PRRSV體外感染PAMs對(duì)IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

閆曉霞，劉歡歡，曾夢(mèng)穎，高洪，嚴(yán)玉霖

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

PRRSV體外感染PAMs對(duì)IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

閆曉霞，劉歡歡，曾夢(mèng)穎，高洪，嚴(yán)玉霖*

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

為探討豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)體外感染豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAMs)對(duì)IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響,選用PRRSV血清抗體和抗原均為陰性的4周齡健康仔豬3頭，無菌分離PAMs，隨機(jī)將其分為對(duì)照組、PRRSV感染組(PRRSV組)、PRRSV+PHA組和RRRSV+Dex組，分別在培養(yǎng)6、12、24、48和60 h收集PAMs。運(yùn)用熒光定量PCR檢測IFN-γ和PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果顯示，PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄量在感染PAMs后6～24 h逐漸升高，在48 h有所下調(diào)，在60 h再次升高，IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄量在6～48 h逐漸升高，24、48 h顯著高于對(duì)照組，而到60 h又恢復(fù)到對(duì)照組水平；與同時(shí)間點(diǎn)的PRRSV組相比，PRRSV+PHA組中PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄量有所下調(diào)，IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄量有所上調(diào)；而RRRSV+Dex組PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄量有所上調(diào)，IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄量所下調(diào)。結(jié)果表明，IFN-γ 在一定程度上可以抑制PRRSV在PAMs中的增殖，IFN-γ的抑制可能是PRRSV導(dǎo)致細(xì)胞損傷的機(jī)制之一。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；肺泡巨噬細(xì)胞；干擾素-γ

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬，是一種有囊膜的不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒[1-2]。根據(jù)基因組及致病性的差異，PRRSV可分為2個(gè)型，即歐洲型(LV株為代表株)和美洲型(ATCC-VR2332株為代表株)[3]。PRRSV主要侵害肺泡巨噬細(xì)胞(Pulmonary alveolar macrophage，PAMs)，從而導(dǎo)致彌散性間質(zhì)性肺炎，損害機(jī)體免疫機(jī)能，進(jìn)一步對(duì)機(jī)體造成繼發(fā)性感染[4]，給世界的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[5]。干擾素(interferon，IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能的細(xì)胞因子,主要由活化的T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，促進(jìn)抗病毒免疫[6-7]。 國內(nèi)外對(duì)PRRSV感染PAMs的研究主要局限在I型干擾素。鑒于此，本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)PRRSV 感染PAMs不同時(shí)期IFN-γmRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化進(jìn)行檢測，從而了解IFN-γ與PRRSV 抗感染之間的關(guān)系，為PRRSV的防控提供參考依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 PRRSV云南株YN-2011(登錄號(hào)：JX857698)由本實(shí)驗(yàn)室分離純化保存，其TCID50為1 mL 105.06。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 經(jīng)ELISA 和RT-PCR方法檢測PRRSV血清抗體和抗原均為陰性的4周齡健康仔豬3頭。

1.1.3 主要儀器與試劑 XDS-2倒置顯微鏡購自重慶光電儀器總公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo scientific公司；BIO-RAD-CFX熒光定量PCR儀購自美國BIO-RAD公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；PRRSV抗體ELISA檢測試劑盒購自北京愛德士元亨生物科技有限公司；PHA-L購自美國Sigma公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA eraser、SYBR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)購自寶生物工程( 大連) 有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺泡巨噬細(xì)胞的制備 將試驗(yàn)豬置于無菌室解剖臺(tái)上，頸靜脈放血致死，剖開胸腔，結(jié)扎氣管后連同心臟取出完整的肺，用0.01 g/L pH 7.4的PBS充分漂洗肺表面，清除血塊，從氣管往肺注入0.01 g/L pH 7.4的PBS 50～100 mL,輕輕拍打肺表面1～2 min后回收灌洗液，用單層無菌過濾篩過濾，收集全部灌洗液，1500 r/min離心5 min，最后用含有雙抗的 PBS洗滌PAMs兩次，1500 r/min離心5 min，即為所得PAM。RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106mL-1，以每孔2 mL鋪在6孔細(xì)胞板于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，當(dāng)PAMs貼壁后，棄上清,待用。

