1株油茶病害拮抗真菌的鑒定、生物學(xué)特性及拮抗作用研究

魏 蜜，路 露，李春琪，傅本重，李國(guó)元，王立華(湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院/特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 孝感 432000)

1株油茶病害拮抗真菌的鑒定、生物學(xué)特性及拮抗作用研究

魏 蜜，路 露，李春琪，傅本重，李國(guó)元，王立華*
(湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院/特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 孝感 432000)

為了給油茶病害的生物防治提供科學(xué)依據(jù)，從油茶根部土壤分離獲得1株能拮抗油茶主要病害的真菌F217-3。依據(jù)該菌株的形態(tài)特征，并結(jié)合全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)及 rDNA-ITS序列分析，將其鑒定為草酸青霉(Peniciliumoxalicum)。對(duì)其生物學(xué)特性研究結(jié)果表明：該菌株在查氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最佳，碳源和氮源分別以蔗糖和尿素最適宜，生長(zhǎng)適溫為28 ℃，致死溫度為65 ℃，在pH值為3～10條件下均生長(zhǎng)良好，其中最適pH值是4～7，通氣與否對(duì)菌絲生長(zhǎng)無明顯影響，但光照24 h條件下菌絲生長(zhǎng)較差。平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)217-3對(duì)油茶炭疽病菌(C.nicotianae)、油茶軟腐病菌(A.camellia)、黑斑病菌(A.alternate)和潰瘍病菌(B.dothidea)的抑菌率均達(dá)到90%以上，可抑制油茶膠孢炭疽病菌、黑斑病菌分生孢子產(chǎn)生，抑制或致畸油茶炭疽病菌、潰瘍病菌和葉斑病菌菌絲，是一株具有廣譜拮抗作用的生防菌株。

草酸青霉； 鑒定； 生物學(xué)特性； 油茶病害； 拮抗作用

油茶(Camelliaoleifera)屬山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)，是我國(guó)南方特有的一種木本油料樹種[1]。油茶全身都是寶，種子是優(yōu)質(zhì)、高級(jí)食用油的原料；茶油在醫(yī)藥、工業(yè)上應(yīng)用廣泛；茶枯也是優(yōu)質(zhì)的有機(jī)肥料，提取后的固體殘?jiān)勺鳛樨i的精飼料。因此，油茶具有很好的應(yīng)用開發(fā)前景，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。

隨著我國(guó)南方各地油茶種植面積逐年增加，各類油茶病害也日趨嚴(yán)重。油茶炭疽病、葉枯病、軟腐病是由病原物引起的3種毀滅性病害，在我國(guó)各油茶產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生[2]。同樣，油茶其他病害如根腐病、茶餅病、黑斑病、潰瘍病等也時(shí)常發(fā)生，每年油茶產(chǎn)業(yè)因病害造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。尋求安全、高效和經(jīng)濟(jì)的生物源農(nóng)藥是防治油茶病害的當(dāng)務(wù)之急，其中拮抗微生物在植物病害生物防治中起到十分重要的作用。

在植物病害的生物防治中研究和應(yīng)用較多的微生物主要有細(xì)菌類、真菌類和放線菌。真菌類主要有哈茨木霉、康寧木霉、青霉、絲核菌、酵母菌等。Melgarejo等[3]報(bào)道了從桃枝條分離的產(chǎn)紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)對(duì)桃褐腐病原菌的防治效果；申光輝等[4]篩選到灰黃青霉(Penicilliumgriseofulvum)和土曲霉(Aspergillusterreus)2種拮抗真菌，其對(duì)草莓根腐病有較強(qiáng)的拮抗作用；王國(guó)平等[5]從南方紅豆杉分離到一種新內(nèi)生真菌紫杉木霉(Trichodermataxi)，該內(nèi)生真菌通過菌絲纏繞附著等重寄生方式，導(dǎo)致水稻紋枯病菌菌絲斷裂或其內(nèi)含物降解直至死亡；另外，也有采用生物農(nóng)藥草酸青霉水劑防治玉米小斑病的研究報(bào)道[6]。然而，關(guān)于利用青霉菌防治油茶主要病害的研究及應(yīng)用報(bào)道很少，且尚未見對(duì)油茶黑斑病和油茶潰瘍病2種病害進(jìn)行防治的報(bào)道。

