副結(jié)核分枝桿菌MAP0862、MAP1345基因的串聯(lián)表達(dá)及其在間接ELISA中的初步應(yīng)用

張振，張閣，彭永，彭小薇，孫翠麗，常維山，朱良全*，丁家波*

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安270018；2. 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

副結(jié)核分枝桿菌MAP0862、MAP1345基因的串聯(lián)表達(dá)及其在間接ELISA中的初步應(yīng)用

張振1，2，張閣2，彭永2，彭小薇2，孫翠麗1，2，常維山1，朱良全2*，丁家波2*

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東泰安270018；2. 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081)

為探索副結(jié)核特異性蛋白MAP0862與MAP1345在牛副結(jié)核病血清學(xué)診斷中的作用，將通過串聯(lián)表達(dá)獲得的融合蛋白MAP0862-1345純化定量后包被酶標(biāo)板，經(jīng)過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，初步建立了基于融合蛋白MAP0862-1345的間接ELISA診斷方法。使用建立的ELISA方法對牛副結(jié)核病陽性血清、牛結(jié)核病陽性血清、牛布病陽性血清、卡介苗免疫牛血清、健康牛血清檢測的結(jié)果表明其具有較好的特異性；使用該方法與IDEXX副結(jié)核病抗體檢測試劑盒共同對300份臨床血清樣本檢測，總符合率為92.7%。

副結(jié)核分枝桿菌；串聯(lián)表達(dá)；間接ELISA

副結(jié)核病是由副結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性消化系統(tǒng)疾病，主要引起反芻動物慢性腸炎以及生產(chǎn)性能下降。目前該病在全世界范圍內(nèi)流行，尚無有效的治療方法，最好的控制方法就是對畜群進(jìn)行嚴(yán)格的檢疫并及時(shí)淘汰陽性牛[1]。對于副結(jié)核病檢疫診斷，常用方法為ELISA與皮膚變態(tài)反應(yīng)。但由于副結(jié)核分枝桿菌屬于禽結(jié)核分枝桿菌屬的一個分支，其與其他禽結(jié)核分枝桿菌存在基因與抗原表位的交叉，如皮膚變態(tài)反應(yīng)用的副結(jié)核抗原與禽結(jié)核菌素(PPD-A)、牛結(jié)核菌素(PPD-B)、環(huán)境分枝桿菌存在共同抗原[2]。因此尋找具有鑒別診斷作用的副結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白，并以其為基礎(chǔ)建立ELISA方法是診斷副結(jié)核病的有效途徑。

關(guān)于運(yùn)用副結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白建立ELISA方法幾無報(bào)道，不過目前通過比較基因組學(xué)已經(jīng)鑒定出至少13個副結(jié)核特異性抗原[3]。實(shí)驗(yàn)室前期已原核表達(dá)獲得了5個特異性蛋白，初步試驗(yàn)表明MAP0862與MAP1345具有一定的血清學(xué)鑒別診斷效果。目前關(guān)于副結(jié)核蛋白的研究較少，已有MAP0862蛋白的抗原性報(bào)道，然而對于MAP0862與MAP1345蛋白的結(jié)構(gòu)、功能至今未有相關(guān)報(bào)道[4]。為了探索前期發(fā)現(xiàn)的具有較好診斷作用的兩種蛋白在協(xié)同作用下的鑒別診斷中應(yīng)用價(jià)值，本研究通過引入一段柔性氨基酸將副結(jié)核特異性蛋白MAP1345與MAP0862進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，并對其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了抗原性分析，將表達(dá)產(chǎn)物純化復(fù)性后作為ELISA包被抗原，進(jìn)一步優(yōu)化了在ELISA反應(yīng)中的各項(xiàng)參數(shù)，為后續(xù)系統(tǒng)建立ELISA方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 副結(jié)核分枝桿菌菌株P(guān)18(C68678)，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。原核表達(dá)載體pET-32a由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 Herrold蛋卵黃瓊脂培養(yǎng)基購自BD公司；DNA聚合酶Q5、限制性內(nèi)切酶EcoR I、XhoI、T4 DNA Ligase購自NEB公司；小量質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒、片段回收試劑盒購自Takara公司；HRP標(biāo)記的兔抗牛酶標(biāo)抗體購自SIGMA公司。

