靶向沉默動(dòng)脈粥樣硬化患者巨噬細(xì)胞中Notch基因?qū)F-κB經(jīng)典通路的影響

李偉 朱莉 阮中寶 任寅 王斌

·論著·

靶向沉默動(dòng)脈粥樣硬化患者巨噬細(xì)胞中Notch基因?qū)F-κB經(jīng)典通路的影響

李偉 朱莉 阮中寶 任寅 王斌

目的 探討Notch和NF-κB信號(hào)通路在動(dòng)脈粥樣硬化（AS）發(fā)病過程中的作用方式、兩者是否存在串話。方法 將AS患者外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞后，分別經(jīng)Notch1-siRNA、Notch2-siRNA、Notch3-siRNA以及NC-siRNA轉(zhuǎn)染。使用RT-PCR和Western Blot法檢測轉(zhuǎn)染后各組P65、IκBα基因以及蛋白表達(dá)情況。EMSA法檢測轉(zhuǎn)染后各組NF-κB活性。免疫熒光法檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)P65分布。兩組間資料差異比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。結(jié)果 RT-PCR結(jié)果顯示，siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后，Notch3-siRNA組、Notch2-siRNA組、Notch1-siRNA組中P65基因表達(dá)水平漸次降低（分別為0.709±0.007、0.557±0.031、0.114± 0.014），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 709.224，P ＜ 0.001），且較空白及陰性對照組均出現(xiàn)明顯下降（P ＜ 0.05），Noch1-siRNA組下降最顯著；而IκBα表達(dá)水平漸次升高（分別為1.811±0.172、3.253±0.169、5.295±0.433），組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 112.290，P ＜ 0.001），并均明顯高于空白、陰性對照組（P ＜ 0.05），也以Noch1-siRNA組變化最明顯。Western-Blot方法檢測所得P65、IκBα蛋白表達(dá)結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。Notch-siRNA轉(zhuǎn)染后的巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性均顯著低于空白對照組和陰性對照組，Notch1-siRNA組活性下降最顯著。巨噬細(xì)胞核內(nèi)及胞漿內(nèi)P65蛋白的熒光強(qiáng)度Notch1-siRNA組（21 405.20±929.91）、Notch2- siRNA組（25 987.13± 911.40）、Notch3-siRNA組（28 074.67±452.16）較空白對照組（57 238.33±1 059.21）以及陰性對照組（55 844.27±1331.10）均不同程度減弱（P均＜ 0.01），且細(xì)胞核內(nèi)熒光強(qiáng)度較核外更低，以Notch1-siRNA組減弱最明顯（組間比較F = 55.137，P ＜ 0.001）。結(jié)論 AS患者巨噬細(xì)胞中Notch與NF-κB經(jīng)典通路之間存在正向調(diào)節(jié)，且Notch1通路較Notch2、Notch3對NF-κB經(jīng)典通路的調(diào)節(jié)作用更顯著。

Notch； NF-κB； 基因表達(dá)； 動(dòng)脈粥樣硬化； 巨噬細(xì)胞

心血管疾病是長期困擾人類健康的惡性疾病之一，其中動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發(fā)病率逐年上升，已成為老年死亡的重要原因。近年來認(rèn)為AS是一種炎性免疫性疾病，其始動(dòng)環(huán)節(jié)為天然免疫反應(yīng)的激活，而在天然免疫反應(yīng)過程中巨噬細(xì)胞起著極其重要的作用[1-2]。大量深入的研究提示NF-κB信號(hào)通路參與AS發(fā)病。作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子NF-κB廣泛參與了免疫炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡以及增殖的調(diào)控，控制著AS形成中起關(guān)鍵作用的多種基因轉(zhuǎn)錄[3]。Notch信號(hào)通路是目前發(fā)現(xiàn)的參與細(xì)胞增殖、分化以及凋亡的一類十分重要的信號(hào)家族，廣泛表達(dá)于各類免疫細(xì)胞表面[4]。通過Notch信號(hào)通路在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，研究者推測其可能與AS存在相關(guān)性，且已在研究中得到部分證實(shí)[5-6]，但是到目前為止并沒有統(tǒng)一的結(jié)論。已有研究顯示，在其他細(xì)胞中NF-κB與Notch信號(hào)通路存在一定串話關(guān)系[7-10]，但兩者在巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)AS過程中是否存在聯(lián)系及如何聯(lián)系尚不明確。Notch信號(hào)通路是否與NF-κB“經(jīng)典”或“非經(jīng)典”通路之間存在影響有待進(jìn)一步研究明確。本研究旨在探索Notch和NF-κB信號(hào)通路在AS發(fā)病過程中的作用方式、兩者是否存在影響，從而為AS防治提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