本研究從植物根際土壤分離篩選獲得對(duì)油茶多種主要病害病原菌具有廣譜拮抗作用的生防青霉菌，對(duì)該生防菌株進(jìn)行生理生化鑒定、分子鑒定和生物學(xué)特性研究，并通過平板對(duì)峙試驗(yàn)研究該拮抗真菌對(duì)油茶炭疽病菌、油茶潰瘍病菌、油茶黑斑病菌等多種病原菌的拮抗作用，以期為油茶病害的無公害防治提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 油茶炭疽病菌(Colletotrichumnicotianae)、油茶膠胞炭疽病菌(C.gloeosporioides)、油茶葉斑病菌(Phyllostictacapitalensis)、油茶軟腐病菌(Agaricodochiumcamellia)、油茶黑斑病菌(Altermariaalternate)、油茶潰瘍病菌(Bothyosphaeriadothidea)分離自湖北孝感大悟油茶林地，所有菌株均保藏于湖北工程學(xué)院特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑、儀器和分析軟件 試劑：蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、瓊脂、DNA 凝膠回收試劑盒、PCR反應(yīng)用的各種試劑均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。氣相色譜系統(tǒng)：美國(guó)Agilent 6890N 型，包括全自動(dòng)進(jìn)樣裝置、石英毛細(xì)管柱及氫火焰離子化檢測(cè)器；分析軟件：美國(guó)MIDI 公司開發(fā)的基于微生物細(xì)胞脂肪酸成分鑒定的全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)Sherlock MIS 4.5和LGS 4.5軟件。

1.1.3 培養(yǎng)基 菌株分離和篩選培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基：稱取馬鈴薯 200 g，去皮，切成小塊煮沸30 min，2層紗布過濾后加入葡萄糖20 g，融化后補(bǔ)足水至1 000 mL，加入瓊脂 15～20 g，自然pH值，121 ℃高壓滅菌20 min。生物學(xué)特性研究供試培養(yǎng)基5種[7]：Ⅰ.馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL；Ⅱ.燕麥培養(yǎng)基(OA)：燕麥片30 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL； Ⅲ.清水洋菜培養(yǎng)基(WA)：瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL； Ⅳ.玉米粉培養(yǎng)基(CMM)：玉米粉40 g、蔗糖10 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL；Ⅴ.查氏培養(yǎng)基(CA)：蔗糖30 g、硝酸鈉3 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鐵0.01 g、硫酸鎂0.5 g、磷酸二氫鉀1 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2 拮抗菌的分離及篩選

于2014年10月從湖北省孝感市油茶苗木基地(油茶品種為長(zhǎng)林2號(hào))采集病株和健康株根際土壤。采用稀釋分離法[8]從油茶根部土壤分離拮抗真菌，用三步劃線法進(jìn)行分離純化，分離到20株菌株統(tǒng)一編號(hào)登記如下：F217-1、F217-2、F217-3、…、F217-20。菌種保藏：接種斜面后，可在4 ℃短暫保藏；用體積分?jǐn)?shù)為50%的甘油作為保護(hù)劑，可在-80 ℃長(zhǎng)久保藏。

初篩：采用平板對(duì)峙法[9]篩選其中能拮抗油茶病原菌的真菌，將直徑為7 mm的油茶炭疽病菌菌餅和拮抗菌菌餅放置平板中心線上，分別距離平板中心1.5 cm，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3～5 d后觀察抑菌帶有無及大小，每個(gè)處理重復(fù)3次。復(fù)篩：將初篩有拮抗作用的菌株經(jīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，10 000 r/min 室溫離心20 min，用0.22 μm的微孔濾膜過濾除去菌體，取拮抗菌濾液與滅菌后約50 ℃的PDA固體培養(yǎng)基按照1∶19的比例混勻后倒入培養(yǎng)皿，冷卻后在平板中央放入直徑為7 mm的油茶病原菌菌餅，以無菌水處理為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，5 d后測(cè)量病原菌菌落直徑。

1.3 拮抗菌的鑒定

1.3.1 拮抗菌的形態(tài)特征和生物學(xué)特性研究 將純化后的菌種轉(zhuǎn)接到PDA平板上，置于28 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，對(duì)菌落形態(tài)、顏色、基質(zhì)顏色等形態(tài)特征進(jìn)行鑒定，并依據(jù)傅本重等[10]的方法對(duì)拮抗菌進(jìn)行生物學(xué)特性研究。

