發(fā)狀念珠藻醛酮還原酶基因NfAKR的克隆與表達(dá)

岳思君，李治學(xué)，范紅麗，周 娟，梁文裕，鄭 蕊*

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發(fā)狀念珠藻醛酮還原酶基因NfAKR的克隆與表達(dá)

岳思君1，李治學(xué)2，范紅麗1，周 娟1，梁文裕1，鄭 蕊1*

(1 寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點實驗室, 銀川750021; 2 拉薩市第一中等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，拉薩 850000)

以發(fā)狀念珠藻細(xì)胞為試材，采用PCR技術(shù)克隆了醛酮還原酶基因的開放閱讀框(ORF)序列，命名為NfAKR。對基因序列特征進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，根據(jù)其編碼氨基酸序列預(yù)測了NfAKR蛋白的三維結(jié)構(gòu)，同時探討了PEG-6000脅迫下NfAKR的表達(dá)特性。結(jié)果表明：NfAKR基因的編碼序列長912 bp，編碼304個氨基酸，預(yù)測其編碼蛋白的相對分子量為33.51 kD，理論等電點為4.94 ，具有醛酮還原酶超家族保守結(jié)構(gòu)域。NfAKR蛋白主要由10個α-螺旋和11 β-折疊組成，中間形成一個疏水穴，作為酶的催化活性中心。NfAKR與點形念珠藻處在同一進(jìn)化枝上，具有較近的親緣關(guān)系。qRT-PCR分析顯示，PEG-6000脅迫下NfAKR基因上調(diào)表達(dá)，當(dāng)PEG-6000濃度為8%時，其相對表達(dá)量為5.66并達(dá)到峰值。依據(jù)NfAKR基因響應(yīng)干旱脅迫上調(diào)表達(dá)的特性，推測醛酮還原酶可能參與發(fā)狀念珠藻抵御干旱脅迫過程。

發(fā)狀念珠藻，醛酮還原酶，基因克隆，干旱脅迫，表達(dá)分析

干旱是影響植物生長最主要的非生物脅迫之一，給植物的生長和產(chǎn)量等帶來諸多不利的影響。干旱、鹽和低溫等非生物逆境會誘導(dǎo)超氧離子、過氧離子、羥自由基等活性氧的積累，導(dǎo)致細(xì)胞中膜脂不飽和脂肪酸的過氧化水平增高，破壞膜結(jié)構(gòu)及膜的生理完整性，對植物產(chǎn)生傷害[1-2]。但它們同樣會作為信號調(diào)控活性氧的清除過程和其他保護(hù)機制，其在脅迫響應(yīng)過程中還可能會與其他響應(yīng)機制結(jié)合，如 ABA 通路等。植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)能有效清除活性氧，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢，保護(hù)細(xì)胞免受傷害[3-4]。關(guān)于植物干旱脅迫下的生理響應(yīng)及耐旱機制越來越受到人們的關(guān)注。

醛酮還原酶(Aldo-Keto Reductase，AKR)在生物中廣泛存在，形成了一個具有40個成員的超家族，其功能是參與醛/酮代謝，消除細(xì)胞內(nèi)的醛、酮毒害。AKR4 亞家族C(AKR4C)是植物中發(fā)現(xiàn)的一組AKR。一些雙子葉植物的AKR4C能夠催化活性醛代謝。在擬南芥中有 21 個該家族的基因[5]，但對該類基因的功能研究較少。大豆GmCHR基因編碼蛋白與 AKR類蛋白相似，其功能結(jié)構(gòu)區(qū)具有質(zhì)子供體位點、亞基結(jié)合位點以及核酸結(jié)合位點等。GmCHR基因在 NaCl 脅迫后期的上調(diào)表達(dá)可能參與鹽脅迫引起的活性氧的清除和一些過氧化物有毒物質(zhì)的清除，對脅迫后的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)修復(fù)有作用[6]。ALDH是一類依賴 NADPH 的醛酮還原酶，能特異性結(jié)合醛使其轉(zhuǎn)化為羧酸，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧毒害。過表達(dá) Ath-ALDH3 能降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的乙醛含量，其持續(xù)過表達(dá)利于植物通過解毒機制提高對脅迫的耐受性[7]。