材料與方法

一、主要實(shí)驗(yàn)材料與試劑

Notch1、2、3-siRNA購自上海吉瑪制藥有限公司，Lipofectamine 2000、RNA提取試劑Trizol以及GAPDH、IκBα、P65的引物均購自美國Invitrogen公司。RT-PCR試劑盒來自美國Thermo Fisher公司，引物經(jīng)南京凱基生物公司合成。免疫印跡實(shí)驗(yàn)中核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒，P65、IκBα的一抗，ECL檢測試劑盒以及二抗（羊抗兔IgG）均購自泰州市百英生物公司。凝膠阻滯分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）檢測試劑盒、疫熒光實(shí)驗(yàn)中試劑盒亦購自泰州市百英生物科技有限公司，P65抗體購自南京凱基生物公司。

二、方法

（一）單核細(xì)胞誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞

采集經(jīng)冠脈造影檢查明確為AS的3例患者外周靜脈血各20 ml并使用肝素抗凝。將所采集靜脈血與等體積磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）混勻，按1∶1體積比加入至淋巴細(xì)胞分離液，離心出靜脈血中單核細(xì)胞。再經(jīng)PBS洗滌后加入到含100 ml/L 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的RPMI 1640培養(yǎng)基中經(jīng)37 ℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱孵育，每隔24 ～ 48 h按懸浮細(xì)胞傳代方法1∶2 ～ 1∶3傳代1次，最后選取3 ～ 5代的細(xì)胞按（0.5 ～1.0）×106/ml的細(xì)胞密度接種于6孔板中，加入濃度為100 ng/ml的佛波醇酯（phorbol ester，PMA）刺激24 ～ 48 h，細(xì)胞由懸浮轉(zhuǎn)為貼壁，體積增大，形狀轉(zhuǎn)為梭形、橢圓形或伸出偽足，說明已誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)前將巨噬細(xì)胞細(xì)胞置入RPMI1640培養(yǎng)基孵育12 h，確保實(shí)驗(yàn)時(shí)其處于靜止?fàn)顟B(tài)。

（二）Notch-siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞

接種靜止?fàn)顟B(tài)的巨噬細(xì)胞至細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入不含抗生素的培養(yǎng)基，確保轉(zhuǎn)染的細(xì)胞密度達(dá)到30％～ 50％。用250 μl無血清培養(yǎng)基Opti-MEM分別稀釋5 μl的siRNA貯存液，混勻后室溫孵育5 min。同時(shí)用250 μl Opti-MEM稀釋5 μl脂質(zhì)體2 000（lipo 2 000），混勻后室溫孵育5 min。將上述2種液體合并混勻，室溫下孵育20 min后加入含有巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，輕輕混勻。培養(yǎng)4 ～ 6 h后重新更換培養(yǎng)基。隨后將培養(yǎng)板置于37℃、50 ml/L CO2培養(yǎng)箱孵育24，48，72 h后收樣，待行各項(xiàng)檢測。實(shí)驗(yàn)設(shè)置Notch-1 siRNA組、Notch-2 siRNA組、Notch-3 siRNA組、陰性對照組以及空白對照組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。（siRNA及陰性對照引物序列見表1）

（三）RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染組NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵基因P65、IκBα的表達(dá)

