革胡子鯰MHC基因表達qPCR分析的引物設計與評估

李轉轉，王 妍，高金偉，王曉梅,通信作者，陳成勛，李 濤，莫寶霖

（1. 天津農(nóng)學院 水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2. 天津海友佳音生物科技股份有限公司，天津 300350；3. 天津農(nóng)學院 基礎科學學院，天津 300384）

革胡子鯰MHC基因表達qPCR分析的引物設計與評估

李轉轉1，王 妍2，高金偉1，王曉梅1,通信作者，陳成勛1，李 濤3，莫寶霖1

（1. 天津農(nóng)學院 水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2. 天津海友佳音生物科技股份有限公司，天津 300350；3. 天津農(nóng)學院 基礎科學學院，天津 300384）

為應用實時熒光定量PCR（qPCR）技術分析革胡子鯰主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）基因的表達譜，本研究利用Primer 5軟件設計擴增革胡子鯰MHC基因片段的引物并進行qPCR評估。結果顯示：引物MHCF1-MHCR3在qPCR擴增時，融解曲線為單一尖銳峰；標準曲線分析顯示：引物的擴增效率為99.3％，R2值為0.998。上述結果說明該對引物具有良好的擴增特異性和擴增效率，滿足了qPCR擴增的要求。本研究為革胡子鯰MHCⅠ基因表達的qPCR分析奠定了基礎。

革胡子鯰；主要組織相容性復合體；實時熒光定量PCR；融解曲線；擴增效率

主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）是由位于染色體上高度多態(tài)、緊密連鎖的基因位點組成；在機體的特異性免疫中發(fā)揮重要作用的基因家族[1-2]。魚類的MHC主要包括MHCⅠ和MHCⅡ兩類分子，分別負責內(nèi)源性和外源性抗原的加工和呈遞，與疾病的抗性和易感性密切相關[3-4]。自從1990年Hashimoto等[5]報道鯉魚MHCⅠ類和MHCⅡ的部分基因序列以來，數(shù)十種魚類的MHC的基因序列、基因結構或基因表達譜得到了廣泛研究[1-2,6-10]。

實時熒光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR，qPCR）是指在反應體系中加入熒光分子，分析和檢測反應過程中的累積擴增產(chǎn)物，其結果可以用于定性和定量分析[11]。實時熒光定量PCR常用的檢測模式有探針類和染料類兩種；探針類是指利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增子的拷貝數(shù)的變化，而染料類則是利用與雙鏈DNA小溝結合發(fā)光的理化特征來檢測擴增子拷貝數(shù)的變化；前者的的特異性強，而后者操作簡便易行、成本較低[12]。因此，在基因表達的qPCR分析中染料法使用居多。

革胡子鯰（Clarias gariepinus）屬鯰形目（Siluriformes）、胡鯰科（Clariidae）、胡鯰屬（Clarias）的魚類。由于該魚可高密度養(yǎng)殖、生長快、抗病力強、耐低氧、適應性強，自1981年從埃及引入我國后，已成為我國重要的淡水養(yǎng)殖品種之一。然而，目前有關革胡子鯰的研究主要集中于人工養(yǎng)殖[13-14]、養(yǎng)殖條件對生長性能和生理生化指標[15-18]和對器官組織學的影響[19]以及雜交育種[20-21]等方面，卻鮮見有關革胡子鯰高抗病力方面的基礎性研究。因此，本文應用適宜的分子生物學軟件和方法，擬獲得革胡子鯰MHC基因表達qPCR分析的相關引物，旨在為今后分析革胡子鯰MHC基因的表達譜、深入探討高密度養(yǎng)殖條件下革胡子鯰高抗病的機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗魚

試驗用魚10尾取自天津市德仁農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司水泥養(yǎng)殖池，養(yǎng)殖密度約為180 kg/m3，體長（34.80±3.00）cm，體重（395.99±71.59）g。經(jīng)200 mg/L MS-222 麻醉后，解剖取出其鰓、頭腎、肝胰臟、脾臟，液氮中迅速冷凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成