1.3.1.1 培養(yǎng)基 沿 PSA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 的拮抗菌菌落邊緣打取菌齡一致的菌餅(直徑7 mm)，分別接種在供試5種培養(yǎng)基平板中央，置于28 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)6 d后用目測(cè)法測(cè)量菌落面積占整個(gè)平皿面積的百分?jǐn)?shù)，每個(gè)處理 5皿，試驗(yàn)重復(fù)2次(下同)。

1.3.1.2 碳源 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，以不加碳源為對(duì)照，用含有等量碳的多種碳源(葡萄糖、麥芽糖、淀粉)代替查氏培養(yǎng)基中的蔗糖，配制成不同碳源的固體培養(yǎng)基，對(duì)拮抗菌進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.1.3 氮源 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ),以不加氮源為對(duì)照，用含有等量氮的多種氮源(硝酸銨、尿素)代替查氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉，配制成不同氮源的固體培養(yǎng)基，對(duì)拮抗菌進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.1.4 溫度 設(shè)置5、13、21、28、37 ℃共5 個(gè)溫度，在PSA 培養(yǎng)基上分別培養(yǎng)。

1.3.1.5 致死溫度 移取直徑7 mm 的菌絲塊至無菌EP管中，加入1.5 mL無菌水后分別置于40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃的水浴鍋中水浴10 min，取出后立即在冰水中冷卻至室溫。將處理后的菌絲塊接種到 PSA 平板中央，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.1.6 pH值 將PSA培養(yǎng)基的pH值分別設(shè)為3、4、5、6、7、8、9、10共8個(gè)梯度。將菌齡相同的菌餅接種到 PSA 平板中央，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.1.7 光照和通氣 分別設(shè)置4種不同光照條件(光/暗，h)： 0/24、8/16、16 /8、24/0 。不通氣條件下用Parafilm封口，通氣條件下培養(yǎng)皿不封口。將菌齡相同的菌餅接種到 PSA 平板中央，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.2 拮抗菌的rDNA-ITS分析 拮抗菌的DNA提取參考何月秋[11]的方法。采用上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)的PCR擴(kuò)增試劑盒(No: B639297)進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物使用真菌的通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-3′)，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)總體系為50 μL，反應(yīng)液為：DNA 1 μL、ITS4和ITS5各2 μL、Mix 25 μL、雙蒸水20 μL。 PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共設(shè)35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)顯示記錄電泳結(jié)果。PCR產(chǎn)物委托天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.3.3 運(yùn)用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定 脂肪酸的提取和氣相色譜檢測(cè)參考Fernandes等[12]和藍(lán)江林等[13]的方法。抽提后的脂肪酸樣品通過Agilent 氣相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)。在下述色譜條件下平行分析脂肪酸甲酯混合物標(biāo)樣和待檢樣本：二階程序升高柱溫，170 ℃起始，5 ℃/min 升至260 ℃，而后40 ℃/min 升溫至310 ℃，維持90 s；汽化室溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度300 ℃；載氣為氫氣(2 mL/min)，尾吹氣為氮?dú)?30 mL/min)；柱前壓10.00 psi(1 psi=6.895 kPa)；進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣分流比100∶1。

1.4 拮抗菌的拮抗效果測(cè)定

采用平板對(duì)峙法分析拮抗菌對(duì)油茶主要真菌病害的拮抗作用[9]，同1.2中步驟，以PDA培養(yǎng)基塊代替拮抗菌菌餅為對(duì)照。抑菌率=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑) /(對(duì)照菌落直徑-7)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌篩選結(jié)果

以實(shí)驗(yàn)室保藏的油茶炭疽病菌為指示菌，分離得到的菌株為待檢菌，采用平板對(duì)峙法篩選其中能拮抗油茶病原菌的真菌，初篩共獲得3株有拮抗效果的菌株：F217-1、F217-3、F217-15。同時(shí)采用液體培養(yǎng)法復(fù)篩，最后獲得1株拮抗效果明顯且穩(wěn)定的拮抗菌F217-3。

2.2 拮抗菌鑒定結(jié)果

F217-3在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形，邊緣白色，孢子形成后菌落呈黃綠至深綠色；其顯微形態(tài)顯示，分生孢子梗直立、無色、有分隔，分生孢子球形至橢圓形、無色至著色、光滑，大小為(4～6) μm×(2～4 ) μm；常為鏈狀生長(zhǎng)(圖1)。

圖1 菌株F217-3菌落形態(tài)(A)和顯微形態(tài)(B)