發(fā)狀念珠藻(Nostocflagelliforme)，亦稱發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌，是生長在荒漠半荒漠地區(qū)的旱生藍(lán)藻類低等植物，不僅具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值，還在維持當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。由于生長環(huán)境惡劣，長期遭受干旱脅迫，使得發(fā)狀念珠藻表現(xiàn)出很強的干旱適應(yīng)性，但其耐旱機理尚不清楚。因此，從分子水平研究其耐逆及適應(yīng)機制、尋找其生長發(fā)育規(guī)律以及實現(xiàn)發(fā)狀念珠藻人工培養(yǎng)，多年來一直是研究者關(guān)注的熱點[8-9]。

本研究的目的是通過發(fā)狀念珠藻醛酮還原酶基因的克隆和初步的耐旱性驗證，獲得發(fā)狀念珠藻耐旱基因的相關(guān)信息，從而為實現(xiàn)念珠藻耐旱材料的高效篩選和改良提供基礎(chǔ)信息，并為創(chuàng)制耐旱轉(zhuǎn)基因材料提供有效的基因，進(jìn)一步充實和完善發(fā)狀念珠藻干旱脅迫基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和機制的研究信息。

1 材料和方法

1.1 材 料

實驗材料為發(fā)狀念珠藻懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，保存于寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用微生物學(xué)實驗室，培養(yǎng)條件為25 ℃、80 r/min光照培養(yǎng)，生長培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基。8 000 r/min離心收集藻細(xì)胞，保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 方 法

1.2.1NfAKR基因開放閱讀框的擴增 取50 mg發(fā)狀念珠藻細(xì)胞，-80 ℃速凍，液氮研磨成粉末，采用CTAB法提取發(fā)狀念珠藻基因組DNA。電泳檢測DNA質(zhì)量。

根據(jù)發(fā)狀念珠藻基因組精細(xì)測序圖中醛酮還原酶基因的ORF序列，設(shè)計上游引物AKR-F(5′-CGCGGATCCATGTCTGAGTTTTATAGTGG-3′，劃線部分為BamH I酶切位點)和下游引物AKR-R(5′-CCCAAGCTTTCAACGGTTAACAGTACTCA-3′，劃線部分為HindIII酶切位點)。以發(fā)狀念珠藻總DNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴增。擴增條件為：94 ℃ 預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。目的片段經(jīng)回收、檢測并測序。

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞、DNA Marker、Taq DNA 聚合酶、Protein MarkerIII、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京天根公司。pGEM-T Easy 載體、T4 DNA 連接酶購自美國Promaga 公司。限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII購自美國Fermentas公司。引物合成及基因測序由上海生工生物工程公司完成。

1.2.2NfAKR基因的生物信息學(xué)分析 其他物種的 AKR 氨基酸序列均來自于NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫，采用BLAST 進(jìn)行序列比對。先用ClustalX2.1軟件對序列進(jìn)行多重比對，再用NJ法完成系統(tǒng)樹的構(gòu)建，并用MEGA5 對系統(tǒng)樹進(jìn)行測試和編輯，生成報告圖形。使用ExPASy(http://www.expasy.org)網(wǎng)站相關(guān)軟件完成蛋白質(zhì)基本性質(zhì)分析。通過SWISS-MODEL(http: //www.swissmodel. expasy.org/) 建立蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)模型。

1.2.3NfAKR基因qRT-PCR分析 以發(fā)狀念珠藻RPL13基因為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR檢測，分析NfGR基因的表達(dá)特性。NfAKR基因上下游引物分別為AKR-qF(5′-ATGTCTGAGTTTTATAGTG-3′)和AKR-qR(5′-GATACTGCTGATATGTA-3′)。RPL13基因上下游引物分別為RPL13-F(5′-TAGAGTTTGC CTGTATCAT-3′)和RPL13-R(5′-TCCGTGGTTTGTCATC-3′)。qRT-PCR擴增程序為：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s；50 ℃退火30 s；72 ℃延伸20 s，共45個循環(huán)。實驗共設(shè)3個重復(fù)，利用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達(dá)量[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 NfAKR基因的開放閱讀框(ORF)克隆

以發(fā)狀念珠藻基因組DNA為模板，AKR-F 和AKR-R 為引物進(jìn)行PCR擴增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增到一條900 bp左右的特異條帶(圖1)。將回收的片段連接至pMD18-T載體, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行菌落PCR鑒定。