1.2.2 試驗(yàn)分組與處理 將生長在6 孔板上的PAMs 細(xì)胞分為4 組。正常對(duì)照組；PRRSV感染組；PRRSV+PHA組：在經(jīng)過PRRSV感染后的PAMs中加入5 μg/mL的PHA-L進(jìn)行處理[8]；RRRSV+Dex組：在經(jīng)過PRRSV感染后的PAMs中加入0.1 mg/mL的Dex進(jìn)行處理[9]。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。各組加入的病毒量為100 μL，對(duì)照組接種等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，分別于感染后6、12、24、48和60 h收集PAMs，-80 ℃保存，用于熒光定量PCR檢測。

1.2.3 熒光定量PCR檢測PRRSV和IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平 使用Trizol提取總RNA，應(yīng)用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA eraser試劑盒逆轉(zhuǎn)錄總RNA成為cDNA，于-20 ℃保存。Realtime-PCR反應(yīng)體系: SYBR Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)12.5 μL， 上、下游引物(表1)各1.0 μL，cDNA 2 μL，dH20 8.5 μL。按以下程序進(jìn)行Realtime-PCR反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，Tm 30 s；72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.2.4 IFN-γ與PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)性分析 根據(jù)各試驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)IFN-γ與PRRSV mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量，以PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄水平為縱坐標(biāo)，IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平為橫坐標(biāo)，做轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞中IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄 根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)Ct值，用2-△△Ct計(jì)算不同組IFN-γ mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量。IFN-γ mRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平如圖1。PRRSV組中，IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄量在6～48 h逐漸升高，6 h顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，24和48 h顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，而到60 h又恢復(fù)到對(duì)照組水平；PRRSV+PHA組IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于對(duì)照組及PRRSV組；RRRSV+Dex組IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平在6、12、24和60 h顯著低于對(duì)照組和PRRSV組(P<0.01或P<0.05)。

圖1 IFN-γ mRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平(*P<0.05，**P<0.01)

圖2 PRRSV mRNA在各組不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平(*P<0.05，**P<0.01)

2.2 細(xì)胞中PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄 根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)Ct值，用2-△△Ct計(jì)算不同組PRRSV mRNA相對(duì)轉(zhuǎn)錄量。由圖2可以看出，PRRSV組PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄量在感染后6～24 h逐漸升高，48 h有所下調(diào)，60 h再次升高；PRRSV+PHA組PRRSV mRNA的轉(zhuǎn)錄量與相同時(shí)間點(diǎn)PRRSV組中PRRSV mRNA的轉(zhuǎn)錄量相比顯著下調(diào)(P<0.01或P<0.05)；RRRSV+Dex組PRRSV mRNA的轉(zhuǎn)錄量與相同時(shí)間點(diǎn)PRRSV感染組相比有所上調(diào)，在12、24 h差異顯著(P<0.01或P<0.05)。

2.3 IFN-γ與PRRSV mRNA轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)性分析 不同試驗(yàn)組之間IFN-γ與PRRSV mRNA相關(guān)性分析見圖3。根據(jù)|R|∈[0.1,0.3)為弱相關(guān)，|R|∈[0.3,0.5)為中等相關(guān)，|R|∈[0.5,1.0]為強(qiáng)相關(guān)得出：PRRSV感染組R2=0.01728，R=0.13，弱相關(guān)；PRRSV+PHA組R2=0.0176，R=0.13，弱相關(guān)；RRRSV+Dex組R2=0.086，R=0.29，弱相關(guān)。

圖3 不同實(shí)驗(yàn)組 IFN-γ與PRRSV轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)性分析

3 討論與小結(jié)

