馬波沙星對豬臨床分離病原菌的體外抑菌活性研究

岳永波，吳好庭，劉波，范小平，楊芳，王成彬

(1.保定冀中藥業(yè)有限公司，河北省中獸藥工程技術(shù)研究中心，河北保定 071500;2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；3.海南省獸藥飼料監(jiān)察所，?？?570203)

馬波沙星對豬臨床分離病原菌的體外抑菌活性研究

岳永波1，吳好庭2，劉波1，范小平3，楊芳1，王成彬1

(1.保定冀中藥業(yè)有限公司，河北省中獸藥工程技術(shù)研究中心，河北保定 071500;2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；3.海南省獸藥飼料監(jiān)察所，海口 570203)

考察馬波沙星對豬臨床分離病原菌的體外抑菌活性，以期為臨床應用提供依據(jù)。采用瓊脂二倍稀釋法測定馬波沙星對豬臨床分離大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的最小抑菌濃度(MIC)，并以土霉素、恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素和多西環(huán)素作為對照藥物。結(jié)果表明：馬波沙星對豬臨床分離病原菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌均有較低的最小抑菌濃度，對臨床分離大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的抑菌活性明顯高于諾氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素和強力霉素，對臨床分離大腸桿菌的抑菌活性高于恩諾沙星。馬波沙星對引起豬乳房炎-子宮炎-無乳綜合征(MMA)的主要病原菌的抑菌活性優(yōu)于常用抗菌藥。

馬波沙星；體外抑菌；最低抑菌濃度；臨床分離病原菌

馬波沙星(marbofloxacin MBF)是第三代喹諾酮類抗菌藥物，其作用機制是通過抑制細菌脫氧核糖核酸(DNA)合成酶之一的回旋酶(DNA-gyrase)，使細菌DNA復制及蛋白質(zhì)的合成受干擾，從而起到殺菌的怍用，其對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌和支原體均有很好的抗菌效果，是動物專用抗菌藥[1]。馬波沙星有抗菌譜廣、抗菌活性強、毒性低且不易產(chǎn)生耐藥性，口服或注射治療犬貓的皮膚感染[2]、上呼吸道感染[3]、泌尿道感染[4]及預防外科手術(shù)感染[5]等；注射用于治療豬牛敏感菌引起的呼吸道感染、牛乳腺炎以及豬乳房炎-子宮炎-無乳綜合征(MMA)[6-8]。

乳房炎-子宮炎-無乳綜合征(MMA)或產(chǎn)后無乳綜合癥是母豬的一種多病因性疾病，其病原有大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、克雷伯氏菌以及霉形體等，導致仔豬不能哺乳而死亡，臨床危害嚴重[9]。發(fā)病后一般采用廣譜抗菌藥進行抗菌治療[10]，但現(xiàn)有的廣譜抗菌藥經(jīng)過長期使用，細菌的耐藥性逐年增強，迫切需要新的抗菌藥出現(xiàn)。馬波沙星作為一種新的動物專用的抗菌藥，其體外抑菌試驗研究已有報道[11-13]，但是尚未見與治療豬乳房炎-子宮炎-無乳綜合征(MMA)藥效密切相關的體外抑菌試驗研究。本試驗旨在探討馬波沙星在體外對引起豬乳房炎-子宮炎-無乳綜合征(MMA)常見幾種致病性細菌的抑制效果，為臨床應用馬波沙星提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試與參照藥物 參照藥物：慶大霉素(批號14092011)、土霉素(批號140511)、恩諾沙星(批號20140327)、多西環(huán)素(批號140806)、環(huán)丙沙星(批號140415)和諾氟沙星(批號131023)，由普博欣生物科技公司提供。馬波沙星對照品：10%馬波沙星注射液，規(guī)格50 ml:5 g/瓶，批號2014110512，由保定冀中藥業(yè)有限公司提供。

1.1.2 試驗與參照菌株 試驗菌株：臨床分離大腸埃希氏菌40株、金黃色葡萄球菌20株和鏈球菌28株。標準質(zhì)控菌株：大腸桿菌ATCC25922；金黃色葡萄球菌ATCC29213，均由本實驗室保存。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑 培養(yǎng)基：麥康康瓊脂(MacConkey Agar)、LB肉湯(Luria-Bertani Broth)、LB瓊脂(Luria-Bertani Agar)、水解絡蛋白瓊脂(Muller-Hinton Agar)、水解絡蛋白肉湯(Muler-Hinton Broth)、Baird-Parker瓊脂基礎(Baird-Parker Agar Base)、甘露醇高鹽瓊脂(Mannitol Salt Agar)、7.5%氯化鈉肉湯(7.5%Sodium Chloride Broth)、胰蛋白胨大豆瓊脂基礎(Tryptic Soy Agar)、胰蛋白胨大豆肉湯(Trypic Soy Broth)，均購自青島海博生物技術(shù)有限公司。無菌脫纖維綿羊血(廣州蕊特生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離及鑒定