回收NfAKR基因片段，連接到pGEM-T Easy載體并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布、藍(lán)白斑篩選，挑取陽性克隆轉(zhuǎn)接后，37 ℃培養(yǎng)過夜。提質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶，能夠從質(zhì)粒中擴增出900 bp左右的目的基因條帶(圖2)，雙酶切切出兩條帶，其中一條為900 bp左右的NfAKR基因條帶(圖3)，與預(yù)期的擴增片段大小一致 。將陽性克隆送至上海生工生物技術(shù)有限公司測序，由測序結(jié)果可知，NfAKR基因的ORF長912 bp。

N.陰性對照；1～2. PCR產(chǎn)物；M. DL2000圖1 NfAKR基因編碼序列的克隆N. Negative control；1～2. PCR products；M. DL2000Fig.1 Cloning of the coding sequence of NfAKR

2.2 NfAKR基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析

氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，NfAKR基因ORF可編碼304個氨基酸殘基，預(yù)測分子量為33.51 kD。NfAKR蛋白具有醛酮還原酶超家族(Aldo_ket_red_superfamliy)結(jié)構(gòu)域(圖4)，此功能保守區(qū)的存在與醛酮還原酶的還原作用密切相關(guān)。

NfAKR基因編碼蛋白是醛酮還原酶超基因家族中的一員，具有氧化還原活性。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，來源于側(cè)生藻(Fisherallesp.)、彎曲單岐藻(Tolypothrixcampylonemoides)、單歧藻(Tolypothrixsp. PCC 7601)、聚球藻(Synechococcussp. PCC 7502)、發(fā)毛針藻(CrinaliumepipsammumPCC 9333)、單歧偽枝藻(ScytonematolypothrichoidesVB-61278)、微毛藻(Microchaetesp.PCC7113)和假魚腥藻(PseudanabaenabicepsPCC 7429)等物種的AKR 蛋白與本研究克隆的NfAKR基因編碼蛋白的相似性較高。用ClustalX2.1軟件對這些物種的氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)它們在保守位置具有25個活性位點，其中第32、34、57、102 位的Asp、Tyr、Lys 和His氨基酸殘基為保守的具有催化活性的部位(圖5)。

M. DL2000；N.陰性對照；1～2. PCR產(chǎn)物圖2 NfAKR基因陽性質(zhì)粒PCR驗證M. DL2000; N. Negative control；1～2. PCR productsFig.2 PCR products from positive plasmid of NfAKR gene

M. DL2000；N.陰性對照；1～2. PCR產(chǎn)物; M. DL2000；1. 未酶切質(zhì)粒；2. HindⅢ 單酶切；3～4.BamHI/ HindⅢ雙酶切圖3 NfAKR基因陽性質(zhì)粒酶切結(jié)果M. DL2000；1. Non-digested plasmid；2.HindⅢ digested plasmid；3～4. BamHI/ HindⅢdigested plasmidFig.3 Enzyme digestion of positive plasmid of NfAKR gene

圖4 NfAKR蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Prediction of the conserved domain of NfAKR

黑色表示序列完全相同，灰色表示部分相同，下劃線區(qū)為醛酮還原酶結(jié)構(gòu)域序列；FspAKR、TspAKR、TcAKR、SspAKR、CeAKR、StAKR、PbAKR、MspAKR和NfAKR分別為側(cè)生念珠藻、單歧藻、彎曲單岐藻、聚球藻、發(fā)毛針藻、單歧偽枝藻、假魚腥藻、微毛藻和發(fā)狀念珠藻AKR氨基酸序列圖5 醛酮還原酶氨基酸序列的多重比對Black area donates the same sequence，gray area donates partial matching，the underline marks domain sequences in AKR proteins;FspAKR, TspAKR, TcAKR, SspAKR, CeAKR, StAKR, PbAKR, MspAKR and NfAKR represent amino acid sequence of AKR from Fischerella sp.PCC9605, Tolypothrix sp. PCC 7601, Tolypothrix campylonemoides, Synechococcus sp. PCC 7502, Crinalium epipsammum PCC 9333, Scytonema tolypothrichoides VB-61278, Pseudanabaena biceps PCC 7429,Microchaete sp.PCC7113 and Nostoc flaglliforme，respectivelyFig.5 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of AKRs

