奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌裂解性噬菌體裂解酶LysIMEP5基因的克隆及序列分析

張倩，張湘莉蘭，孫耀強(qiáng)，于會(huì)舉，張培生，劉鴿，屈勇剛*，童貽剛*，李巖

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，北京 100071；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，烏魯木齊 830063)

奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌裂解性噬菌體裂解酶LysIMEP5基因的克隆及序列分析

張倩1，張湘莉蘭2，孫耀強(qiáng)1，于會(huì)舉1，張培生1，劉鴿1，屈勇剛1*，童貽剛2*，李巖3

(1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，北京 100071；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧獸醫(yī)工作總站，烏魯木齊 830063)

為了克隆奶牛乳房炎金黃色(葡萄球菌裂解性噬菌體裂解酶LysIMEP5基因，分析其生物信息學(xué)特性，以本實(shí)驗(yàn)室分離的奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌裂解性噬菌體vB_SauS_IMEP5 為材料，根據(jù)其全基因組學(xué)信息，獲取裂解酶基因序列，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物。采用PCR方法擴(kuò)增并克隆LysIMEP5基因，通過(guò)BLAST進(jìn)行序列比對(duì)分析，利用在線軟件對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。成功克隆到裂解酶LysIMEP5基因，測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNAMAN比對(duì)與原序列完全匹配，無(wú)任何基因突變，同源性分析顯示，與已報(bào)道的金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶相似性最高為83.1% ；裂解酶LysIMEP5 基因序列全長(zhǎng)1371 bp，共編碼456個(gè)氨基酸，為親水性蛋白，分子質(zhì)量為51.717 kDa，理論等電點(diǎn)為9.70； LysIMEP5同時(shí)存在CHAP片段和Amidase-3片段；該蛋白無(wú)跨膜區(qū)，無(wú)信號(hào)肽，以無(wú)規(guī)則卷曲為主。從奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌裂解性噬菌體中成功克隆出LysIMEP5基因，通過(guò)對(duì)該蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析為后續(xù)克隆表達(dá)及開(kāi)發(fā)新型綠色抑菌劑奠定了基礎(chǔ)。

奶牛乳房炎；金黃色葡萄球菌噬菌體；裂解酶；克??；蛋白結(jié)構(gòu)

噬菌體裂解酶(Bacteriophage lysins)是噬菌體在感染細(xì)菌后期表達(dá)的一類(lèi)細(xì)胞壁水解酶，可分解宿主菌細(xì)胞壁肽聚糖上的酰胺鍵或肽內(nèi)氨基酸殘基間的連接鍵，故這類(lèi)酶又被稱(chēng)為內(nèi)溶素或溶胞壁酶，為雙鏈?zhǔn)删w獨(dú)有[1]。因其作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，破壞細(xì)菌的保護(hù)層可作為一種特殊的生物殺菌物，有著其他化學(xué)藥物所沒(méi)有的優(yōu)勢(shì)：專(zhuān)一性強(qiáng)、安全性高、高效快速、基因修飾簡(jiǎn)單。裂解酶已作為一種新型殺菌制劑被廣泛運(yùn)用于化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌感染的治療[2-4]。由于裂解酶專(zhuān)一性強(qiáng)，不易產(chǎn)生耐藥性的特點(diǎn)和如今濫用抗生素的現(xiàn)狀，裂解酶作為新型抗菌藥物的研發(fā)越來(lái)越受到科研工作者的關(guān)注，尤其是對(duì)裂解酶裂解耐藥菌株及不宜治療的細(xì)菌性感染病原體的研究。有些研究者還基于此研究方向進(jìn)行了基礎(chǔ)應(yīng)用研究，例如對(duì)裂解酶結(jié)構(gòu)蛋白的預(yù)測(cè)研究[5-7]與裂解酶相關(guān)的穿孔素分子作用機(jī)制的研究[8]。噬菌體裂解酶在結(jié)構(gòu)上具有相似性，均含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，即一個(gè)決定該酶催化活性的N-端結(jié)構(gòu)域(催化域)和一個(gè)決定細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)的C端結(jié)構(gòu)域，它們之間由一個(gè)小片段連接。同一類(lèi)裂解酶的催化域高度保守，而細(xì)胞結(jié)合域可變。這表明裂解酶的結(jié)合域的特殊糖類(lèi)是決定噬菌體特異性的關(guān)鍵。因此，裂解酶作為新型抗菌藥物具有一定的優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)的研究使人們對(duì)噬菌體裂解酶的結(jié)構(gòu)特征、抗菌機(jī)制及抗菌活性等有了一定的認(rèn)識(shí)。目前國(guó)內(nèi)外已有一些利用噬菌體裂解酶作為新型抗菌藥物的試驗(yàn)及其成果的報(bào)道。Loeffler等[3]研究發(fā)現(xiàn)噬菌體裂解酶Pal可在體外高效裂解15種常見(jiàn)類(lèi)型的肺炎鏈球菌，包括青霉素抗性菌株。Gong等[9]從腸球菌噬菌體中分離出能有效地殺死腸球菌(包括抗萬(wàn)古霉素的菌株)的一種溶菌酶lysefm5。本研究擬以奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌噬菌體的基因組為模板，設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增裂解酶基因并構(gòu)建裂解酶克隆菌株，結(jié)合裂解酶蛋白的結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)與分析，為裂解酶的表達(dá)純化及生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒 奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌噬菌體vB_SauS_IMEP5由本實(shí)驗(yàn)室分離、純化、鑒定并由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所測(cè)序；大腸桿菌DH5a,北京全式金生物公司；pMD19-T,寶生物(大連)工程有限公司(TaKaRa)。