1.2.1.1 細菌分離 在養(yǎng)豬場選擇產(chǎn)后1～3 d內(nèi)發(fā)生缺乳或無乳的母豬，品種為大白、長白和杜洛克，年齡為10個月至4年，體重150～200 kg，胎次為1～8。依據(jù)華南農(nóng)業(yè)大學劉宇教授研究的MMA 的診斷標準[14]，選擇其中具有MMA典型癥狀的病豬10頭，臨床表現(xiàn)為體溫40 ℃以上，精神沉郁、食欲減退或廢絕、不同程度的便秘；陰道排出粘性或膿性分泌物，乳房腫脹、敏感，不愿哺乳。取試驗豬的子宮內(nèi)容物，置滅菌運送培養(yǎng)基中低溫保存并帶回實驗室，用多種選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)分離細菌。腸桿菌選擇性培養(yǎng)用麥康凱瓊脂；葡萄球菌選擇性培養(yǎng)用高鹽甘露醇瓊脂及Baird-Parker瓊脂；鏈球菌選擇性培養(yǎng)用添加脫纖維羊血的胰蛋白胨大豆瓊脂。菌株純化培養(yǎng)后進行革蘭氏染色鏡檢，初步確定病原菌種類。

1.2.1.2 細菌鑒定 細菌鑒定采用BD BBL?CrystalTM細菌鑒定系統(tǒng)，其中腸桿菌采用E/NF腸/非發(fā)酵菌鑒定板；葡萄球菌采用GP ID革蘭氏陽性菌鑒定板；鏈球菌采用GP ID革蘭氏陽性菌鑒定板。

1.2.2 最小抑菌濃度(MIC)測定 采用瓊脂二倍稀釋法測定受試藥物和參照藥物的最小抑菌濃度(MIC)，參照CLSI的指導原則進行MIC檢測。

1.2.2.1 藥物的配制 青霉素、慶大霉素、土霉素、恩諾沙星、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星和馬波沙星均配制成1280 μg/mL 的貯備液, 過濾除菌, - 20 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 菌液的制備 將質(zhì)控菌株和鑒定好的試驗菌株接種瓊脂平板，置37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取1～2個單菌落接種于MH 培養(yǎng)液，置37 ℃孵育培養(yǎng)6～8 h，取出用生理鹽水將菌液校正到0.5麥氏比濁標準 (含菌量約106CFU/mL)。

1.2.2.3 最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用瓊脂二倍稀釋法，將10種藥物在空白平皿上稀釋到需要的各個梯度，然后將高壓滅菌后的MH瓊脂降到50～60 ℃，按照藥液與MH瓊脂的體積比9:1加到各個平皿中，混勻晾干，待用。將稀釋好的待測菌液按照一定的順序轉(zhuǎn)移到96孔板中，用多點接種儀接種細菌至藥物平板上，細菌接種量為5×105CFU/點，同時設藥物對照、平板陰性對照和平板陽性對照，在37 ℃培養(yǎng)16～18 h后，觀察結(jié)果。

1.2.2.4 結(jié)果判定 參照CLSI判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌分離 共從臨床分離大腸埃希氏菌40株、金黃色葡萄球菌20株和鏈球菌28株。

2.2 藥物敏感性 馬波沙星對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的MIC50分別為8、4、1 μg/mL，均低于諾氟沙星(32、32、8 μg/mL)、環(huán)丙沙星(16、16、8 μg/mL)的MIC50，與恩諾沙星的MIC50(16、2、1 μg/mL)接近。對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的MIC90分別為64、64、16 μg/mL，均低于諾氟沙星(>128、>128和128 μg/mL)、環(huán)丙沙星(>128、>128和128 μg/mL)的MIC90，與恩諾沙星的MIC90(>128、32和32 μg/mL)接近。慶大霉素和強力霉素對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的 MIC50和MIC90均高于馬波沙星(表1～表3)。

表1 大腸桿菌藥物敏感性結(jié)果(μg/mL)

表2 葡萄球菌藥物敏感性結(jié)果(μg/mL)

表3 鏈球菌藥物敏感性結(jié)果(μg/mL)

3 討論與小結(jié)