根據(jù)GOR4在線軟件預(yù)測，NfAKR蛋白二級結(jié)構(gòu)由45.07%的α-螺旋(alpha helix )、9.87% β-折疊(extended strand)和45.07% 無規(guī)則卷曲(random coil)組成。其中α-螺旋和無規(guī)則卷曲是NfAKR蛋白的主要組成部分，而β-折疊則散布在蛋白序列中。三維結(jié)構(gòu)以印度蛇根草醛酮還原酶(PDB ID: 3v0u _A) 為模型，通過SWISS-MODEL 進(jìn)行同源建模(圖6)。整個蛋白由10個α-螺旋和11 條β-折疊組成。α-螺旋在外部，延伸主鏈在內(nèi)部，中間形成1個疏水穴，構(gòu)成酶的活性中心。

2.3 NfAKR基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步分析發(fā)狀念珠藻 NfAKR 蛋白與其他物種相關(guān)蛋白的進(jìn)化關(guān)系，采用MEGA 5軟件，對10種不同物種的AKR蛋白進(jìn)行同源比對，構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，發(fā)狀念珠藻與點形念珠藻(Nostocpunctiforme)、側(cè)生藻(Fisherallesp.)、單岐藻(Tolypothrixcampylonemoides)、聚球藻(Synechococcussp.)和假魚腥藻(Pseudomonasp.)聚為一支，與點形念珠藻親緣關(guān)系最近。而藍(lán)桿藻(Cyanothecesp.)金囊藻(Gloeocapsasp.)、單歧偽枝藻(Scytonematolypothrichoides)和微毛藻(Microchaetesp.)聚類為另外一支(圖7)。

A. 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測； B. 利用SWISS-MODEL建立的三維結(jié)構(gòu)圖6 NfAKR蛋白的結(jié)構(gòu)分析和建模A. Secondary structure prediction; B. Three-dimensional structure based on SWISS-MODELFig.6 Structural analysis and modeling of NfAKR

節(jié)點上的數(shù)值表示Bootstrap重復(fù)1 000次的置信度；標(biāo)尺表示演化距離圖7 NfAKR蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Values at nodes show the confidence level of bootstrap replication 1 000；scaleplate represents the evolution distance of these algasFig.7 Phylogenetic analysis of NfAKR protein

2.4 PEG-6000脅迫下NfAKR基因表達(dá)

圖8 PEG-6000脅迫下NfAKR基因的表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of NfAKR gene under PEG-6000 drought-stress

采用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)分析了不同濃度PEG-6000模擬干旱處理下NfAKR的表達(dá)情況(圖8)。在 PEG-6000脅迫處理下，發(fā)狀念珠藻NfAKR基因隨PEG-6000濃度的增加上調(diào)表達(dá)。在PEG-6000濃度為4% 時，NfAKR基因開始誘導(dǎo)表達(dá)，并持續(xù)上升。 PEG-6000濃度為8%時，基因的表達(dá)量出現(xiàn)峰值5.66。當(dāng)PEG-6000濃度為10%時，NfAKR表達(dá)量下降。說明在高濃度PEG-6000脅迫下，細(xì)胞受到損傷嚴(yán)重，NfAKR基因的表達(dá)受到抑制。

3 討 論

AKR是一類胞質(zhì)蛋白，存在于原核及真核細(xì)胞中，大部分AKR家族成員都與細(xì)胞保護(hù)、腫瘤形成及診斷有關(guān)。AKR具有解毒功能，能夠把有毒的醛或酮轉(zhuǎn)變成醇，進(jìn)而避免細(xì)胞受到醛、酮的毒害[11]。目前關(guān)于AKR的研究，大都集中在免疫及腫瘤方面。?，摤摰萚12]研究發(fā)現(xiàn)AKR1C3基因會抑制細(xì)胞的生長，損傷動物肝腎，可為癌癥的診斷和治療提供依據(jù)。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，AKR2A在各種脅迫中起到調(diào)控脅迫蛋白的作用，當(dāng)植物遭受鹽脅迫和損傷時，AKR2A表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢[13]。這表明植物細(xì)胞中各細(xì)胞器能夠協(xié)調(diào)抗脅迫防護(hù)的能力，在遭受非生物脅迫，如鹽、氧化脅迫及損傷脅迫時。AKR可通過表達(dá)量的增加或活性的升高對緩解脅迫起積極作用。

本試驗對分離到的發(fā)狀念珠藻NfAKR基因編碼氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白在保守位置有25個活性位點，這與醛酮還原酶超基因家族的成員特征相符[14-16]。在三維結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)，該蛋白由10個α-螺旋和11條β-折疊主鏈組成。α-螺旋在外部，β-折疊在內(nèi)部，中間形成1 個疏水穴，形成酶的催化活性中心。通過進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)狀念珠藻與點形念珠藻、側(cè)生藻、單岐藻等物種親緣關(guān)系較高，從進(jìn)化樹中所處的位置看它們可能是從一個祖先分化而產(chǎn)生的多重分支。

