水溶性酵母葡聚糖對豬細小病毒滅活疫苗免疫效果的影響

靳曉慧，王瑞寧，徐衛(wèi)松，耿靜微，何瀟湘，鄭蘭蘭，張 建，魏戰(zhàn)勇*(.河南農業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 45000； .河南省動物性食品安全重點實驗室，河南 鄭州 455000； .河南省信陽市平橋區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 信陽 46400)

水溶性酵母葡聚糖對豬細小病毒滅活疫苗免疫效果的影響

靳曉慧1，2，王瑞寧1，徐衛(wèi)松1，耿靜微1，何瀟湘1，鄭蘭蘭2，張 建3，魏戰(zhàn)勇1，2*
(1.河南農業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002； 2.河南省動物性食品安全重點實驗室，河南 鄭州 455000； 3.河南省信陽市平橋區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南 信陽 464100)

為研究水溶性酵母葡聚糖作為免疫佐劑對豬細小病毒(PPV)滅活疫苗免疫效果的影響，將水溶性酵母葡聚糖與PPV滅活疫苗聯(lián)合免疫小鼠，采用ELISA方法檢測免疫后不同時間小鼠血清中的抗體水平及IL-4、IL-6、IFN-γ的分泌水平，應用流式細胞儀檢測免疫小鼠CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞百分比值的動態(tài)變化。結果顯示，與疫苗單獨免疫組相比，酵母葡聚糖對抗體水平無明顯影響，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+細胞數(shù)量增加，且均能不同程度誘導IL-4、IL-6、IFN-γ分泌。表明，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗能夠有效增強機體的免疫功能，水溶性酵母葡聚糖可以作為PPV的免疫佐劑。

豬細小病毒； 滅活疫苗； 水溶性酵母葡聚糖； T淋巴細胞亞群； 細胞免疫； 體液免疫

豬細小病毒病是由豬細小病毒(porcine parvovirus, PPV)感染引起的一種豬的繁殖障礙病，主要引起初產母豬不孕、流產、死產、產木乃伊胎及弱胎等[1-2]。近年來， PPV病的廣泛流行給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[3]。對該病目前尚無有效的治療方法，臨床上主要使用PPV疫苗進行免疫預防。PPV弱毒苗免疫效果較好，但其本身存在散毒的危險。PPV滅活疫苗作為預防PPV的常用疫苗,安全性較高，但由于其主要引起體液免疫應答，引起的細胞免疫應答水平較低甚至沒有，從而導致免疫保護率不高，且其易導致機體長期處于持續(xù)性感染狀態(tài)。因此，如何提高疫苗刺激的保護性抗體水平和細胞免疫應答效應是防制PPV感染的關鍵。

佐劑的選擇對滅活疫苗免疫效果起著至關重要的作用[4-7]。酵母葡聚糖是存在于酵母細胞壁中的一種多糖，對細菌有很明顯的抑制作用，同時具有抗癌、抗病毒的功能，可以增強哺乳動物的免疫力，具有降低血脂、促進傷口愈合等功能，是一種良好的生物效應調節(jié)劑。酵母葡聚糖被廣泛應用到動物飼料、食品添加劑等各個領域[8-10]。目前，酵母葡聚糖作為免疫增強劑在水產養(yǎng)殖中使用最廣泛[11]，然而，在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，有關葡聚糖的應用報道較少。李軍等[12]在斷奶仔豬日糧中添加適量的啤酒酵母葡聚糖發(fā)現(xiàn)，啤酒酵母葡聚糖可以提高斷奶仔豬的生產性能以及細胞免疫功能。但有關酵母葡聚糖作為免疫佐劑在畜禽疾病防制方面的研究尚未見報道。為此，本研究采用水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV油乳劑滅活疫苗免疫小鼠，分析水溶性酵母葡聚糖對PPV滅活疫苗免疫效果的影響，以期為豬PPV滅活疫苗新型佐劑的開發(fā)奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 疫苗