使用Trizol試劑盒提取轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞總RNA，按說明書配成逆轉(zhuǎn)錄體系，在PCR擴(kuò)增儀上孵育得到cDNA產(chǎn)物。以cDNA第—鏈為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)（反應(yīng)引物序列見表2）。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像并掃描分析，將目的基因PCR產(chǎn)物分析值與甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）掃描值相比，所得比值表示mRNA的表達(dá)水平。

表1 引物組序列

表2 IκBα、P65以及GAPDH的引物序列

（四）Western-blot方法檢測各組NF-κB信號(hào)通路中IκBα、P65蛋白的表達(dá)

收集完各組細(xì)胞后，加入100 μl預(yù)冷的細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min，提取細(xì)胞總蛋白，按照Lowry法行蛋白定量。常規(guī)制膠、上樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將相關(guān)的蛋白質(zhì)區(qū)帶轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，與一抗（抗IκBα、抗P65）和二抗（羊抗兔 IgG）反應(yīng)。經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色后使用BOX ChemiXR5成像，計(jì)算機(jī)軟件處理分析。實(shí)驗(yàn)以GAPDH作為內(nèi)參。

（五）EMSA方法檢測NF-κB活性

使用核蛋白提取試劑盒提取巨噬細(xì)胞核蛋白，并行蛋白定量。依次加入超純水5 μl、EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液（5X）2 μl、細(xì)胞核蛋白2 μl共浴10 min后，加入標(biāo)記好的NF-κB寡核苷酸探針（序列為5'-TCAGAGGGGACTTTCCGAGAGG-3'，末端加γ-[32P]ATP標(biāo)記）1 μl至總體積10 μl，共浴20 min后，6.5％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用BOX chemiXR5凝膠成像系統(tǒng)成像，最后用Gel-Pro32軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

（六）免疫熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)P65分布

自然晾干細(xì)胞樣本，經(jīng)4％多聚甲醛固定后行抗原修復(fù)、3％H2O2-甲醇溶液滅活酶，滴加即用型山羊血清溫室孵育20 min。加入1％牛血清白蛋白溶液（BSA）稀釋的鼠抗人P65一抗100 μl，37℃濕盒孵育2 h，PBS浸洗3次。加用1％BSA稀釋的異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 100 μl，37 ℃避光孵育1 h。DAPI染細(xì)胞核后封片，熒光顯微鏡下測定細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，取3個(gè)高表達(dá)區(qū)域照相留存。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，沉默巨噬細(xì)胞Notch1、2、3受體后所測得的RT-PCR、Western-bolt以及免疫熒光用± s表示，兩組間資料差異比較采用t檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析。以P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

表3 轉(zhuǎn)染后各組Notch基因的表達(dá)（n = 3± s）

表3 轉(zhuǎn)染后各組Notch基因的表達(dá)（n = 3± s）

分組Notch1Notch2Notch3陰性對照組1.021±0.2451.175±0.1201.021±0.129轉(zhuǎn)染組0.133±0.0260.177±0.0040.130±0.013 t 值 55.067 14.384 11.866 P值＜ 0.001＜ 0.001＜ 0.001

一、沉默效果觀察

分別轉(zhuǎn)染Notch1、2、3 siRNA以及NC-siRNA 48 h后對各組細(xì)胞Notch基因進(jìn)行RT-PCR檢測（結(jié)果見表3），與陰性對照組比較，3組抑制率分別為（86.930±1.418）％、（84.818±1.560）％、（87.275± 0.372）％，沉默效果滿意，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（表3）

二、RT-PCR法檢測NF-κB通路中P65、IκBα基因的表達(dá)

結(jié)果顯示，空白對照組與陰性對照組比較，P65、IκBα基因表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。Notch3-siRNA組、Notch2-siRNA組、Notch1-siRNA組中P65表達(dá)水平漸次降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01），且較空白及陰性對照組均出現(xiàn)明顯下降（P ＜ 0.05），Notch1-siRNA組下降最顯著。而IκBα表達(dá)水平漸次升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜ 0.01），并均明顯高于空白、陰性對照組（P ＜0.05），Notch1-siRNA組上升最顯著。（表4）

