人臍帶間充質(zhì)干細胞對膠質(zhì)瘤細胞株U87上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及皮下荷瘤能力的影響

劉高米洋和法蓮陳慧芬陸容李自安何潔趙晶潘興華

·論著·

人臍帶間充質(zhì)干細胞對膠質(zhì)瘤細胞株U87上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及皮下荷瘤能力的影響

劉高米洋1和法蓮2陳慧芬2陸容3李自安1何潔1趙晶1潘興華1

目的 研究人臍帶間充質(zhì)干細胞（hUCMSCs）體外模型中對膠質(zhì)瘤細胞株U87荷瘤能力及其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響及其可能機制。方法 建立裸鼠皮下荷瘤模型，觀察hUCMSCs與U87共培養(yǎng)組和U87單獨荷瘤組皮下荷瘤能力的差別，免疫組化檢測EMT相關基因組織表達水平，Western Blot檢測EMT相關蛋白MMP2，MMP7,MMP9，E-cadherin（E-cad），N-cadherin（N-cad）和Vimentin（VIM）表達情況，qPCR檢測EMT相關基因（mmp2，mmp7，mmp9，E-cad，N-cad和vimentin）轉(zhuǎn)錄水平。Transwell和Matrigel分別檢測hUCMSCs對U87轉(zhuǎn)移能力的影響，兩組間比較擬采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。結果 皮下荷瘤結果提示hUCMSCs與U87共培養(yǎng)組皮下荷瘤率高于U87單獨荷瘤組，且腫瘤體積較大，RT-PCR結果提示：共培養(yǎng)組和單獨培養(yǎng)組相比，E-cad水平下調(diào)，N-cad和VIM上調(diào)，且基質(zhì)金屬蛋白酶家族MMP2，MMP7，MMP9也有不同程度上調(diào)。Western blot結果提示：在蛋白水平共培養(yǎng)組和單獨培養(yǎng)組相比，E-cad水平下調(diào)2.1倍，N-cad和VIM上調(diào)1.0倍，MMP9上調(diào)0.9倍；E-cad，N-cad，VIM以及MMP2變化結果與RT-PCR結果一致。免疫組化結果進一步驗證hUCMSCs能促進U87表達Ki67，E-cad與N-cad低表達。Transwell和Matrigel實驗結果提示hUCMSCs能夠促進U87細胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力。結論 hUCMSCs能通過促進U87高表達EMT相關基因和增殖相關基因Ki67，從而促進膠質(zhì)瘤細胞株U87皮下腫瘤形成并發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，提示hUCMSCs臨床應用中應該充分考略受試者是否是潛在膠質(zhì)瘤患者。

臍帶； 間質(zhì)干細胞； 膠質(zhì)瘤； 生物轉(zhuǎn)化

人臍帶間充質(zhì)干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）是目前研究最多、最具有應用前景的一類成體干細胞，被證明能夠修復組織損傷，治療某些難治性疾病。hUCMSCs和骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）及脂肪來源的MSCs相比具有其獨特的優(yōu)勢：取材方便，環(huán)保，“廢物”再利用，容易擴增。近年來，研究發(fā)現(xiàn)MSCs能夠定向遷移到某些特定的腫瘤部位，一部分研究顯示MSCs能夠促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但也有學者報道遷移到腫瘤部位的MSCs有抑制腫瘤生長的作用。hUCMSCs長期植入體內(nèi)可能造成分化不良和潛在的腫瘤形成能力不明[1]，成為hUCMSCs臨床轉(zhuǎn)化應用的絆腳石。

腦膠質(zhì)瘤是起源于腦部神經(jīng)膠質(zhì)細胞，是最常見的顱內(nèi)腫瘤，約占所有顱內(nèi)腫瘤的45％左右。在兒童惡性腫瘤中排第2位，近30年來，原發(fā)性惡性腦腫瘤發(fā)生率逐年遞增，年增長率為1.2％，中老年人群尤為明顯。據(jù)文獻報道，中國腦膠質(zhì)瘤年發(fā)病率為3 ～ 6人/10萬人，年死亡人數(shù)達3萬人[2]。膠質(zhì)瘤系浸潤性生長物，它和正常腦組織沒有明顯界限，難以完全切除，對放療化療不敏感，易復發(fā)，生長在大腦等重要部位的良、惡性腫瘤，手術難以切除或根本不能手術，化學藥物和一般抗腫瘤的中藥，因血腦屏障等因素的影響，療效也不理想，因此腦膠質(zhì)瘤至今仍是預后最差的腫瘤之一。