豬PPV油乳劑滅活疫苗購于中牧實業(yè)股份有限公司(批號1009006-2)；自制豬PPV油乳劑滅活疫苗。

1.2 供試動物

60只體質量20 g左右的Balb/C小鼠，購自鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心。

1.3 主要試劑

豬細小病毒抗體檢測ELISA試劑盒購自BioXL公司；酵母細胞壁粗提物，購于安琪酵母股份有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG，購于北京鼎國生物技術發(fā)展公司；小鼠IL-4 、IL-6及IFN-γ ELISA檢測試劑盒，購自武漢華美生物工程有限公司；大鼠抗小鼠CD3+、CD4+和CD8+分子單克隆抗體以及FITC、PE標記的兔抗大鼠IgG，購自北京邦定泰克生物技術有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.4 水溶性酵母葡聚糖的制備

取干燥的酵母細胞壁粗提物20 g，懸浮于120 mL 6% NaOH溶液中, 60 ℃條件下劇烈攪拌4 h,冷卻至室溫后3 000 r/min離心15 min，棄上清液后，用80 mL 3%NaOH溶液重新懸浮,加熱至90 ℃并不斷攪拌2 h，3 000 r/min離心15 min, 棄上清液，加入50 mL 4%HCl充分攪拌,室溫下靜置2 h。3 000 r/min離心15 min,棄上清液,用蒸餾水充分洗滌3次,再用50 mL 95%乙醇于75 ℃攪拌3 h,脫水2次，37 ℃干燥12 h,得到淡黃色的酵母堿不溶性葡聚糖粉末。將其放入水解管中，加入27 mL 2.7 mol/L的H2SO4后封管，置于100 ℃的水浴中水解3 h。水解液轉入100 mL容量瓶中，定容備用。將經(jīng)酸處理后的樣品溶液稀釋到質量濃度為0.04 mg/mL后，取1.0 mL加入蒽酮試劑，按照硫酸-蒽酮法測定含量[13]。

酵母堿不溶性葡聚糖按1∶10(m/v)添加90%甲酸,85 ℃降解1 h,加熱,除去甲酸,調節(jié)pH值至11,過濾,將過濾濃縮液的pH值調節(jié)至中性,加熱到70 ℃處理30 min, 真空冷凍干燥即獲得水溶性酵母葡聚糖,最后將其用pH值8.0的磷酸緩沖液配制成8 mg/mL的水溶性酵母葡聚糖供試液，備用[14]。

1.5 試驗設計

60只Balb/C小鼠隨機分為6組，每組10只，雌雄各半，豬PPV抗體檢測ELISA試劑盒檢測PPV抗體均為陰性。皮下分點注射，隔周進行二免，每組免疫劑量與首次免疫劑量相同。免疫后不同時間每組分別隨機抽取3只小鼠進行摘眼球采血并分離血清。具體分組及免疫方案見表1。

表1 試驗分組及免疫情況

1.6 抗體水平的測定

免疫0、1、2、3、4、5、6周后，對分離到的血清在56 ℃水浴滅活30 min。按照PPV ELISA診斷試劑盒(試劑盒中酶標羊抗豬IgG更換為辣根過氧化物酶標記羊抗小鼠IgG)使用說明書操作，應用間接ELISA方法檢測小鼠血清中PPV的抗體水平。

1.7 小鼠T淋巴細胞亞群的測定

免疫0、1、2、3、4周后，對采集的血液使用檸檬酸鈉抗凝，取抗凝血0.2 mL, 加2 mL 紅細胞裂解液, 充分混勻，室溫作用10 min, 2 000 r/min離心5 min, 棄上清液, 加5 mL PBS洗滌, 2 000 r/min 離心10 min,重復2次。將每份血清樣品分裝2管，一管加入鼠抗CD3-FITC、CD4-PE單克隆抗體各10 μL，另一管加入鼠抗CD3-FITC、CD8-PE單克隆抗體各10 μL，每管取細胞懸液500 μL，4 ℃冰箱中避光反應1 h，再加PBS 緩沖液1 mL，混勻，2 000 r/min離心5 min，棄上清，將管底細胞用1 mL PBS 懸浮，用FACsort 流式細胞儀檢測，每個樣本計數(shù)3 000個細胞，結果用Mod Fit LT軟件分析[15]。

1.8 細胞因子IL-4、IL-6 和IFN-γ含量的測定

按照ELISA檢測試劑盒使用說明書，檢測小鼠免疫7、14、21、28 d后血清中IL-4、IL-6和IFN-γ的含量。以標準品的質量濃度為橫坐標、OD值為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)樣品的OD值計算小鼠血清中IL-4、IL-6和IFN-γ的含量。