發(fā)狀念珠藻NfAKR基因受干旱脅迫誘導(dǎo)，隨PEG-6000脅迫濃度增加，表達(dá)量增加并達(dá)到峰值。但隨脅迫濃度繼續(xù)增加，細(xì)胞相關(guān)組分受到干旱傷害，以致NfAKR基因表達(dá)量在高濃度PEG-6000模擬干旱脅迫時降低，這可能因為高濃度PEG-6000模擬干旱增加了細(xì)胞生長環(huán)境的干旱程度，細(xì)胞內(nèi)成分因嚴(yán)重缺水而損傷，基因的表達(dá)呈下降趨勢。這和本實驗室研究的NfPrx[17]和NfGR基因受干旱脅迫時的表達(dá)特性一致。表明植物耐旱能力的形成是由多個基因協(xié)同參與形成的，耐逆性調(diào)節(jié)基因的上調(diào)表達(dá)在一定程度上提高了植物的耐逆能力。在抵御外界干旱環(huán)境過程中，NfAKR發(fā)揮一定作用。有關(guān)受逆境脅迫時, NfAKR與其他相關(guān)蛋白協(xié)同參與清除活性氧、參與跨膜運輸和信號傳導(dǎo)的具體的耐逆機制，需要進(jìn)一步研究。

[1] 韓 剛, 黨 青, 趙 忠. 干旱脅迫下沙生灌木花棒的抗氧化保護(hù)響應(yīng)研究[J]. 西北植物學(xué)報, 2008, 28(5): 1 007-1 013.

HAN G, DANG Q, ZHAO Z. Response of antioxidation protection system ofHedysarumscopariumto drought stress[J].ActaBot.Boreali-OccidentaliaSinica, 2008, 28(5): 1 007-1 013.

[2] 張燦軍, 冀天會, 等.小麥抗旱性鑒定方法及評價指標(biāo)研究Ⅰ鑒定方法及評價指標(biāo)[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2007, 23(9): 226-230.

ZHANG C J, JI T H,etal. Study on resistance drought identify method and evaluation index of wheatⅠidentify method and evaluation index[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin, 2007, 23(9): 226-230.

[3] NAOMI HM, KEN M,etal. Anti-oxidative stress system in cyanobacteria[J].BiologicalChemistry, 2005, 280(1): 840-846.

[4] 張顯強, 李 超, 王世杰,等. 喀斯特石生穗枝赤齒蘚抗氧化防御系統(tǒng)對干旱脅迫的響應(yīng)[J]. 廣西植物, 2015, 35(2):200-205.

ZHANG X Q, LI C, WANG S J,etal. Responses of antioxidant defense system ofErythrodoutiumjuluceumto drought stress in rocky desertification of karst areas[J].Guihaia, 2015, 35(2):200-205.

[5] SIMPSON PJ, TANTITADAPITAK C, REED AM,etal. Characterization of two novel aldo-keto reductases from Arabidopsis: expression patterns, broad substrate specificity, and an open active-site structure suggest a role in toxicant metabolism following stress[J].JournalofMolecularBiology, 2009, 392(2): 465-480.

[6] WANG WQ, LI L, HUANG S,etal. A secondary suppression subtractive hybridization method for isolation and identification of some salt-induced genes in soybean (GlycinemaxL. Merr)[J].AustralianJournalofCropScience, 2012, 6(1): 46-55.

[7] SUNKAR R, BARTELS D, KIRCH H H. Overexpression of a stress-inducible aldehyde dehydrogenase gene fromArabidopsisthalianain transgenic plants improves stress tolerance[J].ThePlantJournal, 2003, 35(4): 452-464.

[8] LIANG W Y, ZHOU Y W, WANG L X,etal. Ultrastructural, physiological and proteomic analysis ofNostocflagelliformein response to dehydration and rehydration[J].JournalofProteomics, 2012, 75:5 604-5 627.

[9] GAO X, YANGY W, CUI L J,etal. Preparation of desiccation-resistant aquatic-livingNostocflagelliforme(Cyanophyceae) for potential ecological application[J].MicrobialBiotechnology, 2015, (6):1 006-1 012.

