呼氣檢測肺癌的臨床應(yīng)用

林麗泉，王福園，陳星

浙江大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310027

呼氣檢測肺癌的臨床應(yīng)用

林麗泉，王福園，陳星

浙江大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與儀器科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310027

肺癌是目前世界上最常見也是死亡率最高的癌癥，而大多數(shù)肺癌患者往往是到了中晚期才被確診，因而錯過最佳治療階段。研究表明肺癌的早期診斷結(jié)合及時治療能有效延長患者5年的生存期，因此迫切需要有效的早期診斷方法。目前臨床普遍采用低劑量CT掃描、X線檢測等手段檢測早期肺癌，但是由于其輻射危害，會增加患癌風(fēng)險。呼氣檢測作為快速無損的診斷方法之一，在早期肺癌診斷中是一種極具發(fā)展前景的技術(shù)手段，有著十分明確的臨床應(yīng)用價值。

呼氣檢測；肺癌診斷；揮發(fā)性有機物；冷凝物

1 研究背景

肺癌是目前世界上最常見也是死亡率最高的癌癥[1]，而大多數(shù)肺癌患者往往是到了中晚期才被確診，因而錯過最佳治療階段。研究表明肺癌的早期診斷結(jié)合及時治療能有效提高患者5年生存率[2]，因此迫切需求有效的早期診斷方法。目前臨床用于早期檢測肺癌普遍采用的是低劑量CT掃描[3]、X線檢測[4]等。雖然這些方法確實有助于早期肺癌的發(fā)現(xiàn)，但是即使是短暫的暴露在放射線下，仍然會增加其患癌風(fēng)險。作為快速無損的診斷方法，呼氣檢測在早期肺癌診斷中是一種極具發(fā)展前景的技術(shù)手段，有著十分明確的臨床應(yīng)用價值。

呼吸氣體診斷是檢測呼出氣體中成分的改變，來反映組織細胞新陳代謝的改變，從而評估健康狀態(tài)以及疾病類型。肺作為呼吸作用的主要器官，一旦其出現(xiàn)病變，呼出氣體中會含有相對濃度較高的肺部疾病標識物。呼吸氣體檢測肺癌的第一步就是需要找到針對肺癌的呼出氣體中的標志物，目前國際上還沒有公認的肺癌標志物，但各項研究仍然層出不窮。本文主要介紹目前呼氣檢測肺癌的標志物研究以及未來的發(fā)展趨勢。

2 肺癌呼氣標志物的研究

呼氣肺癌標志物主要分為兩部分，一是揮發(fā)性有機化合物，另一部分是非揮發(fā)性有機化合物；前者在室溫下主要以氣體狀態(tài)存在，其中絕大部分是揮發(fā)性有機化合物（Volatileorganic Compounds，VOC），后者為呼出氣體冷凝物（Exhaled Breath Condensate，EBC）主要在液體狀態(tài)下存在，其中包含有蛋白和基因等物質(zhì)。

2.1 VOCs中的標志物在臨床的應(yīng)用

VOC指的是常溫下以蒸汽形式存在，其沸點50～260℃之間且室溫飽和蒸汽壓超過133.32 Pa的有機物。人體呼出氣中的VOCs只有ppd-ppt數(shù)量級的含量，但種類眾多，成分復(fù)雜。肺部的一些病變可能導(dǎo)致相比于正常情況下的VOCs種類或者濃度的變化，監(jiān)測VOCs的組成成分和水平可以有效的用于肺癌的早期診斷、篩選、預(yù)后等方面的臨床應(yīng)用。雖然目前沒有公認的標志物，但是研究者們不斷的發(fā)現(xiàn)呼出氣中的肺癌標志VOCs。其中主要包括7大類烷烴類、醇、醛、酮、酯、腈、芳香族化合物[5]?？墒?，關(guān)于呼出氣體與肺癌之間的關(guān)系尚不明確，學(xué)者認為烷烴類物質(zhì)，比如乙烷、戊烷等是由細胞膜上的不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物。

Gordon等[6]最早利用GC-MS檢測技術(shù)分析了12個肺癌呼出氣樣本和17個健康人呼出氣樣本，并在其質(zhì)譜圖上選擇了2組差異最大的22個物質(zhì)峰進行分析，同時建立模型來區(qū)分肺癌與非肺癌。通過這個實驗，證明了呼出氣有臨床診斷肺癌的價值。