近年來，大量抗菌藥物應用于集約化養(yǎng)豬生產(chǎn)中，長期不規(guī)范的用藥，導致耐藥菌株不斷增強，獸醫(yī)臨床中常用抗菌藥物(如土霉素、慶大霉素等)，對致病菌的抑制效果不斷減弱[15-17],導致養(yǎng)殖過程中抗菌藥物用量越來越大，形成惡性循環(huán)。

根據(jù)國外Bousquet-Melou的研究[18-19]，馬波沙星對分離自馬的腸桿菌、金黃葡萄球菌、鏈球菌的最低抑菌濃度范圍(MICrange)分別為0.008～0.03 μg/mL、0.12～0.25 μg/mL、0.5～2.0 μg/mL；Schneider等研究[20]表明馬波沙星對分離自牛乳中的大腸桿菌與金黃葡萄球菌的最低抑菌濃度范圍為0.008～4 μg/mL和0.016 μg/mL；根據(jù)國內(nèi)張玲玲、王令等的研究[12-13]，馬波沙星對臨床分離的雞、豬、鴨的大腸桿菌、金黃葡萄球菌、鏈球菌的最低抑菌濃度范圍分別為0.125～0.500 μg/mL、0.125～0.250 μg/mL、0.125～0.250 μg/mL。與以上數(shù)據(jù)比較，本試驗所得的馬波沙星最小抑菌濃度(MIC)偏高，但Dinh等研究[21]表明馬波沙星對分離自豬糞的大腸桿菌MIC范圍為0.03～32 μg/mL，與本試驗數(shù)據(jù)接近，表明不同來源的菌株耐藥性存在差異。另外，Dinh等研究[21]還表明馬波沙星對豬糞中分離的大腸桿菌的抑菌活性與恩諾沙星、環(huán)丙沙星相當，但本試驗表明馬波沙星優(yōu)于恩諾沙星、環(huán)丙沙星，表明由于長期使用，菌株已經(jīng)對恩諾沙星、環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥性，但對馬波沙星依然敏感，沒有產(chǎn)生交叉耐藥性[22]。

隨著病原菌耐藥性的增強，使用標準菌株研究已經(jīng)不能滿足臨床需要。本試驗采用豬臨床分離病原菌，以驗證馬波沙星對引起豬乳房炎-子宮炎-無乳綜合征(MMA)的主要病原菌的抑菌活性的真實情況，為臨床應用提供可靠的依據(jù)。結(jié)果表明馬波沙星對豬臨床分離大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌的抑菌活性明顯高于諾氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素和強力霉素，對臨床分離大腸桿菌的抑菌活性高于恩諾沙星。馬波沙星與對照藥物中的環(huán)丙沙星等同為喹諾酮類藥物，但是馬波沙星的是獸用專用的新藥，病原菌對其不易形成耐藥性，因此對引起豬乳房炎-子宮炎-無乳綜合征(MMA)的主要病原菌的抑菌活性優(yōu)于常用的抗菌藥物，為此類病菌感染的治療提供了新的選擇。

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(編輯：侯向輝)

inVitroAntibacterial Activities of Marbofloxacin against Bacterial Strains Isolated from Swine

YUE Yong-bo1，WU Hao-ting2，LIU Bo1，F(xiàn)AN Xiao-ping3，YANG Fang1，WANG Cheng-bin1

(1.BaodingJizhongPharmaceuticalCoLtd，Engineering﹠TechnologyResearchCenterofTraditionalChineseVeterinaryMedicineofHebeiProvince,Baoding,Hebei071500，China;2.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081，China;3.HainanProvincialInstituteofVeterinaryDrugandFeedControl,Haikou570203，China)

To study theinvitroantibacterial activity of marbofloxacin against bacterial strains isolated from swine and provided scientific evidence for clinical use，theinvitroantibacterial activities of marbofloxacin were examined by agar dilution method with clinical isolated bacterial strains from swine, compared with oxytetracycline, enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, gentamycin and doxycycline. Result showed that marbofloxacin had low MIC against clinical isolatedEscherichiacoli,Staphylococcusaureusandstreptococcusstrains. Marbofloxacin had superior antibacterial activities against clinical isolatedEscherichiacoli,Staphylococcusaureusandstreptococcusstrains compared with norfloxacin, ciprofloxacin, gentamicin and doxycycline, and better than enrofloxacin againstEscherichiacoli. Marbofloxacin had good antibacterial activities against main bacterial strains cause MMA than commonly used antibacterial agents.

marbofloxacin;invitroantibacterial activities; MIC; clinical isolated bacterial strains

岳永波，正高級工程師，從事獸用新藥研究。E-mail：2403675478@qq.com

2016-07-13

A

1002-1280 (2016) 10-0032-04

S859.796