因此，本課題選取惡性膠質(zhì)瘤細胞株U87為實驗對象，通過裸鼠皮下荷瘤模型探索hUCMSCs在體內(nèi)對膠質(zhì)瘤細胞的影響，為hUCMSCs臨床應用提供實驗參考。

材料和方法

一、材料

1.主要試劑和器材：DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），胎牛血清（美國BI公司），雙抗（美國BI公司），Trizol（美國Invitrigen公司），GoTag qPCR Master Mix（美國Promega公司），Anti-Ki67 antibody、Anti-E-cadherin antibody、Anti-N-cadherin antibody、anti-GAPDH antibody、兔anti Mouse IgG H＆amp;L（HRP）、羊 anti Rabbit IgG H＆amp;L（HRP）（美國Abcam公司），qPCR引物由thermo公司設計合成，牛血清白蛋白（美國Sigma公司），BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo fsher公司），百萬層級層流超凈工作臺（SW-CL-2F型，蘇州佳寶凈化工程設備有限公司），細胞培養(yǎng)37℃的CO2孵箱（美國Thermo公司），電泳槽（美國Bio-rad公司），倒置相差顯微鏡（日本奧林巴斯公司），多功能酶標儀（美國Biotc公司），Matrigel Invasion Chamber（BD公司），Transwell Chamber（美國Costar公司），免疫組化石蠟包埋機（德國Leica公司），免疫組化切片機（德國Leica公司），半干轉(zhuǎn)膜儀（美國Thermo公司），熒光實時定量PCR儀（美國Bio-rad公司）。

2.細胞株和實驗動物：U87購自昆明動物所，hUCMSCs來自本實驗室分離培養(yǎng)的剖腹產(chǎn)臍帶3 ～ 5代MSCs，4 ～ 5周齡雄性BALB/C nude mouse購自北京維通利華公司。

二、方法

1. hUCMSCs分離和培養(yǎng)：在征得產(chǎn)婦及其家屬知情同意并且通過醫(yī)院倫理委員會批準情況下，取本院足月剖腹產(chǎn)新生兒臍帶，經(jīng)檢測產(chǎn)婦無傳染性疾病，胎兒無先天性疾病和畸形。無菌條件下，將采集的臍帶用生理鹽水反復沖洗，去掉殘留血液。將臍帶剪碎為1 mm3組織塊，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，用含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日補液，3 d后換液，7 d后觀察細胞生長狀態(tài)，達到80％融合后傳代培養(yǎng)。

2.皮下荷瘤模型：采用對數(shù)生長期U87和第3代hUCMSCs，分別制成單細胞懸液，計數(shù)細胞密度，用生理鹽水調(diào)節(jié)細胞密度為1×107/ml，對照組裸鼠右后股處皮下注射U87細胞懸液200 μl共2× 106個細胞，實驗組按照U87：hUCMSCs = 10∶1的比例混合制備成U87-hUCMSCs細胞混合液后裸鼠右后股處皮下注射200 μl細胞懸液，細胞總數(shù)為2× 106個。每隔1周測量裸鼠皮下腫瘤長徑和短徑，1個月后處死裸鼠剝離腫瘤。拍照后浸泡在福爾馬林中備用。測量腫瘤長徑a和短徑b，按照V = 0.5× ab2計算腫瘤體積，進行統(tǒng)計學分析

3.免疫組化染色：將皮下荷瘤實驗中獲得的腫瘤標本進行石蠟包埋后切片，厚度2 μm，石蠟切片60℃烤箱過夜，切片脫蠟至水，3％過氧化氫甲醇液中室溫浸泡20 min，雙蒸水洗5 min 3次，抗原修復后自然冷卻至室溫，雙蒸水洗5 min 3次，1％ BSA 37℃封閉30 min，甩去封閉液，直接加一抗。置于濕盒中37℃孵育30 min，然后4℃冰箱過夜（16 h），4℃冰箱中取出，室溫復溫15 min，用0.01 mol/L PBS 洗5 min 4次，滴加DAKO二抗，37℃孵育45 min，用0.01 mol/L PBS 洗5 min 4次，DAB顯色，鏡下觀察，雙蒸水終止顯色，蘇木素復染10 s，分化后自來水反藍，蓋玻片覆蓋，顯微鏡下觀察陽性顯色，拍照。