1.2 試劑和儀器 限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ和EcoRⅠ, SolutionⅠ和核酸提取試劑盒,寶生物(大連)工程有限公司(TaKaRa)，Trans5K DNA Marker,北京全式金生物公司，質(zhì)粒小提試劑盒和凝膠回收試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司，氨節(jié)青霉素(Amp),北京鼎國(guó)生物工程公司；CR22E高速冷凍離心機(jī)(HITACHI),日立公司，PCR擴(kuò)增儀,Bio-Rad公司，電泳凝膠成像儀,PhotoFilm 公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌噬菌體vB_SauS_IMEP5全基因序列分析的結(jié)果，針對(duì)其裂解酶基因序列，應(yīng)用Primer5.0設(shè)計(jì)特異性引物,并在引物中包引入XhoⅠ和EcoRⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1371 bp。引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成，引物序列為：

LysIMEP5-F：5-CGGAATTCATGGCAGTTACAAAAACAAAAGC-3'，

LysIMEP5-R：5'-CCCTCGAGTTATTTCTTCCACTTAATCTTGCC-3'

1.4 噬菌體vB_SauS_IMEP5基因組的提取 將實(shí)驗(yàn)室保存的噬菌體vB_SauS_IMEP5接種于已裝有宿主菌的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)6～8 h，10000 r/min 離心10 min 取上清，參照病毒核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取噬菌體vB_SauS_IMEP5基因組DNA。提取的DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目的基因的克隆

1.5.1 目的片段PCR的擴(kuò)增 以噬菌體vB_SauS_IMEP5的基因組DNA為模板，LysIMEP5-F和LysIMEP5-R為上下游引物擴(kuò)增目的片段。PCR反應(yīng)體系為20 μL：模板2 μL，上下游引物各1 μL，LA Taq 酶0.2 μL，10×LA buffer 2 μL, dNTP 2 μL，ddH2O 11.8 μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 45 s，57.5℃ 1 min作用30 s，72℃1 min作用30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。取8 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.5.2 目的片段與克隆載體的連接 將目的基因PCR回收產(chǎn)物與pMD-19T Vector 連接。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收；連接體系為：膠回收產(chǎn)物5 μL，SolutionⅠ4.5 μL，pMD19-T載體0.5 μL，總體積10 μL，16℃連接過(guò)夜。