1.1.3 包涵體蛋白純化溶液配制 包涵體洗滌液 1: 20 mmol/LTris，5 mmol/L EDTA，0.5% Triton X-100；包涵體洗液2: 20 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA，2 mol尿素；變性液：20 mmol/L Tris，5 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素；復(fù)性液：20 mmol/L Tris，0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，1%甘氨酸，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L谷胱甘肽。以上溶液配制后使用鹽酸調(diào)pH值至7.4。

1.1.4 血清 牛副結(jié)核病陽性血清、牛結(jié)核病陽性血清、牛布病陽性血清、卡介苗免疫牛血清、健康陰性牛血清(副結(jié)核病、結(jié)核病及布病抗體均為陰性)，由本實(shí)驗(yàn)室鑒定保存。臨床牛血清采集自山東某牛場。

1.2 方法

1.2.1 菌種復(fù)蘇與基因組提取 無菌開啟一支凍存的P18副結(jié)核菌種，用0.5 mL滅菌生理鹽水將菌體重懸后接種于一支Herrold蛋卵黃瓊脂培養(yǎng)基斜面，置于37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)21～35 d，待表面長出白色顆粒狀菌苔，用5 mL滅菌生理鹽水將菌體洗下后，80 ℃滅活2 h。接著將滅活菌體轉(zhuǎn)移至羅氏真空磁珠管中，用組織研磨機(jī)上(1 000 r/min，10 s)將菌體充分震蕩打散，然后按照Takara細(xì)菌基因組DNA小量純化試劑盒提取革蘭氏陽性菌的步驟提取P18全基因組。1.2.2 引物設(shè)計(jì) 分別從GenBank上調(diào)取MAP0862與MAP1345基因序列，使用DNASTAR軟件分析兩個序列中包含抗原位點(diǎn)的疏水性區(qū)域，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)針對兩段基因的特異性引物。序列見表1。

1.2.3 片段擴(kuò)增與目的片段回收 以副結(jié)核分枝桿菌P18基因組作為模板，使用引物P1與P2擴(kuò)增MAP1345基因，使用引物P3與P4擴(kuò)增MAP0862基因，反應(yīng)組分為：2×Master Mix 25 μL，上下游引物(10 mmol/L)各2.5 μL，基因組2 μL，加滅菌ddH2O至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃ 30 s ; 98 ℃下劃線部分為酶切位點(diǎn)，加粗部分為引入的柔性氨基酸序列10 s，54 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s(30個循環(huán)); 72 ℃ 10 min延伸PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后使用膠回收試劑盒對兩個產(chǎn)物進(jìn)行回收。

表1 特異性引物序列

1.2.4 重疊PCR 使用分光光度計(jì)對兩個PCR回收產(chǎn)物測定濃度后按照1∶1等量混合作為PCR反應(yīng)模板，使用引物P1與P4對模板進(jìn)行擴(kuò)增, PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃30 s；98 ℃ 10 s，54 ℃ 20 s， 72 ℃ 40 s(30個循環(huán))；72 ℃ 10 min延伸PCR反應(yīng)，獲得MAP1345與MAP0862的融合基因。

1.2.5 重組質(zhì)粒構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá) 使用限制性內(nèi)切酶EcoR I、XhoI分別對融合基因MAP1345-0862與原核表達(dá)載體pET-32a進(jìn)行雙酶切后回收目的片段，按照一定比例將兩種回收產(chǎn)物混合后使用T4 DNA Ligase進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單個菌落搖菌后提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將含陽性質(zhì)粒的重組菌轉(zhuǎn)接含氨芐抗性的新鮮LB培養(yǎng)基，以37 ℃、150 r/min搖菌4～6 h，當(dāng)OD450 nm為0.6時(shí)加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，繼續(xù)搖菌4 h后收集菌體。

1.2.6 SDS-PAGE鑒定 取誘導(dǎo)后菌液超聲破碎(30%功率；超聲2 s；暫停2 s；超聲10 min)。分別取標(biāo)簽蛋白，全菌蛋白，超聲后沉淀，超聲后上清進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，驗(yàn)證目的蛋白大小以及可溶性。