4.轉(zhuǎn)移侵襲能力檢測：（1）transwell實驗：于24孔板中分別種入0，1.0×104，2.0×104，3.0×104個第5代對數(shù)生長期hUCMSCs，無血清培養(yǎng)12 h后在8 μm Transwell Chamber中種入無血清培養(yǎng)的1.5×104個U87，將小室輕輕放入已種入MSCs的24孔板中，24 h后去除小室和24孔板中培養(yǎng)基，生理鹽水洗2次，風干片刻，4％甲醛固定30 min，去除甲醛，生理鹽水洗3次，風干片刻，結晶紫染色30 min，拍照并計數(shù)細胞。（2）Matrigel實驗：于24孔板中分別種入0，1.0×104，2.0×104，3.0×104個第五代對數(shù)生長期hUCMSCs，無血清培養(yǎng)12 h后在8 μm Matrigel Chamber中種入無血清培養(yǎng)的4.5× 104個U87，將小室輕輕放入已種入MSCs的24孔板中，24 h后去除小室和24孔板中培養(yǎng)基，生理鹽水洗2次，風干片刻，4％甲醛固定30 min，去除甲醛，生理鹽水洗3次，風干片刻，結晶紫染色30 min，拍照并計數(shù)細胞。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用Graphpad統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，皮下荷瘤腫瘤體積統(tǒng)計結果采用± s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、hUCMSCs的分離培養(yǎng)

原代hUCMSCs培養(yǎng)24 h后可見少量細胞（細胞計數(shù)為68 ～ 85/mm3）貼壁生長（圖1a），2 d后可見較多細胞爬出（圖1b），傳到第3代后細胞轉(zhuǎn)移時呈纖維樣（圖1c），稠密呈漩渦狀生長（圖1d），達到100％融合時T175細胞培養(yǎng)瓶細胞計數(shù)平均為每瓶1.5×107個。

二、hUCMSCs可促進U87的裸鼠皮下成瘤能力

本研究建立了裸鼠皮下荷瘤模型，實驗組將U87和hUCMSCs按照10 ∶1比例混合，對照組為等數(shù)目的U87細胞懸液，每周觀測瘤直徑，1個月后脫臼法處死裸鼠，剝離腫瘤，實驗結果顯示：hUCMSCs共培養(yǎng)組腫瘤體積平均值為（29.46± 5.64）mm3，U87組腫瘤體積平均值為（6.77± 1.57）mm3，hUCMSCs共培養(yǎng)組較U87組瘤體積更大（P = 0.0033），差異具有統(tǒng)計學意義（圖2）。

三、hUCMSCs誘導U87的EMT特性

將皮下荷瘤模型所得標本進行HE染色（圖3），結果提示hUCMSCs接觸式共培養(yǎng)組細胞排列無序無序，細胞核漿比升高，提示其惡性程度更高。免疫組織化學檢測增殖指標Ki67和EMT標志物E-cad和N-cad，結果提示（圖4）hUCMSCs共培養(yǎng)組Ki67和E-cad強染色，而N-cad弱染色，U87單獨培養(yǎng)組Ki67和E-cadherin弱染色、N-cadherin強染色。提示組織層面，hUCMSCs接觸式共培養(yǎng)條件下U87增殖能力增強并且可能通過EMT促進腫瘤轉(zhuǎn)移。

本研究利用qPCR和Westernblot檢測EMT相關基因mRNA和蛋白水平，結果（圖5）顯示，共培養(yǎng)組EMT標志物E-cad，N-cad和twist1均上調(diào)，基質(zhì)金屬蛋白酶家族中mmp2，mmp7和mmp9也明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義。Western blot檢測E-cad、N-cad和mmp9蛋白水平，結果顯示（圖6）共培養(yǎng)組E-cad下調(diào)，N-cad和mmp9上調(diào)，提示hUCMSCs促進U87發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

四、hUCMSCs促進U87轉(zhuǎn)移侵襲

為進一步明確hUCMSCs對U87轉(zhuǎn)移能力的影響，本研究利用Transwell和Matrigel法建立非接觸式共培養(yǎng)體系。結果顯示：hUCMSCs在非接觸條件下能夠促進U87轉(zhuǎn)移（圖7）和侵襲（圖8）；Transwell實驗中，100倍視野下，hUCMSCs組穿過小室細胞計數(shù)平均值為312個細胞，U87組細胞計數(shù)平均值為109個細胞（P ＜ 0.01），差異具有統(tǒng)計學意義；在Matrigel實驗中，100倍視野下，hUCMSCs組穿過小室細胞計數(shù)平均值為256個細胞，U87組細胞計數(shù)平均值為102個細胞（P = 0.015），差異具有統(tǒng)計學意義。

