新型靶向藥物拉帕替尼對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的影響

王 玥

中南大學(xué)藥學(xué)院 湖南省長(zhǎng)沙市 410083

新型靶向藥物拉帕替尼對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的影響

王 玥

中南大學(xué)藥學(xué)院 湖南省長(zhǎng)沙市 410083

目的：分析新型靶向藥物拉帕替尼對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的影響，評(píng)價(jià)拉帕替尼在卵巢癌治療中的價(jià)值。方法：采用體外實(shí)驗(yàn)研究，培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，進(jìn)行分組，包括低中高實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、模型組，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期，采用MTT方法檢測(cè)細(xì)胞活力。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組人卵巢癌細(xì)胞SKOVS細(xì)胞活力、細(xì)胞周期與對(duì)照組、模型組組間比較存在顯著差異（P＜0.05），低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組指標(biāo)呈現(xiàn)階梯變化。結(jié)論：拉帕替尼對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)。

拉帕替尼；卵巢癌；靶向藥物

卵巢是腫瘤好發(fā)部位，卵巢癌是最常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，我國(guó)發(fā)病率約為7‰～10‰，多見(jiàn)于圍絕經(jīng)期女性，近年來(lái)卵巢癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。卵巢癌危害較大，我國(guó)卵巢癌死亡率約為1.45/10萬(wàn)，是死亡率最高的惡性腫瘤，高于宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌[1]。卵巢癌發(fā)病、進(jìn)展機(jī)制較復(fù)雜，治療難度大，近年來(lái)有關(guān)于卵巢癌的發(fā)病生物學(xué)、分子學(xué)機(jī)制研究越來(lái)越深入，以表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）為靶點(diǎn)的藥物，并開(kāi)始用于臨床[2]。拉帕替尼是一種經(jīng)典的以EGFR為靶點(diǎn)的抑制劑，其應(yīng)用時(shí)間相對(duì)較晚，本次研究試以人卵巢癌細(xì)胞SKOV3作為研究對(duì)象，分析其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

人卵巢液性乳頭狀囊腺癌細(xì)胞株SKOV3，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，10%胎牛血清培養(yǎng)。拉帕替尼，大連美侖生物技術(shù)公司提供。胰蛋白酶、二甲基亞砜、胎牛血清等。倒置相差顯微鏡，熒光顯微鏡，超凈工作臺(tái)，Epics流式細(xì)胞儀，低溫冰箱等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取液氮凍存細(xì)胞，37℃溫水中解凍，超凈工作臺(tái)上操作，將細(xì)胞移入離心管，加入10倍RPMI-1640培養(yǎng)液，離心，800rpm/min,離心5～10min，棄上清，細(xì)胞沉淀加PRMI-1640培養(yǎng)液，搖勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待目標(biāo)細(xì)胞生長(zhǎng)到80%～90%培養(yǎng)瓶，棄培養(yǎng)液，采用PBS緩沖液漂洗兩遍，倒置顯微鏡鑒定合格，加入培養(yǎng)液胰酶消化液，將已經(jīng)消化過(guò)的細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶，800rpm/min,5min,棄上清，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，進(jìn)行1:3比例傳代培養(yǎng)，分裝至培養(yǎng)瓶。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期細(xì)胞0.25%胰蛋白酶消化離心，PSB漂洗2次，1000rpm離心，5min，棄上清，加入-20℃DMSO細(xì)胞凍存液，移入凍存管，4℃靜置30min，-20℃保存2h，轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱，長(zhǎng)期保存著24h后轉(zhuǎn)移到-80℃液氮中。

1.2.2 分組

低中高實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、模型組。將培養(yǎng)得到的細(xì)胞株，1000rpm離心5min，PBS漂洗1次，棄上清，調(diào)整密度為8×104/ml。取接3個(gè)96孔板，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)1板，100μl/孔，每個(gè)孔104，做好分組標(biāo)記。低中高實(shí)驗(yàn)組加入濃度分別為20、30、60μmol/L拉帕替尼，對(duì)照組只含有等量的溶劑，模型組不做任何處理。37℃，5%CO2,條件下培養(yǎng)24h，時(shí)間到后，去上清液，每孔加入5g/L的MTT共10μl，常規(guī)處理，在微板測(cè)試系統(tǒng)上，在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度OD值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。培養(yǎng)48h后，采用PI染色法流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以WPS xls數(shù)據(jù)表錄入數(shù)據(jù)，采用SPSS18.0軟件進(jìn)行數(shù)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述統(tǒng)計(jì)，采用柯?tīng)柲缌_夫-斯米爾諾夫（Kolmogorov-Sminmov）檢驗(yàn)法進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，若不服從正態(tài)分布采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以數(shù)（n）或率（%）描述統(tǒng)計(jì)，組間比較采用X2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組各劑量亞組、對(duì)照組、模型組OD與抑制率組間比較存在顯著差異（P<0.05），低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組指標(biāo)呈現(xiàn)階梯變化。見(jiàn)表1。