1.2.7 包涵體形式目的蛋白純化 超聲破碎后的菌體經(jīng)4 ℃12000 r/min離心20 min收集沉淀菌體，每克菌體使用40 mL包涵體洗液1重懸后，經(jīng)4 ℃12000 r/min離心25 min 收集沉淀；沉淀用40 mL包涵體洗液2重懸，攪拌溶解1 h，經(jīng)4 ℃12000 r/min離心25 min 后棄去上清；沉淀加入40 mL含8 mol/L尿素的變性液室溫?cái)嚢? h ，4 ℃12000 r/min離心25 min；吸取上清溶液使用0.45 μm濾器過濾后裝于處理后的透析袋內(nèi)，然后置4 ℃依次使用含8、6、4、2、0 mol/L尿素的復(fù)性液進(jìn)行透析復(fù)性。復(fù)性蛋白使用Hiprep 26/10 Desalting脫鹽后置換到PBS溶液中[5]。

1.2.8 SDS-PAGE與Western Blot鑒定 分別取誘導(dǎo)重組菌超聲后上清、超聲后沉淀、純化后的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，一塊凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色；另一塊凝膠進(jìn)行Western Blot，將純化后的目的蛋白使用伯樂凝膠轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，使用牛副結(jié)核病陽性血清作為一抗，1∶5000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗牛酶標(biāo)抗體作為二抗，進(jìn)行Western Blot鑒定。

1.2.9 間接ELISA條件優(yōu)化以及方法的建立

1.2.9.1 使用棋盤法確定最佳抗原包被條件以及最佳血清稀釋度 將純化定量后的重組蛋白MAP0862-1345用1×碳酸鹽緩沖液按照200、100、50、25 ng/mL四個稀釋度進(jìn)行稀釋，將稀釋后的重組蛋白按每孔100 μL加入酶標(biāo)板后于4 ℃包被過夜，使用PBST緩沖液洗板三次；每孔加入100 μL含5%脫脂奶粉的PBST 溶液于37 ℃封閉2 h后，使用PBST緩沖液洗板三次。將陰陽性對照血清按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200四個稀釋度進(jìn)行稀釋后以每孔100 μL加入酶標(biāo)板中，37 ℃作用30 min，PBST溶液洗板三次；每孔加入100 μL1∶10000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗牛酶標(biāo)抗體，37 ℃作用30 min，使用PBST溶液洗板三次；每孔加入100 μL TMB顯色液室溫避光顯色15 min，然后每孔加入50 μL 1 mol/L HCL終止反應(yīng)，測定OD450 nm值，以陽性血清與陰性血清的最適OD450 nm比值(P/N)所對應(yīng)的抗原包被濃度與血清稀釋度作為最佳濃度。

1.2.9.2 最佳封閉條件的確立 在確定最佳抗原包被濃度與血清稀釋度后，分別使用含5%脫脂奶粉、5%馬血清、5%明膠的PBST溶液作為封閉液，進(jìn)一步優(yōu)化ELISA參數(shù)，以背景值最低的封閉液作為最佳封閉液。

1.2.9.3最佳酶標(biāo)抗體濃度的確立 按照優(yōu)化后的上述ELISA條件，用PBST將HRP標(biāo)記的兔抗牛酶標(biāo)抗體分別進(jìn)行1∶2500、1∶5000、1∶10000、1∶20000稀釋后進(jìn)行ELISA反應(yīng)，選擇P/N值最大時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度作為最適工作濃度。

1.2.9.5 特異性試驗(yàn) 按照優(yōu)化后的ELISA方法，取實(shí)驗(yàn)室保存的牛副結(jié)核病陽性血清、牛結(jié)核病陽性血清、牛布病陽性血清、卡介苗免疫牛血清、健康牛血清進(jìn)行檢測以驗(yàn)證基于不同抗原的ELISA實(shí)驗(yàn)的特異性。

1.2.9.6 符合性試驗(yàn) 按照建立的ELISA方法對300份臨床采集的牛血清進(jìn)行檢測，將檢測結(jié)果與IDEXX副結(jié)核病抗體ELISA檢測試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行比對，計(jì)算二者符合率。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增與重組質(zhì)粒雙酶切鑒定 經(jīng)過PCR擴(kuò)增，成功獲得了長度為1032 bp的MAP0862基因與555 bp的MAP1345基因，將兩段基因混合后作為模板，經(jīng)過重疊PCR，成功獲得了長度為1617 bp的目的片段MAP1345-0862(圖1)。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和XhoI雙酶切，電泳可見有兩條符合預(yù)期大小的條帶(圖2)，質(zhì)粒送公司測序后將結(jié)果與MAP0862基因及MAP1345基因進(jìn)行序列比對，符合率均為100%，表明成功構(gòu)建了MAP0862-1345重組質(zhì)粒，標(biāo)注為pET-MAP0862-1345。