1.9 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 11.5及Excel 2000將所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，計算其平均值,試驗數(shù)據(jù)以平均值± 標準差表示,并用SPSS 11.5軟件進行Duncan’s多重分析。

2 結果與分析

2.1 水溶性酵母葡聚糖對PPV抗體水平的影響

用ELISA方法對每周收集的血清進行抗體水平的檢測，得到抗體水平消長曲線(圖1)。統(tǒng)計分析結果表明，從第2周開始，除了水溶性酵母葡聚糖組，自制疫苗組、自制疫苗+水溶性葡聚糖組、商品疫苗組、商品疫苗+水溶性葡聚糖組抗體水平均顯著高于生理鹽水組，自制疫苗免疫組與商品疫苗免疫組差異不顯著，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗組的抗體效價與相應的滅活疫苗單獨免疫組差異均不顯著。整體上，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗組的抗體水平高于相應的滅活疫苗單獨免疫組。

圖1 小鼠血清抗體水平的檢測結果

2.2 水溶性酵母葡聚糖對外周血中T淋巴細胞亞群的影響

2.2.1 CD3+T淋巴細胞 各組CD3+T淋巴細胞百分率均比生理鹽水組高(圖2)。自制疫苗免疫組與商品疫苗免疫組差異不顯著，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗免疫組均比相應的滅活疫苗組的CD3+百分率高，但差異不顯著。

圖2 免疫小鼠后外周血CD3+細胞百分率

2.2.2 CD3+CD4+T淋巴細胞 各組的CD3+CD4+T淋巴細胞百分率均高于生理鹽水組，各疫苗免疫組CD3+CD4+T淋巴細胞百分率均高于水溶性酵母葡聚糖組(圖3)。在免疫后14 d自制疫苗免疫組顯著高于商品疫苗免疫組，在免疫后21 d水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗免疫組趨于下降，但仍高于相應的滅活疫苗免疫組。整體上，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗免疫組均比相應的滅活疫苗組的CD3+CD4+T淋巴細胞百分率高，但差異不顯著。

2.2.3 CD3+CD8+T淋巴細胞 在免疫后14～28 d，除水溶性酵母葡聚糖單獨免疫組外，各試驗組的CD3+CD8+T淋巴細胞百分率均顯著高于生理鹽水組(圖4)。商品疫苗免疫組CD3+CD8+T淋巴細胞顯著高于自制疫苗免疫組。在免疫后21 d，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗免疫組顯著高于相應的滅活疫苗組。

圖3 免疫小鼠后外周血CD3+CD4+細胞百分率

圖4 免疫小鼠后外周血CD3+CD8+細胞百分率

2.3 水溶性酵母葡聚糖對細胞因子的影響

2.3.1 IL-4 從圖5可以看出，免疫小鼠后，各組的IL-4水平呈上升趨勢。免疫后7～28 d，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗組的IL-4水平顯著高于相應的疫苗組，各試驗組的IL-4水平均極顯著高于生理鹽水組。

2.3.2 IL-6 由圖6可知，免疫小鼠后，各個試驗組的IL-6水平均顯著高于生理鹽水組。免疫后14～28 d時，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗組的IL-6水平顯著高于相應的PPV滅活疫苗組。

2.3.3 IFN-γ 由圖7可知，水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合自制疫苗組與自制疫苗單獨免疫組的IFN-γ水平均在免疫后14 d達到峰值，且水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合滅活疫苗組的IFN-γ水平均顯著高于相應的滅活疫苗組。免疫后7～28 d，除水溶性酵母葡聚糖組外，其余試驗組的IFN-γ水平均極顯著高于生理鹽水組(圖7)。