表4 P65、IκBα在各組細(xì)胞中的表達(dá)（n = 3，± s）

表4 P65、IκBα在各組細(xì)胞中的表達(dá)（n = 3，± s）

注：與空白對照組比較，aP ＜ 0.05；與陰性對照組比較，bP ＜ 0.05；與Notch1-siRNA組比較，cP ＜ 0.05；與Notch2-siRNA組比較，dP ＜ 0.05

分組P65IκBα空白對照組1.004±0.1051.003±0.087陰性對照組1.043±0.0961.027±0.052 Notch1-siRNA組 0.114±0.014ab5.295±0.433abNotch2-siRNA組 0.557±0.031abc3.253±0.169abcNotch3-siRNA組 0.709±0.007abcd1.811±0.172abcdF值122.149194.338 P值 ＜ 0.001 ＜ 0.001

三、Western Blot檢測各組巨噬細(xì)胞中P65、IκBα蛋白的表達(dá)

結(jié)果與RT-PCR一致，NF-κB通路的關(guān)鍵亞基蛋白P65表達(dá)水平較空白、陰性對照組均顯著下降[分別為（16.882±0.842）％、（27.961± 0.227）％、（34.992±0.421）％比（44.153±0.394）％、（44.715 ±1.074）％，t = 77.556、77.610、99.634、43.453、31.092、14.651，P均＜ 0.01]，且在Notch3、2、1-siRNA各組中依次下降，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 800.178，P ＜ 0.01）。IκBα蛋白表達(dá)較空白、陰性對照組顯著升高[分別為（64.534±2.603）％、（48.919±0.631）％、（28.919±0.553）％比（3.239± 1.144）％、（22.508±0.317）％，P = 0.000、0.000、0.023、0.000、0.000、0.002]，且在Notch3、2、1-siRNA各組中漸次升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 387.853，P ＜ 0.01）。沉默Noch1對P65、IκBα蛋白表達(dá)水平影響最明顯。（圖1）

四、EMSA檢測沉默Notch1、2、3基因?qū)F-κB活性的影響

結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染Notch3、2、1-siRNA后各組NF-κB活性均顯著低于空白對照組和陰性對照組，且呈漸次下降，Notch1-siRNA組的活性下降最顯著。（圖2）

圖1 各組P65、IκBα蛋白表達(dá)水平的Western Bolt檢測結(jié)果

圖2 NF-κB在各組中的DNA結(jié)合活性

五、免疫熒光法檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)P65分布

Notch1、2、3受體基因分別受到沉默后，巨噬細(xì)胞核內(nèi)及胞漿內(nèi)P65蛋白的熒光強(qiáng)度（分別為Notch1-siRNA組21405.20±929.91、Notch2-siRNA組25987.13±911.40、Notch3-siRNA組28074.67± 452.16）較空白對照組（57238.33±1059.21）以及陰性對照組（55844.27±1331.10）均不同程度減弱（t = 44.033、28.737、43.860、36.736、32.056、34.214，P均＜0.01；n = 3)，且細(xì)胞核內(nèi)熒光強(qiáng)度較核外更低，以上變化以Notch1-siRNA組最明顯，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 55.137，P ＜ 0.001）。（圖3）

圖3 生物熒光倒置顯微鏡下觀察沉默巨噬細(xì)胞中Notch受體后p65亞基定位分布情況 （DAPI染色×400）

討 論

Notch與NF-κB信號(hào)通路在AS發(fā)病過程中均起著重要的調(diào)控作用，但前者對后者是否存在影響及可能存在的影響機(jī)制尚不明確。Notch信號(hào)通路包括Notch受體、配體、細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子以及Notch的調(diào)節(jié)分子等。哺乳動(dòng)物中Notch受體包括Notch1-4，Notch配體包括Jagged1、Jagged2和DLL1，3，4[12]。Notch配體與受體相互作用后，釋放胞內(nèi)活性結(jié)構(gòu)（NICD）入胞質(zhì)，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，從而活化下游靶基因，發(fā)揮生物學(xué)作用。鑒于Notch信號(hào)通路中研究較多的是Notch1、2、3受體，本課題根據(jù)這三者間的同源保守序列設(shè)計(jì)siRNA序列，并成功轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，分別沉默細(xì)胞中Notch1、2、3基因，構(gòu)建Notch低表達(dá)的AS患者外周血單核－巨噬細(xì)胞模型，在上述siRNA轉(zhuǎn)染后的巨噬細(xì)胞中采用熒光定量RT-PCR、Western Blot、EMSA、免疫熒光等技術(shù)檢測NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵基因以及蛋白的表達(dá)變化。

siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后，Notch3-siRNA組、Notch2-siRNA組、Notch1-siRNA組中P65基因及蛋白表達(dá)水平漸次降低，Noch1-siRNA組下降最顯著。而IκBα表達(dá)水平漸次升高，也以Noch1-siRNA組變化最明顯。Notch信號(hào)通路被阻斷后，各組NF-κB的結(jié)合活性均出現(xiàn)顯著降低，同樣以Notch1 siRNA組降低最明顯。激光共聚焦顯微鏡下可看出，AS患者巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA后，細(xì)胞核以及胞漿中P65蛋白的表達(dá)出現(xiàn)減弱，以核內(nèi)表達(dá)減弱相對較明顯。以上結(jié)果表明，Notch信號(hào)通道受到抑制后，可以在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)NF-κB功能亞基P65的表達(dá)，上調(diào)NF-κB抑制因子IκBα的表達(dá)，抑制P65蛋白向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，同時(shí)還降低核蛋白NF-κB的DNA結(jié)合活性，從而影響下游基因的轉(zhuǎn)錄活性，最終導(dǎo)致NF-κB信號(hào)通路受到抑制。Notch1受體基因阻斷后對NF-κB通路活性的影響較其他兩種受體（Notch2、3）更為顯著。

近年來研究顯示，Notch與NF-κB兩個(gè)信號(hào)通路之間的串話關(guān)系、機(jī)制非常復(fù)雜，有正向調(diào)節(jié)，也有負(fù)向調(diào)節(jié)，其作用機(jī)制與細(xì)胞類型有關(guān)。例如在骨髓造血干細(xì)胞中，Notch1可通過上調(diào)P50、P56、RelB和c-Rl的表達(dá)，以激活NF-κB信號(hào)通路[11]，而在人宮頸癌HeLa細(xì)胞中，Notch1下調(diào)P50的表達(dá)，增加細(xì)胞質(zhì)中IκB的表達(dá)，抑制NF-κB通路活性[13]。本研究顯示，在AS患者巨噬細(xì)胞中Notch信號(hào)通路對NF-κB信號(hào)通路具有正向調(diào)節(jié)作用。筆者推測Notch基因被沉默后，其細(xì)胞內(nèi)活性結(jié)構(gòu)NICD的表達(dá)可能受到抑制，進(jìn)而介導(dǎo)下游NF-κB通路失活?，F(xiàn)研究已得出在其他細(xì)胞中，NICD可以通過細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子CSL介導(dǎo)或直接與NF-κB亞基結(jié)合而影響NF-κB通道活性。如某些CSL反應(yīng)元件對P100啟動(dòng)子具有轉(zhuǎn)錄激活作用。Notch與特定的CSL反應(yīng)元件結(jié)合后，可將其激活為轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而增加P100（P52前體）的表達(dá)，并最終導(dǎo)致NF-κB通路的激活[14]。NICD還可與IKK信號(hào)復(fù)合體作用，啟動(dòng)其降解IκBα的激酶活性，進(jìn)而激活經(jīng)典NF-κB信號(hào)途徑[7]。巨噬細(xì)胞中可能也存在類似激活機(jī)制，當(dāng)NICD受抑制后，無法促進(jìn)NF-κB通路中IκBα的降解以及上調(diào)P65的表達(dá)。正常情況下，在NF-κB信號(hào)通路中IκB與其功能亞基（如P65、P52）結(jié)合，使其處于細(xì)胞質(zhì)中，抑制其轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)而發(fā)揮作用。同時(shí)IκB還能將NF-κB由細(xì)胞核輸出至細(xì)胞質(zhì)，以阻斷其DNA活性[15]。當(dāng)Notch通路阻斷后，一方面NF-κB通路中IκBα表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致P65蛋白處于結(jié)合狀態(tài)，難以釋放入核；另一方面P65從轉(zhuǎn)錄水平受到下調(diào)，導(dǎo)致P65蛋白表達(dá)量下降，入核進(jìn)一步減少，活性下降。幾方面共同作用，抑制NF-κB經(jīng)典信號(hào)通路啟動(dòng)[16]，從而使其下游一系列基因的表達(dá)受到負(fù)向調(diào)節(jié)，阻止炎癥、免疫反應(yīng)啟動(dòng)。

