利用秀麗線蟲評價(jià)4種食藥用菌水提物抗氧化活性

林群英, 吳亮亮, 張鋒倫, 吳素玲, 項(xiàng)春榮, 孫曉明*

(1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042；2.江蘇鴻豐果蔬食品有限公司，江蘇 宿遷 223700； 3.鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)正東生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212000)

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利用秀麗線蟲評價(jià)4種食藥用菌水提物抗氧化活性

林群英1,2, 吳亮亮1,2, 張鋒倫1, 吳素玲1, 項(xiàng)春榮3, 孫曉明1,2*

(1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042；2.江蘇鴻豐果蔬食品有限公司，江蘇 宿遷 223700； 3.鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)正東生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212000)

利用秀麗線蟲為模型對樺褐孔菌、靈芝、云芝、灰樹花水提物進(jìn)行抗氧化活性評價(jià)。結(jié)果表明：樺褐孔菌水提物最佳抗氧化濃度為0.2 mg/mL，線蟲平均壽命為7.84 d，比對照組延長了1.17倍；靈芝、云芝和灰樹花水提物最佳抗氧化濃度均為1.0 mg/mL，線蟲平均壽命分別為8.84 d、6.75 d、5.98 d，比對照組分別延長0.92倍、1.08倍和1.20倍。研究結(jié)果為這些食藥用菌的開發(fā)提供有用的參考依據(jù)。

樺褐孔菌；靈芝；云芝；灰樹花；抗氧化

目前我國已成為世界第一大食用菌生產(chǎn)國。據(jù)對全國27個省、自治區(qū)、直轄市統(tǒng)計(jì)調(diào)查，2014年全國食用菌總產(chǎn)量3 270萬噸，產(chǎn)值2 258.1億元[1]。食用菌富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素、微量元素等營養(yǎng)成分[2]，還含有多糖、黃酮等活性成分[3]，具有營養(yǎng)及保健價(jià)值。隨著研究的深入開展，食用菌的活性功能越來越受關(guān)注。金針菇(Flammulinavelutipes)具有抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力和增強(qiáng)記憶的功能[4]?；覙浠?Grifolafrondosa)具有良好的護(hù)肝、抗腫瘤的活性功效[5]。藥用大型真菌的藥用功效同樣備受關(guān)注。據(jù)《中國藥典》記載，靈芝(Ganodermalucidum)具有補(bǔ)氣安神，止咳平喘的功能，同時(shí)規(guī)定了靈芝含多糖不得少于0.50 %；云芝(Coriolusversiclor)具有健脾利濕，清熱解毒的功效，含云芝多糖不得少3.2 %[6]。樺褐孔菌(Inonotusobliquus)是俄羅斯的一種民間藥用真菌，具有顯著的抗癌作用和抗氧化活性[7-8]。食藥用真菌資源的開發(fā)價(jià)值已經(jīng)得到越來越多的證實(shí)和認(rèn)可，為開發(fā)保健和功能產(chǎn)品提供了寶貴的生物資源。

秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)是生物研究的理想模式種，其生物學(xué)和基因組均得到充分的研究。秀麗線蟲易在顯微鏡下觀察，生命周期短，在20oC下平均壽命約為30天，且易于培養(yǎng)。在基因上與人類有60%～80%的相似度，研究結(jié)果具有意義，適合進(jìn)行高通量的功效藥物篩選[9]。因具有以上眾多優(yōu)勢，除了在基礎(chǔ)研究方面的應(yīng)用，秀麗線蟲在藥物篩選、功能評價(jià)等方面也已經(jīng)得到越來越廣泛的應(yīng)用[10-11]。在植物和微生物資源功能評價(jià)方面均有應(yīng)用，在大型真菌方面亦開始有報(bào)道[12]。利用模式生物秀麗隱桿線蟲可以有效區(qū)分不同產(chǎn)地靈芝的生物活性[13]。靈芝多糖可延長線蟲壽命，被認(rèn)為具有良好的抗衰老作用[14]。本研究以秀麗線蟲為模型，對樺褐孔菌、靈芝、云芝和灰樹花等4種食藥用真菌的抗氧化活性進(jìn)行研究，為開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與原材料