1.5.3 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 取一管大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，放置于冰盒中完全溶解，并將10 uL 16℃連接過(guò)夜的連接產(chǎn)物加入其中，混勻，封口，冰浴30 min。42℃水浴熱激90 s，立即冰浴5 min，加入800 μL無(wú)抗LB液體培養(yǎng)基，置于搖床中，37℃震蕩培養(yǎng)1 h，離心8000 r/2 min棄上清，留約200 μL吹打混勻后均勻涂布在含Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜，次日觀察結(jié)果，陽(yáng)性克隆為白色半透明菌落。

1.5.4 重組質(zhì)粒的PCR檢測(cè)與保菌 從轉(zhuǎn)化板中挑取白色單個(gè)菌落，接種于已有800 μL的抗Amp的EP管中，同時(shí)做一個(gè)對(duì)照只加未挑菌的槍頭于抗Amp的EP管中， 37℃搖床3～4 h，以該菌液為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。檢測(cè)陽(yáng)性的菌用20%的甘油保菌。

1.5.5 重組質(zhì)粒的提取與驗(yàn)證 取PCR檢測(cè)陽(yáng)性的重組菌液200 μL接種于20 mL的抗Amp的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，將培養(yǎng)物嚴(yán)格按照質(zhì)粒提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行質(zhì)粒的提取。將提取的重組質(zhì)粒用XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，酶切體系為20 μL：質(zhì)粒10 μL，ddH2O 6 μL，Buffer 2 μL，XhoⅠ和EcoRⅠ各1 μL。瞬離后，37℃水浴4 h，取10 μL酶切產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，同時(shí)將質(zhì)粒送于北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析。

1.6 裂解酶的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

1.6.1 跨膜區(qū)域預(yù)測(cè) 利用TMHMM v2.0服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)蛋白的跨膜區(qū)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，并結(jié)合 Prot Scale 程序(http://web.expasy.org/protscale/)在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)疏水性的結(jié)果判斷跨膜區(qū)域的可信度。

1.6.2 信號(hào)肽預(yù)測(cè) 信號(hào)肽的預(yù)測(cè)采用Signal P4.1服務(wù)器(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線預(yù)測(cè)該裂解酶的信號(hào)肽[10]。

1.6.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用DNASTAR軟件的protean功能對(duì)裂解酶蛋白的一維氨基酸序列特性進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)使用 SSPro 4.0 服務(wù)器預(yù)測(cè)裂解酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)[11]。

1.6.4 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用在線軟件SWISS-MODEL 服務(wù)器搜索與目的蛋白序列相匹配的模板，然后利用該模板構(gòu)建三級(jí)結(jié)構(gòu)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的擴(kuò)增 以噬菌體vB_SauS_IMEP5的基因組為模板進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)得到1371 bp的目的片段，與預(yù)期片段大小一致，而陰性對(duì)照組無(wú)條帶。結(jié)果如圖1。

M:DNA Marker(DL5000); 1、2: LysIMEP5擴(kuò)增產(chǎn)物; 3: 陰性對(duì)照?qǐng)D1 LysIMEP5 的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒pMD19T-LysIMEP5的PCR檢測(cè)和雙酶切鑒定 從轉(zhuǎn)化板挑取的白色菌落經(jīng)PCR和XhoⅠ、EcoRⅠ雙酶切鑒定，均得到了與其基因大小一致的目的片段，說(shuō)明克隆載體pMD19T-LysIMEP5構(gòu)建成功。結(jié)果如圖2。

M:DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)(DL5000)，1、2、3：PCR鑒定、重組質(zhì)粒的酶切鑒定、pMD19T-LysIMEP5重組質(zhì)粒圖2 重組質(zhì)粒pMD19T-LysIMEP5的PCR與酶切鑒定