IFN-γ主要是由抗原、有絲分裂素等刺激、活化的CD4+Th1、CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞所分泌的一類可溶性糖蛋白，有較強(qiáng)的抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)作用，如誘導(dǎo)單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、星狀細(xì)胞等MHCⅡ類抗原的表達(dá)，使其參與抗原遞呈和特異性免疫的識(shí)別過程，促進(jìn)巨噬細(xì)胞 FcγR 表達(dá)，協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤壞死因子(tumor necrosis factors, TNF )并促進(jìn)巨噬細(xì)胞殺傷病原微生物[10]?？乖?、T細(xì)胞促分裂素(PHA)、細(xì)胞因子(IL-2、IL-12、IL-18)會(huì)誘導(dǎo)IFN-γ的合成，地塞米松、糖皮質(zhì)激素、IL-10對(duì)INF-γ的產(chǎn)生具有抑制作用[11]。因此選取PHA作為陽性對(duì)照，地塞米松作為陰性對(duì)照。本研究應(yīng)用q-PCR技術(shù)對(duì)不同組中IFN-γ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRRSV組中，IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄量在6～48 h逐漸升高，說明PRRSV可以刺激PAMs分泌IFN-γ。而6 、12 h低于對(duì)照組，說明該時(shí)期可能處于病毒感染的初期，刺激PAMs分泌IFN-γ的能力較弱，而到了60 h又恢復(fù)到對(duì)照組水平是因?yàn)椴《驹赑AMs中的增殖，大量的PAMs已脫落、凋亡。以上結(jié)果與夏九鮮等人的研究結(jié)果相類似[12]。而PRRSV+PHA組和RRRSV+Dex組IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平分別高于和低于同時(shí)間點(diǎn)的PRRSV組，這一結(jié)果與T細(xì)胞促分裂素(PHA)會(huì)誘導(dǎo)IFN-γ的合成，地塞米松對(duì)INF-γ的產(chǎn)生具有抑制作用的研究相符[11]。

已有研究表明IFN-γ可以抑制PRRSV 在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中增殖。本研究應(yīng)用q-PCR技術(shù)對(duì)不同組中PRRSV的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRRSV+PHA組PRRSV mRNA的轉(zhuǎn)錄量與相同時(shí)間點(diǎn)PRRSV組中PRRSV mRNA的轉(zhuǎn)錄量相比顯著下調(diào)，這一結(jié)果與利用IL-12處理PAMs刺激其分泌IFN-γ最終可以降低PRRSV在PAMs中的增殖的結(jié)果相類似[8]。RRRSV+Dex組PRRSV mRNA的轉(zhuǎn)錄量與相同時(shí)間點(diǎn)PRRSV感染組相比有所上調(diào)，這與佟杰[13]等研究地塞米松可以加強(qiáng)PRRSV在體內(nèi)的復(fù)制，從而使病毒感染造成的損傷加重的結(jié)果相類似。另外，本研究結(jié)果顯示PRRSV組IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平與PRRSV轉(zhuǎn)錄水平存在弱負(fù)相關(guān)關(guān)系，表明PRRSV在PAMs細(xì)胞內(nèi)的增殖復(fù)制抑制了IFN-γ的產(chǎn)生，這也是PRRSV導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制的機(jī)制之一。

研究結(jié)果對(duì)于臨床用藥具有一定的指導(dǎo)意義，結(jié)果表明PRRSV感染后可用PHA等藥物或促進(jìn)劑刺激干擾素的產(chǎn)生，對(duì)PRRSV的復(fù)制增殖具有一定的抑制作用，這與臨床中用干擾素治療PRRSV豬只的研究類似[14]；DEX是糖皮質(zhì)激素類藥物，雖具有抗炎、抗過敏和抗毒作用，但本研究結(jié)果顯示DEX抑制IFN-γ的產(chǎn)生，從而促進(jìn)了PRRSV的增殖復(fù)制，因此PRRSV感染后不建議使用DEX，這與佟杰等[13]連續(xù)7 d低劑量注射DEX會(huì)造成仔豬機(jī)體免疫抑制，增加其死亡率的結(jié)果一致。

[1] Edgar R C，Alexel B E，Enric M，etal. Immunological Features of the Non-Structural Proteins of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus[J]. Viruses，2015，7：873-886.