實(shí)驗(yàn)組各劑量亞組、對(duì)照組、模型組G0/G1、S、G2/M水平組間比較存在顯著差異（P<0.05），低、中、高劑量S、G2/ M實(shí)驗(yàn)組指標(biāo)呈現(xiàn)階梯變化。見(jiàn)表1。

3 討論

本次研究證實(shí)，拉帕替尼對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的細(xì)胞周期、活性具有顯著影響。實(shí)驗(yàn)組各劑量亞組、對(duì)照組、模型組OD與抑制率組間比較存在顯著差異（P<0.05），低、中、高劑量實(shí)驗(yàn)組指標(biāo)呈現(xiàn)階梯變化，提示各拉帕替尼在體外可明顯抑制人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的活性，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴(lài)。同理，拉帕替尼在體外可明顯抑制人卵巢癌細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)，降低S期比重，將細(xì)胞阻滯在G0/G1周期，眾所周知，卵巢癌細(xì)胞周期直接影響患者的預(yù)后[3]。目前關(guān)于拉帕替尼的體外癌細(xì)胞作用研究并不少見(jiàn)，但主要集中在乳腺癌上，理論上其不僅僅可對(duì)卵巢癌細(xì)胞產(chǎn)生顯著的抑制作用，在肝癌等其他惡性腫瘤細(xì)胞中也會(huì)發(fā)揮重要[4]。

拉帕替尼的研發(fā)企業(yè)經(jīng)大量的研究證實(shí)，該藥可逆性結(jié)合EGFR、HER2受體，這些受體位于細(xì)胞區(qū)域ATP結(jié)合位點(diǎn)，這一結(jié)構(gòu)與絲裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3激酶等信號(hào)通路關(guān)系密切，最終影響細(xì)胞的分裂、增殖、分化、遷移。眾所周知，惡性腫瘤最大的特征在于惡性的分裂、增殖、分化、遷移，這也是惡性腫瘤難治的根本原因，拉帕替尼通過(guò)這一靶點(diǎn)[5]，通過(guò)影響MAPK、PICK等信號(hào)通路，從而抑制腫瘤活動(dòng)。近年來(lái)個(gè)體化治療越來(lái)越受到重視，極大的提高了惡性腫瘤的治療水平，鑒于拉帕替尼的作用機(jī)制，其對(duì)HER2過(guò)度表達(dá)的轉(zhuǎn)移晚期乳腺癌療效肯定，目前關(guān)于拉帕替尼治療卵巢癌的臨床研究并不多見(jiàn)，卵巢癌拉帕替尼靶點(diǎn)HER2過(guò)度表達(dá)率約為25%～32%，處于較高水平，理論上采用拉帕替尼具有一定的療效[6]。Kimball等對(duì)卵巢癌的Ⅰ期間臨床研究證實(shí)，拉帕替尼聯(lián)合卡鉑治療復(fù)發(fā)性卵巢癌的敏感性療效較好[7]。目前，拉帕替尼主要通過(guò)與卡培他濱聯(lián)合治好了，曾經(jīng)接受蒽環(huán)類(lèi)、紫杉類(lèi)藥物化療，以及曲妥珠單抗治療失敗，HER2過(guò)度表達(dá)晚期以及轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療，其對(duì)卵巢癌療效研究有待深入。卵巢癌死亡率相對(duì)更高，患者晚期生存時(shí)間短，一定程度上限制了拉帕替尼的應(yīng)用。此外，不同于乳腺癌，HER2在卵巢癌中的表達(dá)雖然較高，但是在良性卵巢中的表達(dá)也較高，其在卵巢癌發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移中的作用可能并不突出，目前關(guān)于卵巢癌靶點(diǎn)研究集中在熱休克蛋白、錳超氧化物歧化酶等因子上[8]。

表1：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組于模型組培養(yǎng)24h后OD、抑制率對(duì)比

表2：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組于模型組培養(yǎng)48h后細(xì)胞周期分布

需注意的是，人體正常細(xì)胞也有大量的HER2表達(dá)，拉帕替尼與其他生長(zhǎng)因子受體靶點(diǎn)藥物一樣，也存在不良反應(yīng)，已知的不良反應(yīng)主要包括腹瀉、惡心、嘔吐、手足綜合征、左室射血分?jǐn)?shù)下降、間質(zhì)性肺炎等[9]。近年來(lái)，拉帕替尼在乳腺癌廣泛應(yīng)用也出現(xiàn)了耐藥問(wèn)題，為防范于未然，也有必要深入研究其在卵巢癌中的作用機(jī)制，提高合理應(yīng)用水平，避免過(guò)早出現(xiàn)耐藥[10]。

綜上所述：拉帕替尼對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)，但缺乏臨床研究證實(shí)，其體內(nèi)作用機(jī)制有待深入研究。

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