百草枯和5-氟尿嘧啶均購自Sigma公司，其余試劑為國產(chǎn)試劑。灰樹花由上海森明公司提供；靈芝和云芝為市售產(chǎn)品，產(chǎn)地為遼寧；樺褐孔菌提取物由杭州百山祖生物科技有限公司提供。

1.2 秀麗線蟲

野生型秀麗線蟲 N2由美國Caenorhabditis Genetics Center(CGC)提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水提物制備

將樺褐孔菌、靈芝和云芝粉碎至20目以下，按1∶20 (w/v)的比例加水煮沸2 h，紗布過濾后，再提取1次，將2次濾液合并，進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至生藥濃度為100 mg/mL。樺褐孔菌提取物用水溶解成水溶液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抗氧化活性評價(jià)

秀麗線蟲同步化及培養(yǎng)按參考文獻(xiàn)[15]，利用野生型秀麗線蟲N2進(jìn)行。將水提物配制成一定濃度后，添加至培養(yǎng)有秀麗線蟲的96孔板中，于20 ℃培養(yǎng)培養(yǎng)48 h，隨后往每個孔里添加百草枯至終濃度為40 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)。每天記錄線蟲存活數(shù)目，直至線蟲全部死亡。以0.5 mm粗的鉑金絲輕觸線蟲，無反應(yīng)者記為死亡。每組實(shí)驗(yàn)所測線蟲數(shù)目不少于80條。

1.3.3 壽命試驗(yàn)

根據(jù)抗氧化活性評價(jià)結(jié)果，用最佳濃度對N2進(jìn)行壽命試驗(yàn)。挑取同步化的L4期線蟲到各組含水提物的NGM平板培養(yǎng)基中，每組不低于100條。于20 ℃培養(yǎng)，從轉(zhuǎn)移時(shí)刻開始計(jì)算線蟲存活天數(shù)，轉(zhuǎn)移當(dāng)天記為壽命實(shí)驗(yàn)第0天，每天檢查線蟲，紀(jì)錄死亡數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樺褐孔菌水提物抗氧化活性

樺褐孔菌物水提物在低濃度(0.2 mg/mL)時(shí)可明顯提高秀麗線蟲的抗氧化能力，最大壽命為13 d，高長于對照組(9 d，圖1a)。但隨著濃度的提高，樺褐孔菌物水提物在0.5 mg/mL和1.0 mg/mL時(shí)，其抗氧化能力反而下降，平均壽命分別為5.12 d和5.45 d，均低于0.2 mg/mL處理組的平均壽命(7.84 d)，而高于對照組(4.08 d，圖1b)。

圖1 樺褐孔菌水提物對百草枯處理的秀麗線蟲壽命的影響

圖2 靈芝水提物對百草枯處理的秀麗線蟲壽命的影響

2.2 靈芝水提物抗氧化活性

在高濃度靈芝水提物(1.0 mg/mL)的處理下，秀麗線蟲的抗氧化能力最強(qiáng)，最大壽命為15 d，顯著高于對照組的最大壽命，(9 d，圖2a)，平均壽命為8.84 d，比對照組延長了4.40 d(圖2b)。在中低濃度下，靈芝水提物的抗氧化能力下降，平均壽命為3.69 d，短于1.0 mg/mL處理組的平均壽命，但仍長于對照組(圖2b)。

2.3 云芝水提物抗氧化活性

云芝水提物具有良好的抗氧化活性。濃度為1.0 mg/mL時(shí)，秀麗線蟲的抗氧化能力最強(qiáng)，最大壽命為12 d，顯著高于對照組的最大壽命，(8 d，圖3a)，平均壽命為6.75 d，明顯長于對照組(3.25 d，圖3b)。在0.2 mg/mL和0.5 mg/mL的濃度下，云芝水提物的抗氧化能力出現(xiàn)下降，平均壽命分別為4.90 d和5.15 d，但比對照組長(圖3b)。