M：DL2000 Marker；1:MAP0862PCR產(chǎn)物；2:MAP1345 PCR產(chǎn)物； 3:MAP1345-0862 融合PCR產(chǎn)物圖1 MAP0862、MAP1345、MAP0862-1345 PCR擴(kuò)增圖

M：DL5000 Marker；1,2:重組質(zhì)粒MAP0862-1345雙酶切鑒定圖2 重組質(zhì)粒pET-MAP0862-1345雙酶切鑒定圖

2.2 重組蛋白SDS-PAGE以及Western Blot鑒定SDS-PAGE凝膠電泳后可見重組菌表達(dá)的目的蛋白主要以包涵體形式存在，使用尿素梯度透析的方法對蛋白進(jìn)行復(fù)性，脫鹽及純化。純化后的目的蛋白大小與預(yù)期相一致，約78 kD(圖3)。純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，進(jìn)行Western Blot分析，結(jié)果在預(yù)期的78 kD處出現(xiàn)雜交條帶，表明純化后的重組蛋白可以和牛副結(jié)核病陽性血清發(fā)生特異性免疫學(xué)反應(yīng)，具備良好的反應(yīng)原性(圖4)。

2.3 ELISA方法的建立

2.3.1 優(yōu)化后的ELISA條件 經(jīng)過優(yōu)化后的ELISA反應(yīng)條件如下：重組蛋白使用碳酸鹽緩沖液稀釋至25 ng/mL，每孔100 μL,4 ℃包被過夜；PBST洗板3次后，加入含5%明膠的PBST溶液進(jìn)行4 ℃過夜封閉；PBST洗板3次，加入使用PBST進(jìn)行1∶100稀釋的待檢血清，37 ℃孵育30 min；PBST洗板3次后，加入使用PBST進(jìn)行1∶10000稀釋的兔抗牛酶標(biāo)抗體，37 ℃孵育30 min；PBST洗板3次后，每孔加入100 μL TMB顯色液，室溫避光顯色10 min，每孔加入50 μL 1 mol/L HCL終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀讀取OD450 nm數(shù)值。

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：重組菌超聲后上清；2：重組菌超聲后沉淀；3：純化后的MAP1345-0862融合蛋白圖3 重組蛋白的SDS-PAGE分析

M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：純化后的MAP1345-0862融合蛋白圖4 重組蛋白MAP0862-1345的Western Blot分析

2.3.3 特異性試驗(yàn) 使用初步建立的基于副結(jié)核特異性蛋白MAP0862-1345的間接ELISA方法對經(jīng)鑒定保存的血清進(jìn)行檢測以驗(yàn)證該方法的特異性，其中副結(jié)核病陽性牛血清18份、布病陽性牛血清10份、牛結(jié)核病陽性血清15份、卡介苗免疫牛血清10份、牛健康陰性血清58份進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。

表2 重組蛋白ELISA特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 符合性試驗(yàn) 使用建立的ELISA方法對300份牛血清進(jìn)行檢測，并將結(jié)果與IDEXX牛副結(jié)核病抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果進(jìn)行比對，分別計(jì)算陽性符合率、陰性符合率以及總符合率，結(jié)果見表3。陽性符合率：19/26*100%=73.1%；陰性符合率：259/274*100%=94.5%；總符合率：(19+259)/300*100%=92.7%。

表3 重組蛋白ELISA符合率結(jié)果

3 討論

近年來，副結(jié)核病帶來生產(chǎn)上嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，以及潛在的人類生物安全威脅，引起研究者廣泛關(guān)注[6]。鑒于機(jī)體感染副結(jié)核后存在細(xì)胞免疫與體液免疫分離現(xiàn)象，并且副結(jié)核分枝桿菌與牛結(jié)核分枝桿菌以及其他環(huán)境分枝桿菌存在共同抗原[7]，因此本研究中挖掘并驗(yàn)證具有鑒別診斷價(jià)值的串聯(lián)表達(dá)抗原，初步建立適合不同感染階段的血清學(xué)診斷的ELISA方法，具有重要意義。