2.3 重組克隆質(zhì)粒的測(cè)序及同源性分析 應(yīng)用 NCBI 的在線軟件基本局部比對(duì)搜索工具 BLAST 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性分析[13]，獲得相近裂解酶基因的序列和他們與該基因的同源性分析結(jié)果并利用DNAStar的MegAlign建立矩形圖。測(cè)序結(jié)果表明，去除酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，測(cè)得的重組質(zhì)粒序列與原基因序列完全匹配，無(wú)任何基因突變。同源性分析結(jié)果顯示，LysIMEP5與已報(bào)道的金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶核苷酸序列相似性不高，編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列的相似性也不高，其中只有Lytic enzyme, amidase (plasmid)(登錄號(hào)為ACZ59017.1)與LysIMEP5的同源性最高，為83.1%。BLST序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白分子具有酰胺酶特性，能裂解細(xì)菌細(xì)胞壁的N-乙?；蚅-氨基酸之間的酰胺鍵。如圖4所示，25～113aa屬于酰胺酶家族 (NI_PC_P60 superfaimly)成員，170～347aa屬于肽聚糖水解酶家族(MurNAC-LAA superfaimly)成員。該裂解酶中175～319aa為裂解酶的催化活躍區(qū)，175～255aa為金屬離子結(jié)合區(qū)。

2.4 裂解酶的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用在線工具TMHMM2.0對(duì)裂解酶氨基酸序列進(jìn)行跨膜預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示此裂解酶蛋白無(wú)跨膜螺旋，裂解酶蛋白均處于膜外，不存在跨膜結(jié)構(gòu)(圖5A)。疏水最大值是1.467，最小值是-2.911，但大部分氨基酸屬于親水性氨基酸，可見(jiàn)該蛋白屬于親水性蛋白(圖5B)。Signal P 4.0 預(yù)測(cè)結(jié)果如圖5C所示，圖中 C-score 表示剪切位點(diǎn)分值，S-score表示信號(hào)肽分值，Y-score 表示綜合剪切點(diǎn)分值。信號(hào)肽剪切位點(diǎn)預(yù)測(cè)通過(guò) Y 最大值來(lái)判斷，是否為分泌蛋白通過(guò) S 平均值來(lái)判斷，若 S 平均值>0.5，則預(yù)測(cè)為分泌蛋白，存在信號(hào)肽，由此可以判斷，裂解酶編碼的蛋白不存在信號(hào)肽。

圖3 裂解酶 LysIMEP5矩形圖

圖4 裂解酶LysIMEP5的NCBI-BLAST 分析

A.TMHMM預(yù)測(cè)跨膜區(qū)域；B. 疏水性預(yù)測(cè)；C.信號(hào)肽預(yù)測(cè)圖5 LysIMEP5編碼的裂解酶蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

2.5 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)DNASTAR軟件的protean功能對(duì)基因編碼的裂解酶蛋白的一維氨基酸序列特性進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)SSPro 4.0 服務(wù)器預(yù)測(cè)裂解酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明：LysIMEP5蛋白由456個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為51717.00，等電點(diǎn)為9.70，其二級(jí)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，其中α螺旋占19.52%，β折疊占25.66%，無(wú)規(guī)則卷曲占54.82%。從預(yù)測(cè)結(jié)果可知，裂解酶二級(jí)結(jié)構(gòu)組分中，以無(wú)規(guī)則卷曲為主(54.82%)。裂解酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(圖6)為雙行顯示，上行為目的蛋白序列，下行為對(duì)應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中 C 表示無(wú)規(guī)則卷曲，H 表示 α-螺旋，E 表示 β-折疊。

圖6 裂解酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果圖

2.6 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) Swiss-model 預(yù)測(cè)裂解酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖7)表明，其殘基建模范圍是從166到456，以X-ray 1.80A為模板，覆蓋率為55%，具有一定的可信度。從三級(jí)結(jié)構(gòu)圖中可以清晰地看到Ca2+離子和Zn2+離子。