對(duì)菌株F217-3進(jìn)行脂肪酸成分分析，并與全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)LGS 4.5軟件的FUNGI 3.80庫(kù)中數(shù)據(jù)比對(duì)，與之相似性指數(shù)最高的是Penicillium-species-GC subgroup A 和Penicillium-came-mbertii，相似性指數(shù)分別為0.710和0.697，該結(jié)果表明菌株F217-3可能為青霉屬。

對(duì)菌株F217-3進(jìn)行分子鑒定，將測(cè)得的rDNA-ITS序列(長(zhǎng)度為680 bp)與GenBank中已知序列進(jìn)行比對(duì)，選取9株菌株用ClustalX 2.1 進(jìn)行多序列比對(duì)分析，利用MEGA 6.0 軟件采用鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和聚類分析。如圖2所示，菌株F217-3與GenBank中登錄號(hào)為KP780809.1和EF103451.1菌株的同源性達(dá)到100%，聚在同一分支。結(jié)合上述形態(tài)和部分生理生化特征，可初步判定拮抗菌F217-3屬于草酸青霉，并將其命名為PeniciliumoxalicumF217-3。

圖2 菌株F217-3 rDNA-ITS序列聚類分析

2.3 拮抗菌的生物學(xué)特性

2.3.1 最佳培養(yǎng)基 草酸青霉菌在不同培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)情況如表1所示，結(jié)果表明，該青霉菌在CA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，菌落最大，其次是PSA培養(yǎng)基，其在WA培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。

2.3.2 最佳碳源 草酸青霉菌在不同碳源培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)情況如表2所示，結(jié)果表明，該菌株在無碳源的培養(yǎng)基上菌落稍小，菌絲稀疏，菌落顏色不深，在以蔗糖、麥芽糖、葡萄糖和淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況都很好，其菌落生長(zhǎng)速率及菌絲密集程度無明顯差異。

2.3.3 最佳氮源 草酸青霉菌在不同氮源培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)情況如表3所示， 其在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上菌落最大，生長(zhǎng)速率最高；在無機(jī)氮源硝酸鈉和硝酸銨培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)較差，而在無氮源的情況下生長(zhǎng)最差。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)青霉菌生長(zhǎng)的影響 %

注：菌落面積百分比=該菌落在平板上的總面積/平板面積×100%，生長(zhǎng)速率=菌落面積百分比/培養(yǎng)時(shí)間；同行不同字母表示差異顯著。下同。

表2 不同碳源對(duì)青霉菌生長(zhǎng)的影響 %

表3 不同氮源對(duì)青霉菌生長(zhǎng)的影響 %

2.3.4 最佳溫度 如表4所示，草酸青霉菌在28 ℃培養(yǎng)條件下菌落生長(zhǎng)速率最高，生長(zhǎng)狀況最佳，在37 ℃和21 ℃條件下生長(zhǎng)次之，其也可在13 ℃的低溫狀態(tài)下緩慢生長(zhǎng)，但是在5 ℃條件下已經(jīng)不能生長(zhǎng)。

表4 溫度對(duì)青霉菌生長(zhǎng)的影響 %

2.3.5 最佳pH值 如表5所示，草酸青霉菌耐受pH值范圍廣，在pH值3～10條件下均生長(zhǎng)良好，其最適pH值范圍是4～7，在pH值為3和8時(shí)生長(zhǎng)次之，在pH值為9和10條件下生長(zhǎng)相對(duì)較差，且菌落稀疏，顏色較淡。

表5 pH值對(duì)青霉菌生長(zhǎng)的影響 %

2.3.6 致死溫度 結(jié)果表明，草酸青霉菌在40～60 ℃的溫度范圍內(nèi)水浴后均生長(zhǎng)良好，但在65 ℃水浴處理后不生長(zhǎng)，表明該青霉菌致死溫度為65 ℃，相對(duì)一般真菌致死溫度為40～55 ℃，其有耐高溫的優(yōu)勢(shì)[14-15]。

2.3.7 光照和通氣 結(jié)果表明，通氣與否對(duì)草酸青霉菌菌絲生長(zhǎng)無明顯影響。在光照為0、8、16 h條件下青霉菌菌絲生長(zhǎng)較好，但光照24 h條件下菌絲生長(zhǎng)較差，說明24 h晝夜全部光照條件不利于菌絲生長(zhǎng)。

