鴨A-FABP基因多態(tài)性在品種和世代間的比較分析

董 飚,秦豪榮,王 健，孫國(guó)波，紀(jì)榮超(.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 5300； .國(guó)家級(jí)水禽基因庫(kù)，江蘇 泰州 5300)

鴨A-FABP基因多態(tài)性在品種和世代間的比較分析

董 飚1，2,秦豪榮1，2,王 健1，孫國(guó)波1，2，紀(jì)榮超2
(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300； 2.國(guó)家級(jí)水禽基因庫(kù)，江蘇 泰州 225300)

為了解脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty-acid binding protein,A-FABP)基因在不同鴨品種、世代間的突變情況，以山麻鴨、巢湖鴨、金定鴨(3個(gè)世代群體)等9個(gè)鴨品種為材料，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，用SSCP方法檢測(cè)A-FABP基因多態(tài)性，比較不同鴨品種之間、金定鴨3個(gè)世代群體之間基因型、等位基因頻率、群體遺傳參數(shù)。結(jié)果顯示，9個(gè)鴨品種中共形成A、B、C、D 4個(gè)等位基因，對(duì)不同基因型序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)含子1中有6個(gè)單核苷酸突變。在9個(gè)鴨品種中，B等位基因頻率均明顯高于A、C、D。大部分鴨品種之間基因型頻率存在顯著性差異，金定鴨3個(gè)世代群體之間基因型頻率無明顯差異。所有鴨品種的群體雜合度都在0.4以上，山麻鴨、攸縣麻鴨、廣西小麻鴨、金定鴨3個(gè)世代群體均為中度多態(tài)，其他鴨品種為高度多態(tài)。除山麻鴨和臨武鴨外，其他鴨品種均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)?？梢姡啿煌贩N中A-FABP基因具有豐富的單核苷酸多態(tài)性，采用小群保種方式，金定鴨A-FABP基因多態(tài)位點(diǎn)形成的基因型頻率在世代間無顯著性變化。

鴨；A-FABP基因； 單鏈構(gòu)象多態(tài)性； 單核苷酸多態(tài)性； 遺傳分析

畜禽品種資源調(diào)查報(bào)告顯示，我國(guó)目前擁有地方鴨品種資源32個(gè)[1]，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們消費(fèi)習(xí)慣的改變，一些特性不明顯的鴨品種飼養(yǎng)量急劇減少；同時(shí)受國(guó)外一些優(yōu)良品種的引入沖擊和雜交影響，地方鴨品種資源受到了嚴(yán)重的威脅。品種資源是育種的重要素材，保護(hù)好這些鴨品種具有重要的意義。國(guó)家和地方政府已經(jīng)探索采用基因庫(kù)、保種場(chǎng)和保護(hù)區(qū)的形式對(duì)鴨品種資源進(jìn)行保護(hù)，且每年均投入一定量的資金。但是，鴨品種的保護(hù)工作所需投入資金一直大于產(chǎn)出，這將會(huì)對(duì)保種工作帶來巨大壓力。只有加大對(duì)鴨品種資源的開發(fā)利用，才能增強(qiáng)鴨產(chǎn)業(yè)的競(jìng)爭(zhēng)力，將保護(hù)和開發(fā)兩者相結(jié)合，在開發(fā)過程中加強(qiáng)保護(hù)，才能使品種資源真正得到保護(hù)。我國(guó)鴨品種數(shù)量較多，這些鴨品種在體型外貌和生產(chǎn)性能方面存在明顯差異，如有些鴨品種生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)蛋多或脂肪沉積能力強(qiáng)，這些差異都是由遺傳基因控制的。

脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白(adipocyte fatty-acid binding protein,A-FABP)是脂肪酸結(jié)合蛋白中的一種，屬于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，可以與脂肪酸結(jié)合，將脂肪酸運(yùn)輸?shù)街舅嵫趸透视腿ゼ傲字暮铣晌恢茫{(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪合成[2]。研究報(bào)道顯示，A-FABP基因點(diǎn)突變可以顯著影響腹脂質(zhì)量、腹脂率、皮脂率和肌肉肌內(nèi)脂肪含量，影響肌肉的品質(zhì)[3-6]。A-FABP基因作為鴨品種資源脂肪沉積和肉品質(zhì)的影響因素之一，其序列在不同的鴨品種之間存在突變差異，這些突變形成的基因型在不同的鴨品種中所占的比例，以及在繼代繁育過程中每個(gè)品種的基因型頻率是否發(fā)生變化均不明確。鑒于此，以9個(gè)地方鴨品種為研究對(duì)象，采用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(single strand conformation polymorphism,SSCP)檢測(cè)鴨A-FABP基因多態(tài)性，統(tǒng)計(jì)基因型和等位基因頻率，分析品種之間的分布差異和群體遺傳參數(shù)，并比較金定鴨不同世代群體之間基因型、等位基因頻率和遺傳參數(shù)，以期為地方鴨品種保護(hù)和開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試?guó)喨杭盎蚪M提取

供試?guó)喥贩N包括山麻鴨、攸縣麻鴨、巢湖鴨、靖西大麻鴨、廣西小麻鴨、金定鴨、臨武鴨、荊江麻鴨、高郵鴨品種，其中金定鴨包含3 個(gè)世代群體，分別標(biāo)記為0世代、2世代、4世代。金定鴨采用4 個(gè)多父本家系等量留種，輪回交配的方法進(jìn)行繼代繁育，每個(gè)家系包括公鴨10只、母鴨60 只。在10周齡時(shí)，每個(gè)鴨品種隨機(jī)挑選60 只，公母各半，每只鴨翅靜脈采血2 mL，肝素鈉抗凝，離心留取紅細(xì)胞，冷凍保存。采用常規(guī)酚/氯仿法抽提和乙醇沉淀法獲取基因組DNA，測(cè)定DNA質(zhì)量濃度后將其調(diào)整為50～100 ng/μL備用。

1.2A-FABP基因引物設(shè)計(jì)

根據(jù)A-FABP基因序列在第1、2內(nèi)含子上分別設(shè)計(jì)1對(duì)引物(表1)，用于9個(gè)供試?guó)喥贩N和金定鴨不同世代群體多態(tài)性分析，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1 引物基本信息

1.3A-FABP基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)

PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)總體積為25 μL，包括10×PCR Buffer(含Mg2+) 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、5 U/μL rTaq酶0.16 μL、50～100 ng/μL DNA模板1 μL,用雙蒸水補(bǔ)至25 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。溫度降至室溫，即可從PCR儀中取出，采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析條帶清晰，與預(yù)期片段大小一致，方可用于SSCP檢測(cè)。

1.4A-FABP基因SSCP分析及測(cè)序

5 μL PCR 產(chǎn)物和4 μL加樣緩沖液(主要成分為去離子甲酰胺)混勻，98 ℃變性10 min，然后冰水浴5 min，變性后PCR產(chǎn)物用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳過夜，電壓根據(jù)條帶位置進(jìn)行調(diào)整，銀染顯色，判別基因型。

將每種純合子基因型的個(gè)體各挑選2～3個(gè)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將 PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，對(duì)不同基因型進(jìn)行測(cè)序，通過比對(duì)DNA序列研究不同基因型之間核苷酸變化情況。

1.5 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用公式計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、純合度、雜合度和多態(tài)信息含量等遺傳參數(shù)，并卡方檢驗(yàn)(χ2)各品種群體是否處于Hardy-Weinberg平衡以及基因型頻率在各品種、世代間差異程度。