Phillips等[7]同樣采用GC-MS的檢測方法前后做了幾次實驗：1999年，采集檢測了108例胸片異常的（其中60例經(jīng)由組織學(xué)檢查為肺癌）病人的呼出氣，并找到22種VOCs的組合用于診斷肺癌，達到了71.7%的診斷靈敏性和66.7%的診斷特異性，并且這個組合對肺癌I期有100%的敏感性和81.3%的特異性；2003年，收集了178例支氣管鏡檢查的病人和41個健康的志愿者的呼出氣對原發(fā)性肺癌（Primary Liver Cancer，PLC）的診斷進行研究[2]，建立了由9種VOCs組成的預(yù)測模型，該模型對PLC的敏感性為89.6%、特異性為82.9%，可用于在肺癌高危人群中進行肺癌的篩選；2007年，采集了193位肺癌患者和211位健康人進行呼吸檢測，又確定了16種有特異性差異的VOCs[8]。Phillips的研究結(jié)果中VOC包含烷烴類、醛、芳香族化合物等物質(zhì)。同時，Poli等[9]采用SPME-GCMS分析了非小細胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）、慢性阻塞性肺?。–hronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）、吸煙組、對照組4組人的呼出氣，發(fā)現(xiàn)的13種VOCs的組合能有效的區(qū)分這些組別。此外還發(fā)現(xiàn)，異戊二烯和癸烷含量在手術(shù)后會顯著降低，這代表VOCs的確對肺癌預(yù)后有潛在的臨床應(yīng)用價值。

除了GC-MS檢測手段的應(yīng)用，還有其它檢測方法被用于呼出氣檢測肺癌的研究。Wehinger等[10]采用質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜（Proton Transfer Reaction Mass，PTR-MS），并發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比為31和43的VOC可以區(qū)分原發(fā)性肺癌和健康對照組。該實驗還說明了更省時和更方便的呼氣檢測肺癌技術(shù)未來在臨床應(yīng)用上會有很大的發(fā)揮空間。

以上都是介紹各項區(qū)分肺癌與非肺癌之間的VOCs種類的研究，目的在于尋找標志性VOCs來進行肺癌的早期診斷、篩選、預(yù)后等臨床應(yīng)用。本課題組從患肺癌風(fēng)險的方向進行了探究，為VOCs能在高危人群中篩選出相對更高危的對象提供證據(jù)。由于目前醫(yī)學(xué)上對肺癌高危人群的界定是根據(jù)吸煙年限，吸煙量等一些外在風(fēng)險因素的衡量來實現(xiàn)的，對于這部分人進行后續(xù)的CT或者X線篩查會增加這部分人群暴露在輻射下的機率而增加其患癌風(fēng)險。呼氣檢測的這一臨床應(yīng)用，主要表現(xiàn)在其提供了生物證據(jù)來更為精確的認定高危人群。筆者采集了155例體檢病人的呼出氣，同時采集環(huán)境氣體。氣體被富集在Tenax填充的金屬管中，然后利用熱脫附儀進行脫附，使用GC-MS技術(shù)進行物質(zhì)分析。運用統(tǒng)計學(xué)分析，并發(fā)現(xiàn)了一些VOCs能區(qū)分吸煙狀態(tài)、吸煙年限、吸煙量等吸煙情況。而且其中有些VOCs曾在各項研究中報道為肺癌標志物。這些VOCs顯然為更好的篩選肺癌高危人群以及患癌風(fēng)險評估提供了生物學(xué)依據(jù)，具有巨大的臨床應(yīng)用價值。

2.2 EBC中的標志物在臨床上的應(yīng)用

目前在EBC中發(fā)現(xiàn)的與肺癌相關(guān)的主要標志物有以下幾類：p53等基因類物質(zhì)、MicroRNA、細胞因子、酶類物質(zhì)、血管生成因子及其它功能蛋白。

Carpagnano等[12]首次報道了通過檢測EBC能診斷肺癌，因其在EBC中檢測到了炎癥標志物：細胞因子——白介素-6（IL-6）[11]、血管生成因子——內(nèi)皮素-1，且在EBC樣本中這兩種物質(zhì)在NSCLC組中的濃度高于對照組樣本中的濃度（P＜0.05）。Gessner等[13]又檢測了74個EBC的樣本，發(fā)現(xiàn)了血管生成標記物（VEGF、bFGF、血管生成因子）、白介素8（IL-8）、腫瘤壞死因子（TNF-α）可作為肺癌標識物。其中EBC中的血管生成標記物能顯著的區(qū)分17個NSCLC患者、穩(wěn)定或加劇的COPD患者以及健康志愿者。