綜上所述，本研究初步揭示了在AS患者巨噬細(xì)胞中，Notch和NF-κB經(jīng)典信號(hào)通路之間具有正向調(diào)節(jié)關(guān)系，且Notch1較Notch2、3對NF-κB信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用更顯著。本研究結(jié)果目前國內(nèi)未見報(bào)道，為AS治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。然而，兩者之間具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待進(jìn)一步的探究。

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Effects of silencing Notch genes on NF-κB classic pathway in macrophages of patients with atherosclerosis

Li Wei, Zhu Li, Ruan Zhongbao, Ren Yin, Wang Bin. Department of Cardiology, Taizhou People's Hospital, Taizhou 225300, China

Zhu Li, Email:tzheart@126.com

Objective To investigate the mechanism and crosstalk between Notch and NF-κB signaling pathway in macrophages of patients with atherosclerosis (AS). Methods The mononuclear cells from peripheral blood of patients with AS were induced into macrophages, which were then silenced by Notch1-siRNA, Notch2-siRNA, Notch3-siRNA and NC-siRNA. RT-PCR and Western blot were applied to assess the expression levels of P65 and IκBα in the NF-κB signaling pathway. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) was used to observe the NF-κB DNA binding activity. Subcellular distributions of P65 was detected with immunofluorescence. t test was used to compare the difference of data between two groups. One-way analysis of variance was used to compare the difference among groups. Results RT-PCR results showed that, after Notch-siRNA being transfected into macrophages, the expression of P65 declined in the Notch-3 siRNA group(0.709±0.007), the Notch-2 siRNA group (0.557±0.031), and the Notch-1siRNA group (0.114± 0.014) (P ＜ 0.01), all of which were lower than the control (1.004±0.105) group and the negative control group (1.043±0.096) (P ＜ 0.05).The expression of IκBα (1.811±0.172, 3.253± 0.169, 5.295±0.433) increased (P ＜ 0.01), all of which were greater than the control (1.003±0.087) group and the negative control group (1.027±0.052) (P ＜ 0.05), especially in Notch1-siRNA group. The results of Western Blot were in accordance with those of RT-PCR. The NF-κB DNA binding activity were inhibited. The fluorescence intensity of P65 decreased both in the nucleus and cytoplasm compared to the control group and the negative control group (P ＜ 0.01), which declined more obviously in the nucleus. Conclusions A positive relationship may exist between Notch signaling pathway and NF-κB classic pathway in the macrophages of patients with AS. Notch1 pathway may play a more important role in the regulation on NF-κB signaling pathway than Notch2 and Notch 3.

Notch； NF-κB； Gene expression； Atherosclerosis(AS) Macrophages

2016-02-18）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.06.001

泰州市社會(huì)發(fā)展基金（81570748）

225300 泰州，揚(yáng)州大學(xué)附屬泰州市人民醫(yī)院胸痛中心

朱莉，Email：tzheart@126.com

李偉，朱莉，阮中寶，等. 靶向沉默動(dòng)脈粥樣硬化患者巨噬細(xì)胞中Notch基因?qū)F-κB經(jīng)典通路的影響[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志∶電子版, 2016, 6(6)∶327-333.