2 結(jié)果與分析

2.1A-FABP基因PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果

通過預(yù)試驗(yàn)，最終獲得了2對(duì)引物用于擴(kuò)增A-FABP基因部分內(nèi)含子序列，采用SSCP方法分析了9 個(gè)地方鴨品種A-FABP基因的多態(tài)性，引物A1擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)了多態(tài)，引物A2擴(kuò)增產(chǎn)物沒有出現(xiàn)多態(tài)。引物A1擴(kuò)增結(jié)果顯示，不同鴨品種中有10 種基因型，4種純合型分別定義為AA、BB、CC和DD型，雜合型定義為AB、AC、AD、BC、BD和CD型(圖1)。

圖1 引物A1對(duì)不同品種鴨擴(kuò)增片段的SSCP分析

2.2A-FABP基因多態(tài)性片段的克隆和測(cè)序

取AA、BB、CC和DD基因型的PCR產(chǎn)物片段進(jìn)行克隆、測(cè)序。運(yùn)用生物學(xué)軟件DNAMAN分析測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)4種基因型間共有6個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了單核苷酸突變，其中DD型與GenBank (HQ640428.1) 中的序列一致，不同基因型之間的序列差異位點(diǎn)分別是內(nèi)含子1第923位點(diǎn)處的A→G、第943位點(diǎn)處的T→C、第945位點(diǎn)處的C→T、第952位點(diǎn)處的T→C、第1 000位點(diǎn)處的T→A和第1 037位點(diǎn)處的C→T突變(圖2)。

圖2 不同基因型間核苷酸序列比對(duì)

2.3A-FABP基因不同基因型(等位基因)頻率在各鴨群中的分布

由表2可知，不同鴨品種A-FABP基因多態(tài)性形成的優(yōu)勢(shì)基因型并不完全相同，在山麻鴨、攸縣麻鴨、廣西小麻鴨、高郵鴨、金定鴨3個(gè)世代群體中均以BB基因型頻率比其他基因型高，巢湖鴨以AB基因型頻率最高，靖西大麻鴨、臨武鴨以BD基因型頻率最高，荊江麻鴨以AB基因型頻率最高。9個(gè)鴨品種均以B等位基因頻率最高，超過了0.5，明顯高于A、C、D等位基因頻率。金定鴨不同基因型和等位基因頻率在世代之間發(fā)生了微小的變化，但是變化不大。

表2 不同鴨品種基因型頻率及等位基因頻率分布情況

由表3可知，山麻鴨和高郵鴨、攸縣麻鴨和荊江麻鴨、巢湖鴨和金定鴨、靖西大麻鴨和臨武鴨、廣西小麻鴨和高郵鴨之間基因型頻率存在顯著差異；靖西大麻鴨與山麻鴨、攸縣麻鴨、巢湖鴨、廣西小麻鴨、金定鴨、荊江麻鴨、高郵鴨之間基因型頻率存在極顯著差異，金定鴨與山麻鴨、臨武鴨、荊江麻鴨之間基因型頻率存在極顯著差異，臨武鴨與山麻鴨、攸縣麻鴨、巢湖鴨、廣西小麻鴨、荊江麻鴨、高郵鴨之間基因型頻率存在極顯著差異，荊江麻鴨與山麻鴨、廣西小麻鴨之間基因型頻率存在極顯著差異；其他品種兩兩之間基因型頻率無顯著性差異。由表4可知，金定鴨不同世代群體之間基因型頻率無顯著性差異。

表3 χ2檢驗(yàn)不同鴨品種A-FABP基因型頻率差異

表4χ2檢驗(yàn)金定鴨不同世代群體間A-FABP基因型頻率差異

群體2世代4世代0世代6．02(7)8．43(7)2世代2．16(6)

2.4 群體遺傳信息分析

從表5可以看出，山麻鴨、攸縣麻鴨、廣西小麻鴨、金定鴨3個(gè)世代群體的純合度均超過0.5；高郵鴨的純合度為0.422 9；巢湖鴨、靖西大麻鴨、臨武鴨、荊江麻鴨的純合度在0.4以下。山麻鴨、攸縣麻鴨、廣西小麻鴨、金定鴨3個(gè)世代群體的多態(tài)信息含量值介于0.25～0.50，為中度多態(tài)；其他鴨的多態(tài)信息含量值大于0.50，為高度多態(tài)。除山麻鴨和臨武鴨外，其他鴨品種均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。