圖1 倒置顯微鏡下觀察臍帶間充質(zhì)干細胞的生長形態(tài) （×40）

圖2 皮下荷瘤實驗檢測接觸式共培養(yǎng)MSC對U87細胞成瘤能力的影響

圖3 倒置顯微鏡下觀察裸鼠皮下荷瘤 （HE染色×40）

圖4 倒置顯微鏡下觀察裸鼠皮下荷瘤免疫組化結果 （×40）

圖5 qPCR檢測EMT相關分子轉(zhuǎn)錄水平

討 論

圖6 Western blot檢測結果

MSCs具有強大的自我復制能力和多向分化潛能，在特定條件下可以分化形成多種功能細胞，是生物體保持形態(tài)與功能正常的重要基礎，參與生物體生長、發(fā)育和損傷修復等多種生物學過程。MSCs來源廣泛、取材方便，同時具有造血支持和免疫調(diào)節(jié)功能，這使其成為有前途的臨床使用種子細胞。成體骨髓來源MSCs和hUCMSCs是研究最多最早的兩種MSCs，但由于其取材具有較強侵襲性，細胞的數(shù)量、增殖和分化能力隨供者年齡增長而顯著下降，容易被病毒感染，這些因素限制了骨髓MSCs的應用。和骨髓MSCs相比，hUCMSCs有較易取材、無倫理爭議、生物學性能更加穩(wěn)定、無異體排斥等優(yōu)點因此是細胞治療和細胞工程首選的種子細胞[3]。盡管如此，hUCMSCs的臨床轉(zhuǎn)化依然存在很多問題，首當其沖的就是長期移植后的安全性問題，包括其分化特征和潛在的腫瘤形成及促進能力[4-7]，因此明確hUCMSCs在體內(nèi)與腫瘤細胞，尤其是惡性腫瘤細胞的相互作用是hUCMSCs臨床轉(zhuǎn)化的必經(jīng)之路，本課題選取了易復發(fā)、放化療均不敏感的惡性膠質(zhì)瘤細胞株U87作為實驗對象，研究hUCMSCs在體內(nèi)狀況下能否促進U87的惡性轉(zhuǎn)化能力，為hUCMSCs的臨床應用提供數(shù)據(jù)支持，進一步明確hUCMSCs的安全性問題。

圖7 倒置顯微鏡下觀察穿過transwell小室U87及小室外hUCMSC形態(tài) （結晶紫染色 ×40 ）

圖8 倒置顯微鏡下觀察穿過Matrigel小室U87及小室外hUCMSC形態(tài) （結晶紫染色 ×40）

惡性膠質(zhì)瘤具有高生長率、高侵襲性、預后差、發(fā)現(xiàn)較晚，復發(fā)率較高，放化療不敏感的特點。膠質(zhì)瘤患者術后腫瘤細胞殘余被認為是復發(fā)的主要原因，因此這類型患者可能處于影像學不明的攜瘤狀態(tài)?！胺N子-土壤”學說[8]提示體外細胞模型不能完全代表體內(nèi)的實際情況，因此，本研究采用體內(nèi)模型直接觀察接觸式腫瘤細胞和hUCMSCs相互作用的結果。通過建立裸鼠皮下荷瘤模型，結果顯示hUCMSCs共培養(yǎng)組較U87組瘤體積更大并且在腫瘤剝離的過程中，觀察到共培養(yǎng)組的腫瘤血管生成明顯增加，提示hUCMSCs可能促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。HE的結果顯示共培養(yǎng)組細胞核異形程度更多，細胞排列不規(guī)律，核漿比顯著升高，說明hUCMSCs共培養(yǎng)組U87細胞形成的皮下腫瘤惡性程度較高。EMT與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關，是腫瘤惡性生物學行為的重要方面，因此，免疫組化中檢測了EMT的標志性分子E-cadherin和N-cadherin[9]，結果hUCMSCs抑制U87的EMT相關的E-cad表達，促進N-cad表達，提示hUCMSCs可能通過促進U87的EMT轉(zhuǎn)化進一步促進U87的轉(zhuǎn)移和侵襲。Ki67是細胞增殖的標志性蛋白，檢測Ki67顯示hUCMSCs共培養(yǎng)組Ki67染色較強，提示hUCMSCs具有促進U87增殖的作用。研究表明hUCMSCs能夠分泌抑濾泡素樣蛋白（PSTL1）通過調(diào)節(jié)增殖和分化有關生長因子發(fā)揮作用；胰島素樣生長因子結合蛋白3、4、5（IGFBP3，4，5）通過延長IGF的半衰期促進細胞生長；轉(zhuǎn)化生長因子β結合蛋白2（LTBP1）是TGF-β1前體復合物的一部分；硫酸軟骨素蛋白聚糖2（CSPG2）與聚合蛋白（AGRIN）參與了細胞生長與分化調(diào)節(jié)[10]。因此hUCMSCs可能是通過旁分泌作用，分泌多種蛋白活性成分從而促進腫瘤細胞的增殖和EMT。Western Blot和qPCR實驗結果分別從蛋白水平和RNA水平進一步驗證了上述實驗結果。Transwell和Matrigel法分別模擬了腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和突破基底膜的過程進一步證明了上述推論。