Zou等[14]收集了105個肺癌病人和56個健康人的EBC樣本，采用化學(xué)發(fā)光免疫測定的檢測方法在EBC中檢測到了癌胚抗原（Carcino-Embryonic Antigen，CEA）、鱗狀細胞癌抗原（Squamous Cell Carcinoma，SCC）、神經(jīng)元特異性烯醇酶（Neuron-Specific Enolase，NSE）。這幾種蛋白在臨床上通過檢測血清中的含量而作為標志物應(yīng)用于肺癌檢測中。在該研究中，同時檢測血清中的3種蛋白的含量并與EBC的檢測結(jié)果進行對比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EBC中檢測到的蛋白比血清中檢測到的有更高的陽性率以及組織學(xué)類型的特異性。此外，EBC中的CEA還顯示出很好的預(yù)測早期NSCLC的特性（P＜0.006）。實驗不僅證明了EBC中的物質(zhì)的確存在臨床診斷肺癌的應(yīng)用價值，更說明了EBC中的腫瘤標記可能會比血清中的腫瘤標識物表現(xiàn)出更有效的肺癌診斷。

基因類的標志物同樣在EBC中被發(fā)現(xiàn)，Carpagnano等[15]在采集分析了41例NSCLC患者和18例非肺癌的EBC樣本中發(fā)現(xiàn)了3p微衛(wèi)星改變（Microsatellite Alterations，MAs），揭示了NSCLC的EBC中發(fā)現(xiàn)的DNA微衛(wèi)星比對照組更頻繁，且微衛(wèi)星的序列能夠?qū)?yīng)每個NSCLC患者的肺癌組織。隨后，該研究組又對34例NSCLC患者和33例健康人（包括19個非吸煙人和14個吸煙的人）的EBC中的19q區(qū)進行微衛(wèi)星檢測分析[16]，發(fā)現(xiàn)對于非吸煙的健康組來說不管在EBC中還是在全血中都沒有發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星改變，而有16%的健康吸煙組以及25%的NSCLC患者的EBC中檢測到微衛(wèi)星的改變。該研究表明19q區(qū)的微衛(wèi)星改變?yōu)镋BC中的DNA微衛(wèi)星改變作為遺傳物質(zhì)提供了依據(jù)，同時證明了核苷酸切除修復(fù)交叉互補基因-1（ERCC-1）、核苷酸切除修復(fù)交叉互補基因-2（ERCC-2）的微衛(wèi)星改變對NSCLC的診斷具有特異性。闡明了EBC中19q區(qū)的微衛(wèi)星改變可用于NSCLC的診斷、預(yù)后等臨床應(yīng)用。

此外，Gessner等[17]在EBC中檢測到p53基因突變，且NSCLC患者的EBC中的p53基因突變明顯高于對照組的情況。該研究結(jié)果還闡述了EBC中的基因突變可用于研究直接和煙草相關(guān)的DNA損傷。Han的研究組[18]在EBC中發(fā)現(xiàn)了DNA甲基化，通過對比分析，發(fā)現(xiàn)肺癌吸煙組Ras凋亡家族基因1A的甲基化密度比對照組高，且肺癌組中戒煙者的甲基化密度高于非吸煙者和吸煙者，而非肺癌組中的甲基化與吸煙情況無甚相關(guān)。由此推斷EBC中的DNA甲基化與吸煙情況和肺癌有一定關(guān)系，可為患癌風(fēng)險評估提供生物學(xué)依據(jù)。

MicroRNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為18-25個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，在細胞的表觀遺傳控制流程中具有重要作用，能具體地綁定到目標信使RNA（mRNA）序列。MicroRNA的表達變化與多種疾病相關(guān)，研究人員也著手研究其于肺癌的相關(guān)性。在EBC中發(fā)現(xiàn)MicroRNA后，Mozzoni等[19]分別分析了54例NSCLC的EBC樣本、血清樣本和46例對照組的兩種樣本。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-21不管是在EBC中還是在血清中肺癌組的表達都高于對照組，而miRNA-486恰恰相反，肺癌組中的表達低于對照組，這樣的表達區(qū)別對提高診斷率有很大的臨床意義，在未來的肺癌高危人群篩選中也占有重要作用。