2.4 拮抗菌與多種油茶病原菌的體外互作

2.4.1 F217-3對(duì)油茶病原菌菌落生長(zhǎng)的影響 圖3顯示，在對(duì)峙過程中PeniciliumoxalicumF217-3生長(zhǎng)旺盛，幾乎完全抑制了油茶炭疽病菌的生長(zhǎng)。通過測(cè)量對(duì)照及對(duì)峙過程中病原菌菌落的直徑(表6)發(fā)現(xiàn)，PeniciliumoxalicumF217-3對(duì)油茶炭疽病菌、軟腐病菌、黑斑病菌和潰瘍病菌的抑菌率均達(dá)到90%以上，尤其是對(duì)油茶炭疽病菌、潰瘍病菌和黑斑病菌拮抗效果顯著。

A為對(duì)峙狀態(tài)下F217-3與炭疽病菌的生長(zhǎng)狀況； B為對(duì)照?qǐng)D3 菌株F217-3對(duì)油茶炭疽病菌的拮抗作用

2.4.2 F217-3對(duì)油茶病原菌形態(tài)的影響 在平板對(duì)峙試驗(yàn)中，分別挑取PDA平板上未接F217-3菌餅的病原菌和已接F217-3菌餅的病原菌相同位置的菌絲置于顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖4和圖5所示。拮抗菌F217-3能抑制炭疽病菌、潰瘍病菌和葉斑病菌菌絲的生長(zhǎng)，正常生長(zhǎng)的病原菌菌絲豐富、光滑(圖4A、4C、4E)，F(xiàn)217-3的孢子可分別包圍和散落在炭疽病菌、潰瘍病菌和葉斑病菌菌絲周圍，拮抗后的菌絲變細(xì)、畸形、斷裂，菌絲數(shù)量明顯減少(圖4B、4D、4F)。拮抗菌F217-3可充分抑制膠孢炭疽病菌和黑斑病菌孢子的產(chǎn)生，病原菌正常生長(zhǎng)狀態(tài)下有大量孢子散落在菌絲周圍(圖5A和5C)，經(jīng)過F217拮抗作用后，膠孢炭疽病菌和黑斑病菌的孢子產(chǎn)生量極少甚至被完全抑制(圖5B和5D)。雖然拮抗菌F217-3可以抑制油茶軟腐病菌菌落生長(zhǎng)，但在顯微鏡下并沒有觀察到該菌對(duì)軟腐病菌菌絲和孢子產(chǎn)生明顯的致畸和抑制作用。

表6 菌株F217-3對(duì)油茶主要病原菌的抑制效果

3 結(jié)論與討論

目前對(duì)油茶主要病害普遍通過種植抗性品種和化學(xué)防治來控制，但有害生物抗性問題日益嚴(yán)重，化學(xué)農(nóng)藥殘留也造成多種危害，污染環(huán)境，對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境存在較大威脅，不利于油茶產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[2]。本試驗(yàn)從油茶植株根際土壤篩選對(duì)油茶主要病害病原菌有拮抗作用的生防菌株，最終獲得1株能同時(shí)高效拮抗油茶多種病原菌的草酸青霉F217-3，草酸青霉作為拮抗菌株防治油茶病害在國(guó)內(nèi)外的生物藥劑中鮮有報(bào)道，這對(duì)油茶病害的生物防治具有重要意義。

A、C和E為正常生長(zhǎng)狀態(tài)下炭疽病菌、葉斑病菌和潰瘍病菌的菌絲形態(tài)，B、D和F為受到F217-3拮抗過程中炭疽病菌、葉斑病菌和潰瘍病菌的菌絲形態(tài)圖4 菌株F217-3對(duì)油茶炭疽病菌、葉斑病菌和潰瘍病菌形態(tài)的影響

A和C為正常生長(zhǎng)狀態(tài)下膠孢炭疽病菌和黑斑病菌的菌絲和孢子形態(tài)，B和D為受到F217-3拮抗過程中膠孢炭疽病菌和黑斑病菌的菌絲和孢子形態(tài)圖5 F217-3對(duì)膠孢炭疽病菌和黑斑病菌形態(tài)的影響