圖7 LysIMEP5三級(jí)結(jié)構(gòu)初步預(yù)測(cè)示意圖

3 討論

近年來(lái)，噬菌體作為一種特異性感染細(xì)菌的病毒，得到越來(lái)越廣泛關(guān)注與應(yīng)用。大部分噬菌體都是通過(guò)裂解宿主細(xì)胞來(lái)結(jié)束其感染周期。而小分子RNA和DNA噬菌體通過(guò)在不同階段編碼蛋白質(zhì)干擾、抑制宿主菌胞壁的合成，從而導(dǎo)致宿主菌胞壁裂解，而雙鏈DNA噬菌體則通過(guò)特異性裂解酶(lysin)系統(tǒng)，作用于細(xì)胞壁上的肽聚糖，從而破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，導(dǎo)致細(xì)菌的裂解[14]。革蘭氏陽(yáng)性菌噬菌體的裂解酶結(jié)構(gòu)相似，裂解效率高，且不易產(chǎn)生耐藥菌株，所以許多革蘭氏陽(yáng)性菌噬菌體裂解酶開(kāi)始被克隆、表達(dá)及應(yīng)用于生產(chǎn)[15]。相比抗生素而言，裂解酶最大的優(yōu)點(diǎn)是用量小且連續(xù)使用也不會(huì)產(chǎn)生抗性細(xì)菌，還可以安全高效地殺滅宿主菌而對(duì)其他菌群無(wú)影響。

試驗(yàn)在對(duì)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌裂解性噬菌體裂解酶基因進(jìn)行克隆時(shí)，采用同源性分析后克隆的方法，節(jié)省了時(shí)間和科研經(jīng)費(fèi)。本研究中克隆的LysIMEP5基因的起始密碼子是ATG，終止密碼子是TAA，與絕大多數(shù)的長(zhǎng)尾噬菌體的密碼子相同。從NCBI的BLAST分析結(jié)果可以看出該裂解酶與已報(bào)導(dǎo)的相關(guān)裂解酶相似性不高，屬于一種新發(fā)現(xiàn)的金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶，且該裂解酶的25～113aa屬于CHAP片段，是酰胺酶家族的一員，而170～347aa屬于肽聚糖水解酶家族(MurNAC-LAA superfaimly)成員中的Amidase。CHAP能催化GSP水解為谷胱甘肽和亞精胺，且每個(gè)CHAP分子的結(jié)構(gòu)包含1-164范圍的氨基酸，由3個(gè)α-螺旋，6個(gè)β-折疊和一個(gè)Ca2+組成。MurNAC-LAA superfaimly是發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌和噬菌體或噬菌體的基因組中幾種肽聚糖水解酶(PGHS)中的一種，參與肽聚糖的降解。一般情況下，細(xì)菌MurNAc-LAAS是細(xì)菌自溶系統(tǒng)的成員，并允許它們攜帶信號(hào)肽的N-末端穿過(guò)胞質(zhì)膜。然而，噬菌體MurNAc-LAAS是內(nèi)溶素，因?yàn)檫@些噬菌體編碼的酶在噬菌體生殖周期的終端階段分解細(xì)菌的肽聚糖。相對(duì)于自溶素，幾乎所有的細(xì)胞內(nèi)溶素?zé)o信號(hào)肽，被認(rèn)為是在噬菌體編碼的穴蛋白的幫助下通過(guò)胞質(zhì)膜的。酰胺酶催化區(qū)域與另一功能模塊在N-末端或C-末端的融合，代表著高親和力的細(xì)胞壁蛋白的結(jié)合。通過(guò)之前關(guān)于裂解酶活性依賴(lài)于Ca2+的報(bào)道，如LysK，以及噬菌體phi11、B30和Ply700的裂解酶[16]和顧敬敏[5]首次對(duì)金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶的三維結(jié)構(gòu)分析可預(yù)測(cè)，該裂解酶LysIMEP5以及其CHAP片段的裂解活性也均依賴(lài)于Ca2+的存在，且CHAP片段在LysIMEP5的活性中起關(guān)鍵的裂解作用。通過(guò)對(duì)Amidase-3片段的催化活躍區(qū)和金屬離子結(jié)合區(qū)域的分析，可知Zn2+對(duì)Amidase-3片段發(fā)揮活性起關(guān)鍵作用。通過(guò)LysIMEP5的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型可以清楚地看到Ca2+和Zn2+。由此可推測(cè)該裂解酶同時(shí)具有CHAP片段和Amidase-3片段會(huì)具有較強(qiáng)的裂解功能，對(duì)其裂解功能的預(yù)測(cè)分析會(huì)在后續(xù)的試驗(yàn)中繼續(xù)研究。通過(guò)對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)可知，此裂解酶屬無(wú)跨膜區(qū)，無(wú)信號(hào)肽，以無(wú)規(guī)則卷曲為主的親水性蛋白。噬菌體MurNAc-LAAS是內(nèi)溶素，在噬菌體生殖周期的終端階段分解細(xì)菌的肽聚糖。因此，將在后續(xù)的試驗(yàn)中對(duì)LysIMEP5編碼的內(nèi)溶素克隆表達(dá)，為開(kāi)發(fā)新型綠色抑菌劑奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