表5 不同鴨品種A-FABP基因多態(tài)位點(diǎn)遺傳參數(shù)

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，具有編碼蛋白質(zhì)的序列只占了整個(gè)基因組序列的很少部分，而絕大部分序列都在轉(zhuǎn)錄拼接過程中被切除，切除部分序列的長(zhǎng)度與生物的復(fù)雜程度呈正比[7]。內(nèi)含子也在序列拼接過程中被切除，這是斷裂基因固有的一種轉(zhuǎn)錄模式。目前內(nèi)含子的作用尚未明確，但很多人認(rèn)為其在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上對(duì)基因的表達(dá)具有調(diào)控作用，還可以降低或減緩點(diǎn)突變對(duì)生物體的影響，提高生物的生存能力[8]。對(duì)于內(nèi)含子的潛在作用研究尚有很多工作需要開展。本試驗(yàn)根據(jù)鴨A-FABP基因序列設(shè)計(jì)了2對(duì)引物，分別位于內(nèi)含子1、2，采用SSCP方法檢測(cè)了9個(gè)地方鴨品種，其中金定鴨為小群保種方式繼代繁育的3個(gè)世代群體。發(fā)現(xiàn)了A→G、T→C、C→T、T→C、T→A和C→T 6個(gè)點(diǎn)突變，聚丙烯酰胺凝膠電泳中共出現(xiàn)了A、B、C、D 4種等位基因型。所有檢測(cè)品種均以B等位基因頻率最高(超過0.5)，其他3個(gè)等位基因頻率都比較低，這可能是鴨品種在進(jìn)化過程中A、C、D等位基因由B等位基因突變產(chǎn)生，也可能是進(jìn)化過程中B等位基因受到了自然和人為選擇而使得頻率上升。χ2檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，大部分品種之間基因型頻率差異達(dá)到了顯著性水平，這也說明了我國(guó)大部分地方鴨品種擁有獨(dú)特的A-FABP基因多態(tài)性產(chǎn)生的基因型頻率和等位基因頻率。

群體雜合度和多態(tài)信息含量用于衡量基因多態(tài)性是否豐富和群體遺傳變異程度的高低。本試驗(yàn)所有鴨品種的雜合度都在0.4以上。山麻鴨、攸縣麻鴨、廣西小麻鴨、金定鴨3個(gè)世代群體的多態(tài)信息含量值在0.25～0.50，為中度多態(tài)；其他鴨品種的多態(tài)信息含量值高于0.50，為高度多態(tài)。雜合度和多態(tài)信息含量分析結(jié)果表明，供試?guó)喥贩N在A-FABP基因位點(diǎn)具有較高的多態(tài)信息含量，每個(gè)鴨群體內(nèi)遺傳變異大，保持了良好的遺傳信息，群體作為育種素材可用范圍較為廣泛，可供選擇利用的范圍大，尤其是基因型頻率差異不同的代表性品種更具有保種的價(jià)值。本試驗(yàn)通過χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，山麻鴨和臨武鴨偏離了Hardy-Weinberg平衡，山麻鴨可能是在保種過程群體數(shù)量較小引起了基因漂變，需要通過適當(dāng)提高群體規(guī)模以產(chǎn)生較好的保種效果；臨武鴨可能是保種群體組建時(shí)間較短，由于引種的原因引起了不平衡。

