對(duì)應(yīng)濃度，乘以其對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)即為樣品中阿維菌素類藥物實(shí)際濃度。

1.2.4 試劑盒相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)方法 分別對(duì)試劑盒的特異性、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度進(jìn)行試驗(yàn)[17]，并將其中靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度與LC-MS檢測(cè)的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行對(duì)比。

試劑盒特異性的測(cè)定采用特異性用交叉反應(yīng)率來表示，選擇與阿維菌素類似結(jié)構(gòu)和類似功能的藥物，將不同濃度的阿維菌素類似物，替代阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算交叉反應(yīng)率。

試劑盒檢測(cè)限的確定：分別對(duì)空白牛肝、牛肉樣品進(jìn)行20次檢測(cè)，計(jì)算阿維菌素類藥物的濃度，檢測(cè)限LOD=S+3SD(S為阿維菌素類藥物的濃度平均值，SD為標(biāo)準(zhǔn)差)，即為試劑盒檢測(cè)實(shí)際樣品的最低檢測(cè)限。

試劑盒精密度和準(zhǔn)確度的測(cè)定：在檢測(cè)為陰性的牛肝、牛肉樣本以2.0、4.0、8.0 μg/kg阿維菌素類藥物進(jìn)行添加，每種樣品、每個(gè)濃度各6個(gè)平行，用試劑盒提供的操作方法提取測(cè)定，計(jì)算測(cè)定樣品的回收率。抽取三批試劑盒，每批試劑盒測(cè)定同一份樣品6次，分別計(jì)算測(cè)定樣品的回收率及批內(nèi)、批間變異系數(shù)。1.2.5 試劑盒與GC-MS檢測(cè)結(jié)果比較 隨機(jī)抽取市場(chǎng)上售賣的牛肝、牛肉樣本各20份，分別用試劑盒方法和LC-MS法進(jìn)行檢測(cè)。LC-MS參考《GB/T 20748-2006 牛肝和牛肉中阿維菌素類藥物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》,其中對(duì)動(dòng)物源性食品樣品中阿維菌素類藥物的檢出限為4 μg/kg。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別測(cè)定0、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/L 6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值(A)。以阿維菌素濃度對(duì)數(shù)值(Log)為橫坐標(biāo)，各對(duì)應(yīng)濃度的百分吸光率%為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)(Log)為橫坐標(biāo)，抑制率ln[B/(B0-B)]為縱坐標(biāo)建立雙對(duì)數(shù)直線擬合曲線，數(shù)學(xué)模型為ln[B/(B0-B)]=a+blogC。從圖1和圖2中可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=-2.4134X+4.4618，相關(guān)系數(shù)R2=0.9949，說明試劑盒線性關(guān)系良好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.2 試劑盒靈敏度的確定 由表1可知，阿維菌素類藥物化學(xué)發(fā)光快速檢測(cè)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線IC50值的波動(dòng)范圍為14.805～26.235 ng/L。對(duì)空白牛肝、牛肉樣品進(jìn)行20次檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差即為試劑盒檢測(cè)實(shí)際樣品的最低檢測(cè)限，結(jié)果見表2、表3。由表2、表3可知，本試劑盒對(duì)空白牛肝、牛肉的最低檢測(cè)限為分別為1.463、1.392 ng/kg。

表1 阿維菌素類藥物化學(xué)發(fā)光試劑盒IC50統(tǒng)計(jì)表(ng/L)

表2 空白牛肝測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表(ng/kg)

表3 空白牛肉測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表(ng/kg)

2.3 試劑盒特異性的測(cè)定 試劑盒特異性測(cè)定結(jié)果如表4，由表4可知，該抗體對(duì)阿維菌素類似藥物的交叉反應(yīng)率均較高，對(duì)阿維菌素、埃普菌素具有較好的特異性。

表4 交叉反應(yīng)率

2.4 試劑盒精密度和準(zhǔn)確度的測(cè)定 對(duì)空白牛肝、牛肉以2、4、8 ng/kg 3個(gè)濃度分別阿維菌素、埃普菌素進(jìn)行添加，各6個(gè)平行，按2.2.2 項(xiàng)操作方法測(cè)定，計(jì)算平均回收率，由表5、表6可知，牛肝、牛肉樣品中阿維菌素類藥物3個(gè)濃度添加的平均回收率范圍在95.25%～104.55%之間，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于15%。符合《農(nóng)業(yè)部文件》農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17號(hào)附件2中試劑盒備案參考標(biāo)準(zhǔn)。