本課題研究表明，hUCMSCs在裸鼠皮下荷瘤模型中能夠促進U87細胞的成瘤能力且有促轉(zhuǎn)移的可能性，因此，臨床應用hUCMSCs治療神經(jīng)性損傷類疾病時有必要考慮hUCMSCs對潛在的膠質(zhì)瘤細胞的促瘤作用。

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Effects of human umbilical cord mesenchymal stem cell on epithelial-mesenchymal transition and growth of Glioma cell line U87

Liu Gaomiyang1, He Falian2,Chen Huifeng2, Lu Rong3, Li Zi'an1, He Jie1, Zhao Jing1, Pan Xinghua1.1Cell Biological Therapy Center of Kunming General Hospital, Chengdu Military Region of Chinese People‘s Army; Cell Biological Medicine Integrated Engineering Laboratory of State and Region of Yunnan Province, Kunming 650032, China;2Kunming General Hospital Clinical Collage of Kunming Medical University ,Kunming 650032, China;3Shanghai Children's Hospital, Shanghai 200062, China

Pan Xinghua, Email: panxinghua@aliyun.com

Objective To study the effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells（hUCMSCs）on growth of human glioma cell line U87 in vitro and epithelial-mesenchymal transition and its possible mechanism. Method The subcutaneous growth of U87 tumor in nude mice was compared between the U87 cells co-cultured with hUCMSCs and U87 cultured alone. The expression of EMT related genes was evaluated with immunohistochemistry. Expression of E-cad, N-cad andMMP9 was evaluated with Western blot for cultrued cells. RT-PCR was used to detect mRNA levels of EMT-associated gene. Using transwell and matrigel methods, the invasion and migration ability of U87 was evaluated. Independent sample t-test and ANOVA were used for comparison of data, which were expressed as mean ± standard deviation. Results IMore subcutaneous tumor was seen in nude mice inoculated with U87 cells co-cultured with hUCMSCs than U87 cells cultured alone, with upregulated expression of E-cadherin, mmp2, mmp7,and mmp9 and down-regulated expression of N-cad. Western blot showed the same results in E-cadherin,N-cadherin, vimentin and MMP2 changes with RT-PCR. Transwell and Matrigel results showed the migration and invasion of U87 was promoted by hUCMSCs. Conclusion hUCMSCs can promot EMT and proliferation of U87, suggesting that the potential tumor-promoting effects of hUCMSCs should be fully considered in clinical application of hUCMSC.

Umbilical Cord; Mesenchymal Stem Cells; Glioma; Biotransformation

2016-08-10）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2016.06.008

國家自然科學基金（No.81170316）

650032 昆明，成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院細胞生物治療中心，干細胞與免疫細胞生物醫(yī)藥技術國家地方聯(lián)合實驗室，云南省細胞治療技術轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室1；650032 昆明醫(yī)科大學成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院臨床學院2；200062 上海市兒童醫(yī)院中醫(yī)科3

潘興華，Email∶ panxinghua@aliyun.com

前兩位作者對本文具有相同貢獻，同為第一作者

劉高米洋，和法蓮，陳慧芬，等.人臍帶間充質(zhì)干細胞對膠質(zhì)瘤細胞株U87上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及皮下荷瘤能力的影響[J/CD].中華細胞與干細胞雜志∶電子版, 2016, 6(6)∶369-375.