目前，鴨品種資源的保護(hù)方式主要為活體保存，其他方式如DNA保存、體細(xì)胞保存都處于起始階段，其效果尚不明確。品種資源活體保護(hù)方式是采用適當(dāng)?shù)娜后w規(guī)模進(jìn)行繼代繁殖，通過不同的配種方法盡量縮小近交系數(shù)，其保種效果一直備受關(guān)注。目前保種效果主要是通過比較不同世代間體型外貌、生產(chǎn)性能，結(jié)合微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)等方法進(jìn)行評(píng)估[9-10]。鑒于保種最終目的是保護(hù)好功能基因在品種間特有的基因型及其頻率，而A-FABP基因在禽類脂肪沉積和肉質(zhì)方面起著重要的作用[11-12]，本試驗(yàn)以A-FABP基因內(nèi)含子中存在的多態(tài)性為基礎(chǔ)，對(duì)小群保種方式下金定鴨不同世代間的基因型頻率和群體遺傳參數(shù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同世代群體基因型頻率發(fā)生了微小的變化，大致保持在一定的平衡狀態(tài)，χ2檢驗(yàn)不同世代間基因型頻率無顯著性差異。不同鴨品種有其相對(duì)固定的A-FABP多態(tài)性形成的基因型頻率，這些頻率決定了鴨品種脂肪沉積固有的特性，所以在品種保護(hù)工作中不僅需要從外貌和生產(chǎn)性能上保護(hù)好品種的特性，還需要從遺傳本質(zhì)上保護(hù)好品種，尤其是一些功能基因。在保種工作中可以嘗試檢測(cè)大量功能基因的突變位點(diǎn)，通過比較突變位點(diǎn)的頻率在品種世代繁育中的變化程度來衡量保種效果，其首要工作就是尋找出大量代表性功能基因的突變位點(diǎn)，采取有效、簡(jiǎn)單的大規(guī)模檢測(cè)方法。

綜上，在鴨A-FABP基因內(nèi)含子1中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)單核苷酸突變，形成了10種基因型，不同鴨品種具有豐富的多態(tài)性，大部分品種之間基因型頻率存在顯著性差異，部分達(dá)到了極顯著性差異。采用小群保種方式，金定鴨A-FABP基因多態(tài)位點(diǎn)形成的基因型頻率在世代間無顯著性變化，具有良好的保種效果。

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Comparative Study of Polymorphism in Breeds and Generations Based on DuckA-FABPGene

DONG Biao1,2,QIN Haorong1,2,WANG Jian1,SUN Guobo1,2,JI Rongchao2
(1.Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College，Taizhou 225300,China；2.National Gene Bank of Waterfowl Resources,Taizhou 225300,China)

The purpose was to understand the information about mutations ofA-FABPgene among different breeds and generation.Nine duck breeds(Shan Partridge duck,Chaohu duck,three generational populations of Jinding duck,and so on)were used,two pairs of primers were designed to detect polymorphism ofA-FABPgene by the technique of SSCP.The genotype frequency,allele frequency,population genetic parameter were compared among different duck breeds and three generational populations of Jinding duck.Allele A,B,C and D were found in nine duck breeds.Six mutations were found in the first intron through comparison of the sequence among different genotypes.The frequency of allele B was significantly higher than allele A,C and D among nine duck breeds.The genotype frequency was significantly different among many duck breeds,but the genotype frequency was not significantly different among Jinding duck’s three generational populations.The heterozygosity was higher than 0.4 in all duck breeds.The data ofPICindicated that Shan Partridge duck,Youxian duck,Guangxi Small Partridge duck and Jinding duck three generational populations belonged to the middle level of polymorphism,and other duck breeds belonged to the high level of polymorphism.Except for Shanma duck and Linwu duck,other duck breeds accorded with Hardy-Weinberg’s equilibrium law.Different duck breeds had affluent mononucleotide polymorphism inA-FABPgene,and the genotype frequency was significantly different in many breeds.The genotype frequency ofA-FABPgene was not significantly different in the generations of Jinding duck,which was conservancy by small population.

duck；A-FABPgene; SSCP; SNP; genetic analyses

2016-02-09

江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項(xiàng)目(SXGC[2015]304)；江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目[CX(14)2072]

董 飚(1982-)，男，江蘇鹽城人，講師，碩士，主要從事水禽種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用研究。 E-mail:dongbiao8201@126.com

S834

A

1004-3268(2016)08-0131-05