[2] Faaberg K S，Balasuriyam U B R， Brinton A，etal. Family arteriviridae in Virus Taxonomy， Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses，London，UK， 2011.

[3] Shyrley P A，Librado C，Irene M，etal. A comparative study of the local cytokine response in the lungs of pigs experimentally infected with different PRRSV-1 strains: Upregulation of IL-1α in highly pathogenic strain induced lesions[J]. Veterinary Immunology and Immunop-athology，2015，164：137-147.

[4] Chen Y，He S，Sun L，etal. Genetic variation, pathogenicity, and immunogenicity of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain XH-GD at different passage levels[J].Archives of Virology，2015，161(1): 77-86.

[5] Wang R，Zhang Y J. Antagonizing interferon-mediated immune response by porcine reproduc-tive and respiratory syndrome virus[J].Biomed Res Int，2014，(2): 855-866.

[6] Han S K，Song J Y. Gamma Irradiation-reduced IFN-g Expression, STAT1 Signals, and cell-mediated Immunity[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology，2002，35(6)：583-589.

[7] 白雪，趙建增，梁志選，等.IFN-γ研究進(jìn)展及其在豬繁殖與呼吸綜合征研究中的應(yīng)用[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(12)：145-149.

[8] Quincy L，Rafael E，Rafael E，etal. Interleukin-12 (IL-12) ameliorates the effects of porcine respiratory and reproductive syndrome virus (PRRSV) infection[J]. Veterinary Immunology and Immunopathology，2005，107：105-118.

[9] 佟杰. 下丘腦-垂體-腎上腺軸在高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染仔豬中作用的研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，2015.

[10]代麗，單安山，孫進(jìn)華. γ干擾素的研究進(jìn)展及在畜牧中的應(yīng)用[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(4)：51-57.

[11]Shindler H， Lutz M B，Rollighoff M，etal. The production of IFN-gamma by IL-12 /IL-18 activated macrophages requires STAT4 signaling and is inhibited by IL-4[J]．Immuonl，2001，166 (5)：3075-3082.

[12]夏九鮮，李銳，周顯珍，等. PRRSV 感染不同時(shí)期IFN-γ 表達(dá)量分析[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013，5：2-76.

[13]佟杰，王剛，于穎，等. 地塞米松對(duì)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染仔豬的影響[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，37(8)：590-594.

[14]胡奕，宋杰，趙寶華. 豬繁殖與呼吸綜合征防控方法研究進(jìn)展[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30(2)：69-73.

(編輯：侯向輝)

The Effects of PRRSV Infected PAMs on Transcription Levels of IFN-γinVitro

YAN Xiao-xia, LIU Huan-huan, ZENG Meng-ying, GAO Hong, YAN Yu-lin*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming, 650201,China)

To explore the effects of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infected pulmonary alveolar macrophage (PAMs) on transcription levels of IFN-γinvitro，three four weeks old piglet free of PRRSV was used in this experiment. The PAMs were isolated aseptically and divided into control group, PRRSV infection group (PRRSV group),PRRSV+PHA group，PRRSV+Dex group and culturedinvitro. The PAMs were collected at 6, 12, 24, 48 and 60 hours post infection. The mRNA transcription of IFN-γ and PRRSV were analyzed by Real-Time PCR. The results shows that the mRNA levels of PRRSV in PRRSV group were gradually increased at 6～24 h and were decreased at 48 h ; the transcription of IFN-γ were gradually increased at 6～48 and significantly higher at 24 and 48 h than control group. PRRSV+PHA group the mRNA levels of PRRSV were slightly lower and the IFN-γ is higher than PRRSV group; RRRSV+Dex group the mRNA transcription of PRRSV were higher but the IFN-γ is lower.The results indicated IFN-γ can inhibit the proliferation of PRRSV in PAMs，the inhibition of IFN -γ is probably one of the mechanisms that PRRSV cause cellular damage.

PRRSV；PAMs；IFN-γ

2016-07-07

A

1002-1280 (2016) 10-0001-05

S852.65

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160496，31360599)；云南農(nóng)業(yè)大學(xué)2015年研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2015ykc4)