研究成功克隆出了1371bp的LysIMEP5基因。用BLAST軟件對(duì)其進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)：LysIMEP5基因與已報(bào)道的金黃色葡萄球菌噬菌體裂解酶相似性不高，此基因片段中同時(shí)存在CHAP片段和Amidase-3片段，且Amidase-3片段中存在明顯的金屬離子結(jié)合區(qū)域，在LysIMEP5的裂解活性中起關(guān)鍵作用。通過(guò)對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)此裂解酶無(wú)跨膜區(qū)，無(wú)信號(hào)肽，且以無(wú)規(guī)則卷曲為主，親水性區(qū)域相對(duì)集中而且比例大于疏水性區(qū)域。

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(編輯：陳希)

Cloning and Sequence Analysis of Bovine MastitisStaphylococcusaureusLytic Bacteriophage Lysin LysIMEP5 Gene

ZHANG Qian1,ZHANGXIANG Li-lan2, SUN Yao-qiang1, YU Hui-ju1,ZHANG Pei-sheng1, LIU Ge1, QU Yong-gang1*，TONG Yi-gang2*,LI Yan3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShiheziUniversity,Shihezi,Xinjiang832003,China;2.BeijingInstituteofMicrobiologyandEpidemiology,Beijing100071,China;3.TheGeneralStationofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicineofXinjiangProductionandConstructionCorps,Urumqi830063，China)

Cloning and analysis the biological information of lysin LysIMEP5 gene from bovine mastitisStaphylococcusaureuslytic bacteriophage. Using the bovine mastitisStaphylococcusaureuslytic phage VB_SauS_IMEP5, which was isolated and indentified by our laboratory, and its whole genome information, analysis, we got the lysin gene sequence. Using the software Primer 5.0, a pair of specific primers was designed and the LysIMEP5 gene was amplified and cloned from the bovine mastitisStaphylococcusaureusphage by Polymerase Chain Reaction (PCR). Analysing its biological information characteristics by the BLAST and its protein structure prediction. The lysin LysIMEP5 gene was cloned successfully and its sequencing results were completely matched with the original sequence by DNAMAN, without any gene mutation. Homologous analysis showed that,the highest similarty is 83.1% compared with have reported Staphylococcus aureus phage lyase.The gene full-length of lysin LysIMEP5 was 1371 bp, encoding 456 amino acids. The lysin LysIMEP5 was hydrophilic protein, its molecular mass was 51.717 kDa, its isoelectric point was 9.70. Biological information analysis showed that, CHAP fragments and Amidase-3 fragments were existed in the LysIMEP5 at the same time. The protein was mainly random coil, but without transmembrane domain and signal peptide. The gene of LysIMEP5 was successfully cloned from the bovine mastitisStaphylococcusaureusphage and the protein structure of LysIMEP5 was prediction. The results provided foundation for the future expression of LysIMEP5 and the development of new green antibacterial agent.

bovine mastitis;Staphylococcusaureusbacteriophage;lysine;cloning;protein structure

國(guó)家自然科學(xué)基金(31560699)；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2015AG012)

2016-08-26

A

1002-1280 (2016) 10-0015-07

S852.61