圖5 免疫后小鼠血清中IL-4水平

圖6 免疫后小鼠血清中IL-6水平

圖7 免疫后小鼠血清中IFN-γ水平

3 討論

本研究結果表明，整體上，水溶性酵母葡聚糖組的抗體水平高于相應的滅活疫苗單獨免疫組，但差異不顯著。水溶性酵母葡聚糖作為免疫佐劑有利于抗體產生。

CD3是T細胞膜上的重要分化抗原，CD3+是成熟T細胞的特征性標志，CD3+分子的主要功能是傳遞T細胞活化信號，代表了機體的細胞免疫水平[16]。CD4+和CD8+分子是T淋巴細胞的2個重要表面標志，其中CD4+T淋巴細胞的作用是輔助和誘導增強免疫應答，其主要功能是分泌細胞因子，如IFN-γ、IL-2、TNF和淋巴毒素(LT)等[17-18]，CD8+T淋巴細胞主要是抑制、介導細胞毒性殺傷作用[19-21]。本試驗利用流式細胞儀檢測小鼠免疫后CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞百分率的變化，評價水溶性酵母葡聚糖聯(lián)合PPV滅活疫苗組的細胞免疫水平。結果顯示，水溶性酵母葡聚糖組的CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細胞百分率均比相應的滅活疫苗單獨免疫組高，表明水溶性酵母葡聚糖佐劑可增強小鼠的細胞免疫應答。

Th1和Th2效應細胞是由CD3+CD4+T淋巴細胞亞群激活后增殖分化得到的，通過分泌不同的細胞因子介導各自的免疫功能[22]。IL-4、IL-6是Th2型細胞產生的具有抗病毒作用的細胞因子，在免疫調節(jié)中具有非常重要的作用；IL-4還可以調節(jié)Th1型細胞分化，間接介導細胞免疫[23-24]。IFN-γ是由Th1細胞分泌的，不僅具有抗病毒作用，而且具有較強的免疫調節(jié)作用。本試驗結果表明，水溶性酵母葡聚糖能刺激淋巴細胞分泌IL-4、IL-6，能促進小鼠外周血淋巴細胞誘生IFN-γ，這可能是水溶性酵母葡聚糖增強免疫的分子機制之一。IFN-γ、IL-4、IL-6作為重要的Thl、Th2型免疫相關因子，相互制約、彼此調節(jié)，維持著機體正常的細胞免疫和體液免疫功能。

目前，PPV感染尚無有效的治療藥物，有效預防PPV病的主要手段是使用PPV疫苗進行免疫預防，但各種PPV疫苗均不能100%預防該病。本研究結果表明，水溶性酵母葡聚糖能夠增強PPV滅活疫苗的免疫應答，為水溶性酵母葡聚糖作為免疫增強劑的應用提供了理論依據(jù)。

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Influence of Water-soluble Yeast Glucan on Immune Effects of Porcine Parvovirus Inactivated Vaccines

JIN Xiaohui1,2，WANG Ruining1,XU Weisong1,GENG Jingwei1,HE Xiaoxiang1,ZHENG Lanlan2,ZHANG Jian3,WEI Zhanyong1,2*
(1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China；2.Key Laboratory for Animal-derived Food Safety of Henan Province,Zhengzhou 455000,China；3.Animal Health Supervision Institute of Pingqiao Distrit,Xinyang 464100,China)

In order to research the effect of water-soluble yeast glucan as immune adjuvant on immune effects of PPV inactivated vaccines,the mice were injected with PPV inactivated vaccine with the water-soluble yeast glucan,blood samples were taken weekly after vaccination.The antibody titers and sera secreting IL-6,IL-4, IFN-γand CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+T lymphocytes percentage were measured by ELISA and FCA.Compared with the vaccine immunization group alone,yeast glucan could enhance the number of CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+T-lymphocytes subpopulations,as well as IL-6, IL-4 and IFN-γ secretion of serum.However,there was unexpectedly little difference on antibody titers.It demonstrated that water-soluble yeast glucan injected with PPV inactivated vaccines could effectively enhance the body’s immune function,and water-soluble yeast glucan could serve as PPV immune adjuvant.

porcine parvovirus; inactivated vaccine; water-soluble yeast glucan; T-lymphocyte subsets; cellular immunity； humoral immunity

2016-01-10

河南省科技開放合作項目(142106000042)；河南省重大科技攻關項目(132102110034)

靳曉慧(1991-)，女，河南開封人，在讀碩士研究生，研究方向：動物分子病毒學、分子免疫學。 E-mail：1114780675@qq.com

*通訊作者：魏戰(zhàn)勇(1975-)，男，河南安陽人，教授，博士，主要從事動物分子病毒學、分子免疫學研究。 E-mail:weizhanyong@henau.edu.com

S852.4

A

1004-3268(2016)08-0125-06