雖然重組蛋白存在著抗原成分明確、易于質(zhì)控與無生物危害的優(yōu)點(diǎn)[8]。但如何保證兩個重組蛋白的構(gòu)象與功能是面臨的難點(diǎn)，我們通過引入一段序列為G4S的柔性氨基酸將兩個蛋白進(jìn)行連接，從而確保兩個蛋白的正確構(gòu)象和功能[9]。Western Blot結(jié)果進(jìn)一步證明經(jīng)復(fù)性后的串聯(lián)表達(dá)重組蛋白MAP0862-1345能與牛副結(jié)核病陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)中將復(fù)性后所獲的具有較高純度的可溶性蛋白作為ELISA包被抗原，并優(yōu)化篩選了ELISA反應(yīng)參數(shù)，初步建立了基于副結(jié)核特異性蛋白MAP0862-1345的間接ELISA方法。但通過對58份健康牛血清的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)確定的臨界值(OD450 nm為0.556)較高，主要原因可能由于純化后的目的蛋白仍存在部分表達(dá)宿主菌BL21的蛋白，另外待檢牛血清中可能存在與抗原蛋白含有交叉表位的大腸桿菌的抗體。比如在臨床血清檢測中，我們發(fā)現(xiàn)部分布病牛結(jié)核病陽性血清、牛結(jié)核陽性血清、卡介苗免疫牛血清被檢測為陽性。

另外，IDEXX副結(jié)核病抗體檢測試劑盒與本研究建立的方法檢測300份臨床血清樣本，陽性符合率僅為73.1%，推斷主要原因：一是副結(jié)核病抗體陽性樣本較少導(dǎo)致陽性符合率低，如300份臨床血清用IDEXX副結(jié)核病抗體檢測試劑盒僅檢測到26份副結(jié)核病抗體陽性血清；二是牛感染副結(jié)核后的不同時(shí)間段，其MAP0862蛋白、MAP1345蛋白的表達(dá)量不同，導(dǎo)致血清中針對該蛋白的特異性抗體含量不同，而當(dāng)?shù)鞍妆磉_(dá)量較低時(shí)應(yīng)用該方法則可能無法有效檢出抗體。

總之，建立的MAP0862-1345間接ELISA方法，仍需要大量背景清楚的，不同感染階段的人工感染血清樣本進(jìn)一步驗(yàn)證和完善。鑒于當(dāng)前沒有一種成熟的商品化副結(jié)核病血清學(xué)檢測方法能夠準(zhǔn)確診斷不同感染期的血清樣本[10]，因此針對可疑牛副結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室確診仍需要綜合采用多種不同檢測方法。

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(編輯：李文平)

Expression ofMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosisMAP0862, MAP1345 and Primary Application in Indirect ELISA

ZHANG Zhen1,2,ZHANG Ge2,PENG Yong2, PENG Xiao-wei2, SUN Cui-li1,2,CHANG Wei-shan1, ZHU Liang-quan2*, DING Jia-bo2*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShandongAgricultureUniversity,Taian,Shandong270018,China; 2.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

To explore the effect of MAP0862 and MAP1345 in the diagnosis ofBovineparatuberculosis,the specific protein acquired by tandem expression was used as coating antigen after purified and quantification, an indirect ELISA was preliminary established after a series of optimization. The specificity of this method was verified by MAP antisera, Brucella antisera, Bovine tuberculosis(TB) antisera, BCG antisera and negative sera. The detection result of 300 sera showed that the coincidence rate of MAP0862-1345 indirect ELISA with commercial kit was 92.7%.

Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis; tandem expression;indirect ELISA

北京市科技新星計(jì)劃(xx2013099)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)人才支撐計(jì)劃項(xiàng)目

張振，碩士研究生，從事重要人畜共患病診斷技術(shù)和新型疫苗研制方面的研究。

丁家波，E-mail:dingjiabo@126.com；朱良全，E-mail:zhuliangquan@ivdc.org.cn

2016-04-26

A

1002-1280 (2016) 06-0016-06

S852.5