圖3 云芝水提物對百草枯處理的秀麗線蟲壽命的影響

圖4 灰樹花水提物對百草枯處理的秀麗線蟲壽命的影響

2. 4 灰樹花水提物抗氧化活性

灰樹花水提物具有良好的抗氧化活性。濃度為1.0 mg/mL時(shí)，秀麗線蟲的抗氧化能力最強(qiáng)，最大壽命為13 d，顯著高于對照組的最大壽命(7 d，圖4a)，平均壽命為5.98 d，明顯長于對照組(2.72 d，圖3b)。0.5 mg/mL的濃度下，灰樹花水提物的抗氧化能力下降，平均壽命為4.88 d，比對照組長(圖3b)。水提物濃度為0.1 mg/mL時(shí)，無抗氧化活性，最大壽命和平均壽命分別為4 d和2.66 d，均低于對照組。

2.5 抗衰老活性評價(jià)

通過分析4種食藥用菌對秀麗線蟲壽命的影響，可反映其抗衰老活性。在樺褐孔菌、靈芝、云芝和灰樹花水提物最佳濃度下，線蟲的最大壽命分別為19 d、19 d、20 d和18 d，均延長了線蟲的壽命，平均壽命則分別為14.55 d、14.65 d、14.15 d和13.7 d(圖5a,b)。與對照組比較，除灰樹花無顯著性差異外，其余3種水提物均有明顯的差異。

圖5 4種食藥用菌水提物對正常培養(yǎng)的秀麗線蟲壽命的影響

3 小結(jié)與討論

利用秀麗線蟲對樺褐孔菌、靈芝、云芝和灰樹花的抗氧化活性進(jìn)行研究。因秀麗線蟲為活體模型，與體外自由基方法相比，評價(jià)結(jié)果更具參考價(jià)值。通過添加百草枯引起線蟲出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷，加速其死亡速度。這4種食藥用菌的水提物均能在很大程度上保護(hù)線蟲，延緩其死亡速率?；覙浠▽⑵骄鶋勖娱L了1.20倍，樺褐孔菌、靈芝和云芝分別延長了1.17倍、0.92倍和1.08倍?？梢?，灰樹花的抗氧化活性最強(qiáng)。但這一結(jié)果與抗衰老活性的結(jié)果不一致。這可能是由于衰老是一個更為復(fù)雜的長時(shí)間過程，受影響的因素眾多，而抗氧化只是延緩衰老其中一個因素[16]。利用果蠅為模型和體外試驗(yàn)分別證實(shí)樺褐孔菌菌絲體和子實(shí)體多糖具有抗氧化能力，與本文結(jié)果相一致[17-18]。本文以秀麗線蟲為生物模型分析食藥用菌的抗氧化活性，更直接有效地評價(jià)其抗氧化功能，為食藥用菌的開發(fā)提供有力的參考依據(jù)。

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Evaluation of Antioxidant Activities of Four Edible/Medicinal Mushroom Water Extracts Using Caenorhabditis elegans

Lin Qunying1, 2, Wu Liangliang1, 2, Zhang Fenglun1, Wu Suling1, Xiang Chunrong3, Sun Xiaoming1,2

( 1. Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants, Nanjing 210042, China; 2. Jiangsu Hongfeng Fruit and Vegetable Food Co., Ltd., Suqian 223700, China; 3. Zhenjiang City Dantu District Zhengdong Ecological Agriculture Development Center, Zhenjiang 212000, China)

Evaluation of antioxidant activities of four edible/medicinal mushroom water extracts was performed usingCaenorhabditiselegans. The results showed that the best concentration of water extact ofInonotusobliquuswas 0.2 mg/mL, with mean lifespan at 7.84 d, 1.17 folds longer than CK. The optimized concentrations were all at 1.0 mg/mL forGanodermalucidum,CoriolusversiclorandGrifolafrondosa. The mean lifespans were 8.84 d, 6.75 d and 5.98 d, respectively, 92%, 108% and 120% longer than CK. The findings could provide useful reference for further exploration of these mushrooms.

Inonotusobliquus;Ganodermalucidum;Coriolusversiclor;Grifolafrondosa; antioxidant

10.3969/j.issn.1006-9690.2016.06.004

2016-05-12

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013BAD16B07)。

林群英(1979―)，女，博士，副研究員，研究方向：食用菌栽培與應(yīng)用研究。E-mail: linqunying1007@126.com

*通訊作者： 孫曉明(1964―)，男，碩士，研究員，研究方向：食用菌栽培與深加工。E-mail: sunxm64@163.com

S759.81

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1006-9690(2016)06-0017-04