3 未來趨勢

臨床上一般需要多個診斷指標聯(lián)合分析的方法對一個疾病進行綜合判斷。肺癌作為一種發(fā)病機理復(fù)雜、病理復(fù)雜、腫瘤生物學(xué)行為復(fù)雜的癌癥，要尋找單獨一個高靈敏度和高特異性的標志物的來進行診斷是不現(xiàn)實的。所以一方面在臨床上，呼氣檢測得到的結(jié)果可以和其它臨床診斷結(jié)果一起進行綜合分析，以提高其診斷率。而另一方面，單獨的呼氣檢測可以實現(xiàn)良好的重復(fù)性和實時監(jiān)測，而且呼氣中的標志物組合模型對肺癌的監(jiān)測也有一定的準確度，因此在家庭、社區(qū)醫(yī)院等場所可以用于日常的監(jiān)測和篩選，不需要去醫(yī)院做復(fù)雜的檢查，對個人來說節(jié)省了時間，降低了費用，對社會來說節(jié)省了醫(yī)療資源。

與此同時，呼吸檢測在臨床上可以用于肺癌高危人群的篩選、早期肺癌的診斷、療效評價、預(yù)后判斷等方面。在呼氣標志物的研究中，針對臨床的不同階段、不同應(yīng)用，需要找到各種相應(yīng)的標記物。在未發(fā)生肺癌之前，呼氣檢測的標志物可以對高危人群進行提醒其發(fā)生肺癌的風(fēng)險，從而達到早期干預(yù)的效果從根本上降低肺癌發(fā)生率；在肺癌的早期階段，需要有高特異性、高敏感性的標志物組合進行相對低成本的篩選診斷，同時配合CT、X線進行更加精確的診斷；在治療階段，需要有呼氣中標志物能及時表征治療效果，以配合醫(yī)生確定進一步治療的方案；在預(yù)后階段，也同樣需要特定的標志物來進行預(yù)后判斷，以提高患者的生存率。

未來呼氣檢測的發(fā)展趨勢一定會隨著人們對健康的需求進行變化，相對應(yīng)的檢測技術(shù)也根據(jù)具體情況的需要進行不同的發(fā)展和創(chuàng)新。

4 總結(jié)

呼氣檢測肺癌相比于CT掃描、X線檢測不僅具有無副作用的優(yōu)勢，更具有無創(chuàng)、便捷易行、實時監(jiān)測、患者耐受性好等優(yōu)勢，在肺癌早期診斷、篩選、療效評價、預(yù)后等方面都有一個很好的發(fā)展前景。但是目前的呼氣檢測的方法不僅沒有找到公認的標志物用于臨床應(yīng)用，也沒有對檢測技術(shù)進行標準化。因此，肺癌呼氣標志物產(chǎn)生機理的探索以及建立標準有效的聯(lián)合呼氣檢測方法，將會是呼氣診斷肺癌能否實現(xiàn)臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。

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Clinical Application of Exhaled Breath Detection for Lung Cancer

LIN Li-quan, WANG Fu-yuan, CHEN Xing
College of Biomedical Engineering and Instrument Science, Zhejiang University, Hangzhou Zhejiang 310027, China

Lung cancer (LC) was the most commonly cancer and had the highest mortality in the world. However, most patients with LC were diagnosed at an advanced stage, thus couldn’t grasp a more treatable stage. Studies showed that the combination of early diagnosis and timely treatment can improve the 5-year survival rate. Therefore the effective method for early diagnosis of LC was urgent needs. Low-dose CT scan and X-ray were by far widely used to early diagnose LC in clinical. These methods did contribute to the early detection of LC, but due to effect of radiation, it would increase the risk of canceration. As a non-invasive and rapid method, exhaled breath detection is a very promising technology and has definite clinical application value in the early diagnosis of LC.

R318.6

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2016.02.005

1674-1633(2016)02-0021-04

2015-11-10

國家自然科學(xué)基金項目（No.81201166，No.81571769）。

陳星，副教授，博士生導(dǎo)師。

通訊作者郵箱：cnxingchen@zju.edu.cn

Abstract:: exhaled breath detection; lung cancer diagnosis; volatile organic compounds; exhaled breath condensades