表5 牛肝樣品準(zhǔn)確度與精密度測(cè)定結(jié)果表

表6 牛肉樣品準(zhǔn)確度與精密度測(cè)定結(jié)果表

2.5 試劑盒與儀器方法檢測(cè)結(jié)果比較 試劑盒與儀器方法檢測(cè)結(jié)果見表7，儀器方法中牛肝、牛肉的檢測(cè)限(0.5 μg/kg)為陽(yáng)性判定線，低于陽(yáng)性判定線的值，檢測(cè)結(jié)果以“-”表示，高于或等于陽(yáng)性判定線的值以實(shí)際檢測(cè)結(jié)果表示。對(duì)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和菜市場(chǎng)的牛肝、牛肉2種樣品結(jié)果可知，檢測(cè)結(jié)果基本低于國(guó)家最高殘留量。由表7可知，化學(xué)發(fā)光微粒子試劑盒檢測(cè)結(jié)果與儀器方法法檢測(cè)結(jié)果相吻合，表明這種試劑盒方法的準(zhǔn)確度達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)水平。

表7 試劑盒與儀器方法檢測(cè)結(jié)果的比較(μg/kg)

注：儀器檢測(cè)結(jié)果包含阿維菌素和埃普菌素

3 討論與小結(jié)

目前市場(chǎng)上有多家國(guó)內(nèi)外廠家生產(chǎn)銷售阿維菌素試劑盒，商品化的試劑盒多采用酶聯(lián)免疫法，國(guó)內(nèi)阿維菌素ELISA產(chǎn)品處于成熟期[18]。自主研發(fā)生產(chǎn)的阿維菌素類藥物試劑盒采用直接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法，用包被有羊抗FITC單克隆抗體的順磁性納米微珠磁分離復(fù)合物，檢測(cè)的靈敏度與可測(cè)范圍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于酶聯(lián)免疫法，兼具ELISA法的簡(jiǎn)便操作及短時(shí)反應(yīng)等性能，且可檢測(cè)單一藥物或一類藥物的總殘留，實(shí)現(xiàn)農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)的集成化；與傳統(tǒng)色譜質(zhì)譜類儀器分析方法相比，檢測(cè)結(jié)果一致，但樣品前處理方法簡(jiǎn)單，后續(xù)檢測(cè)實(shí)現(xiàn)大量樣本的同步檢測(cè)，分析周期短、檢測(cè)設(shè)備投入少[19]。現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)化學(xué)發(fā)光產(chǎn)品處于導(dǎo)入期或成長(zhǎng)期，基本依賴進(jìn)口。

本研究采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法對(duì)牛肝、牛肉樣品中阿維菌素類藥物殘留量進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證自主研發(fā)生產(chǎn)的阿維菌素類藥物化學(xué)發(fā)光微粒子免疫試劑盒檢測(cè)效果，并將其檢測(cè)效果與儀器檢測(cè)方法做對(duì)照。結(jié)果表明，阿維菌素類藥物化學(xué)發(fā)光微粒子免疫試劑盒檢測(cè)靈敏度高，牛肝、牛肉樣品回收率均在95.25%～104.55%之間，變異系數(shù)CV均小于15%，對(duì)牛肝、牛肉樣品的最低檢測(cè)限分別為1.463、1.392ng/kg，低于國(guó)家規(guī)定最高殘留量。

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(編輯：侯向輝)

Detection of Avermectins Residues in Beef Liver and Beef Muscle by Using Chemiluminescence Immune Kit

DANG Juan1, XIE Ti-Bo1, LIU Hong1, HE Jin1, WU Zi-Jie1, HE Fang-Yang2

(1.GuizhouKwinbonFoodSafetyScience-TechnologyCoLtd.,Guiyang550009,China; 2.BeijingKwinbonBiotechnologyCoLtd.,Beijing100012,China)

To verify the independence R & D of avermectins chemiluminescence immunoassay kit，the method of chemiluminescent microparticle immunoassay and liquid chromatography-mass spectrometry method were used to detect the residues of avermectinsin beef livers and beef muscles,and compared the difference between the results of two methods.The results showed that IC50value of the kits standard curve was 14.805～26.235 ng/L, the recovery of the method was in the range of 95.25%～104.55%, and the coefficient of variationCVwas less than 15%,the limits of detection of the kit for the beef liver and beef muscle were 1.463 ng/kg and 1.392 ng/kg; The results of kit method was well consistent with as the results of LC-MS method.This kit method was efficient, reliable and could meet the on-site rapid detection of animal tissue avermectins residues needs.

avermectins(AVMs)；chemiluminescence micro immunoassay；liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS)

2015貴州省科技技術(shù)項(xiàng)目(黔科合NY[2015]3016-1號(hào))；2014貴州省科技成果轉(zhuǎn)化引導(dǎo)基金計(jì)劃(黔科合成轉(zhuǎn)字[2014]5104號(hào))

黨娟,碩士,從事食品安全快速檢測(cè)技術(shù)的研究與開發(fā)。E-mail：853625823@qq.com

2016-01-04

A

1002-1280 (2016) 03-0039-06

S859.84