[10] LIVAK KJ, SCHMITTGEN TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method[J].Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[11] 李 丹, 張岐山, 初 陽. 表達(dá)醛酮還原酶AKR7A1 對巴豆醛致畸作用的影響[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2012, 28(10): 1 213 -1 215.

LI D, ZHANG Q S, CHU Y. Effect of AKR7A1 overexpression on crotonaldehyde-induced mutagenicity in V79-4 cells[J].ChineseJournalofCellularandMolecularImmunology, 2012, 28(10): 1 213-1 215.

[12] ?，摤?劉傳志,李艷紅.醛酮還原酶AKR1C3 基因的原核表達(dá)及其生物學(xué)活性[J].中國生物制品學(xué)雜志, 2015, 28(5): 461-467.

NIU Y Y, LIU C Z, LI Y H,etal. Prokaryotic expression and biological activity of aldehyde and ketone reductase AKR1C3[J].ChineseJournalofBiologicals, 2015, 28(5): 461-467.

[13] EUGENIA L, MARY S K, CAWAS E,etal. Expression profiling of ascorbic acid-related genes during tomato fruit development and ripening and in response to stress conditions[J].JournalofExperimentalBotany, 2009, 60: 663-678.

[14] HYNDMAN D, BAUMAN DR, HEREDIA VV,etal．The aldo-keto reductase superfamily homepage[J].Chemico-BiologicalInteractions，2003, 143/144: 621-631.

[15] MINDNICH RD, PENNING TM．Aldo-keto reductase(AKR) superfamily: genomics and annotation[J]．HumanGenomics, 2009, 3(4): 362-370.

[16] PENNING TM，DRURY JE．Human aldo-keto reductases: function，gene regulation，and single nucleotide polymorphisms[J].ArchivesofBiochemistryandBiophysics，2007，464(2): 241-250.

[17] 岳思君, 周 娟, 鄭 蕊，等.發(fā)狀念珠藻過氧化物還原酶NfPrx基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 植物生理學(xué)報2016, 52(8): 1 287-1 294.

YUE S J, ZHOU J, ZHENG R，etal．Cloning and expression analysis ofNfprxgene fromNostocflagelliforme[J].PlantPhysiologyJournal， 2016, 52(8): 1 287-1 294.

(編輯:宋亞珍)

Gene Cloning and Expression ofNfAKRfromNostocflagelliforme

YUE Sijun1, LI Zhixue2, FAN Hongli1, ZHOU Juan1, LIANG Wenyu1, ZHENG Rui1*

(1 College of Life Sciences, Ningxia University, Key Lab of Ministry of Education for Protection and Utilization of Special Biological Resources in Western China, Yinchuan 750021, China; 2 First Medium Occupation Technical School of Lhasa City，Lhasa 850000，China)

Full-length of open reading frame sequence encoding aldo-keto reductases was cloned fromNostocflagelliformecells with PCR. The gene was named asNfAKR. Sequence analysis showed that the complete open reading frame ofNfAKRwas 912 bp, which encoded 304 amino acids residues. The relative molecular mass of NfAKR was 33.51 kD, and its isoelectric point was 4.94. NfAKR protein had the aldo ket red superfamliy domain, and the three-dimension structure was composed by 10 α-helices and 11 β-sheets，among which there was a hydrophobic cavity as catalytic active site. Phylogenetic analysis showed that aldo-keto reductase fromN.flagelliformeandN.punctiformehad high similarity. Quantitative real-time PCR analysis showed that the expression ofNfAKRgene was up-regulated under drought stress of PEG-6000.When the concentration of PEG-6000 was 8%, the relative expression was 5.66, reaching the peak value. TheNfAKRexpression was upregulated, suggesting that aldo-keto reductase plays a certain role in the process of resisting drought stress inN.flagelliforme.

Nostocflagelliforme; aldo-keto reductase; gene cloning; drought stress; expression analysis

1000-4025(2016)12-2370-06

10.7606/j.issn.1000-4025.2016.12.2370

2016-07-11;修改稿收到日期:2016-10-10

國家自然科學(xué)基金(31360025，31360361，31360054)；寧夏大學(xué)研究生創(chuàng)新項目(GIP201611)

岳思君(1972-)，男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事微生物學(xué)研究。E-mail: sijunyue@126.com

*通信作者:鄭 蕊，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事植物生物技術(shù)研究。E-mail: xlzheng@126.com

Q785;Q786

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