脂肪酸是生物體內(nèi)不可缺少的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是生物體的基本結(jié)構(gòu)成分之一，已被成功用于細(xì)菌屬、種和亞種的鑒定[16]，如葡萄球菌屬(Staphylococcus)含有19:0ISO、19:0ANTEISO 和C20:0 而區(qū)別于微球菌屬(Micrococcus)[17]。本試驗(yàn)通過采用MIDI全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)與數(shù)據(jù)庫(kù)中的菌體脂肪酸圖譜相比較發(fā)現(xiàn)，與F217-3相似性指數(shù)最高的均為青霉屬，但鑒定結(jié)果未能確定到種。因此，又通過rDNA-ITS序列分析對(duì)F217-3進(jìn)一步鑒定，結(jié)果表明，F(xiàn)217-3與P.oxalicumstrain BGPUP4和P.oxalicumstrain PO2 兩種菌株同源性極高，因此確定該拮抗菌株為草酸青霉。

草酸青霉屬半知菌亞門真菌，其中草酸青霉溶磷菌株有較強(qiáng)溶解多種無機(jī)磷的能力和促進(jìn)作物生長(zhǎng)的作用[18]。植物病害生物防治中，在平板培養(yǎng)基上對(duì)病原菌抑制作用最強(qiáng)的菌株在田間防治病害的能力并不一定最強(qiáng)，拮抗菌實(shí)際發(fā)揮的作用還與環(huán)境條件、土壤理化性狀、土壤營(yíng)養(yǎng)狀況、土著微生物菌群及其多樣性等因素密切相關(guān)[19]。有研究表明，利用草酸青霉水劑作為生物農(nóng)藥防治玉米小斑病取得了較好效果[6]，田間處理劑量為稀釋50 倍時(shí)，對(duì)玉米小斑病的防效在88%～90.6%，且對(duì)供試作物安全，這為草酸青霉應(yīng)用于油茶病害防治提供了借鑒。在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，草酸青霉無菌發(fā)酵液具有纖維素酶和果膠酶活性，說明該草酸青霉能分泌纖維素酶和果膠酶等降解酶系，這與彭霞薇等[20]研究結(jié)果一致，這些酶系可降解病原微生物的細(xì)胞壁，顯著抑制病原物的生長(zhǎng)繁殖，可能是該草酸青霉對(duì)油茶多種病害具有拮抗作用的原因之一。在后續(xù)工作中，該草酸青霉對(duì)油茶病害的拮抗作用機(jī)制、拮抗物質(zhì)基礎(chǔ)及如何有效地將該菌作為生防菌劑應(yīng)用到油茶產(chǎn)業(yè)中還需進(jìn)一步深入研究。

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Identification of Antagonistic Fungus toCamelliaDiseases and Study of Biological Characteristics and Antagonism Effect

WEI Mi,LU Lu,LI Chunqi,FU Benzhong,LI Guoyuan,WANG Lihua*
(College of Life Science and Technology,Hubei Engineering University/Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables,Xiaogan 432000,China)

In order to provide scientific basis for the biocontrol ofCamelliadiseases,a strain of fungus was isolated from soil ofCamelliaroot which could antagonize majorCamelliadiseases.Following morphological characteristics and quantificational analysis by gas chromatography using the Sherlock microbial identification system(MIDI),combining with the result of the rDNA-ITS sequence analysis,it was identified asP.oxalicumand namedP.oxalicumF217-3.The results indicated that F217-3 grew best in CA medium,sucrose and urea were the suitable carbon and nitrogen resource respectively.The strain grew best under 28 ℃，and the lethal temperature was 65 ℃.Although the mycelium could grow at pH 3 to 10，pH of 4 to 7 was optimal.Ventilation had no significant effect on the growth of penicillium mycelium,but 24 h light was not beneficial to the mycelial growth．Moreover,the inhibition rates of F217-3 against the mycelia growth of majorCamelliapathogens were higher than 90%.It was observed that F217-3 could inhibit the spore germination ofC.gloeosporioidesandA.alternate,and also inhibit and defect the hyphae ofC.nicotianae,B.dothideaandP.capitalensis.The results showed that F217-3 was a biocontrol strain with broad-spectrum antagonism.

Peniciliumoxalicum; identification; biological characteristics;Camelliadiseases; antagonism effect

2015-12-24

湖北省教育廳中青年人才資助項(xiàng)目(Q20152707)；湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(D20102704)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31200488)；特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目(2016K07)；湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013CFC004)

魏 蜜(1987-)，女，湖北孝感人，講師，博士，主要從事微生物學(xué)和植物病害防治研究。 E-mail：weimi555@163.com

*通訊作者：王立華(1963-)，男，湖北天門人，教授，博士，主要從事微生物學(xué)教學(xué)與研究。E-mail:lwang@hbeu.edu.cn

S435.659

A

1004-3268(2016)08-0074-07