應用Trizol試劑（上海生工生物工程技術服務有限公司）提取革胡子鯰鰓、頭腎、肝胰臟和脾臟4種組織的總RNA。總RNA經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，超微量分光光度計（德國IMPLEN公司）分析其純度。應用RevertAidTMcDNA第一條鏈合成試劑盒合成cDNA第一條鏈?？俁NA的提取和cDNA第一條鏈的合成依據(jù)產(chǎn)品說明書進行。

1.3 引物的設計、常規(guī)PCR篩選及擴增子驗證

依據(jù)GenBank公布的革胡子鯰MHCⅠ的基因序列信息（GenBank檢索號：EU714321），應用Primer 5.0設計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

選取任意個體的鰓、頭腎、肝胰臟和脾臟的cDNA進行MHC基因片段的常規(guī)PCR擴增。擴增體系為25 μL，包括1×PCR Buffer，2 mmol/L Mg2＋，0.2 mmol/L dNTP，0.4 μmol/L 引物，1.5 UTaq酶，cDNA 1 μL。擴增條件為：94 ℃ 5 min的預變性后，94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，共33個循環(huán)，之后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％的瓊脂糖凝膠、5 V/cm的恒壓電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)（英國SYNGENE公司）觀察與拍照。

對得到的MHCⅠ基因的單一PCR擴增產(chǎn)物進行雙向測序（測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成），測序結果經(jīng)NCBI（http：// www.ncbi.nlm.nih.gov）BLAST程序在線對比驗證。

1.4 qPCR引物的設計與評估

依據(jù)本試驗獲得的MHC基因序列以及qPCR擴增的引物設計原則，應用Primer 5.0軟件設計用于基因qPCR分析的引物，經(jīng)過常規(guī)PCR檢測后，進行qPCR擴增。

qPCR擴增應用Iq SYBR Green Supermix試劑盒進行，擴增反應依據(jù)產(chǎn)品說明書進行。擴增體系如下：10 μL iQ SYBR Green Supermix預混液，上、下游引物（5 μmol/L）各1 μL，1 μL cDNA，7 μL PCR水；擴增循環(huán)采用兩步法，即95 ℃預變性3 min后，95 ℃ 5 s、一定溫度的退火、延伸30 s，共40個循環(huán)。

退火溫度的優(yōu)化：根據(jù)引物的Tm值，設置3個退火溫度，對MHC的基因片段進行qPCR擴增。每個反應為2個技術重復，同時進行融解分析，并設置陰性對照（用PCR水替代cDNA）。

標準曲線的建立：以cDNA原液為最高濃度，采用10倍稀釋法獲得5個不同濃度的cDNA模板進行qPCR擴增。每個反應為3個技術重復，同時分析其融解，并設置陰性對照（用PCR水替代cDNA）。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取及檢測結果

革胡子鯰鰓、頭腎、肝胰臟、脾臟4種組織的總RNA經(jīng)檢測顯示28S rRNA、18S rRNA條帶亮度比值在1～2之間（圖1），OD260/OD280均在1.8～2.0之間（結果未列出）。

圖1 革胡子鯰4種組織總RNA電泳分離結果（泳道1～4分別為鰓、頭腎、肝胰臟、脾臟的總RNA電泳圖譜）

2.2 引物的設計、常規(guī)PCR篩選及擴增子的驗證結果

依據(jù)GenBank檢索的革胡子鯰MHCⅠ的基因序列（EU714321），應用Primer 5.0設計引物得出的引物中，只有2對引物（表1）適宜進行PCR擴增。

表1 引物序列信息

以革胡子鯰鰓、頭腎、肝胰臟、脾臟的cDNA為模板，對表1顯示的2對引物進行常規(guī)PCR擴增篩選。圖2顯示：引物MHCF1-MHCR1的擴增產(chǎn)物僅有一個約為260 bp的擴增條帶（泳道1～4）；而引物MHCF2-MHCR2的擴增產(chǎn)物包含約為200 bp和450 bp的兩條擴增帶，根據(jù)引物設計的結果，450 bp左右的帶紋應為非特異性擴增條帶（泳道5～7）。

圖2 常規(guī)PCR擴增產(chǎn)物MHCⅠ1和MHCⅠ2的電泳結果（泳道M：DNA分子標量；1～4：鰓、頭腎、肝胰臟和脾臟的擴增產(chǎn)物MHCⅠ1；5～8：鰓、頭腎、肝胰臟和脾臟的擴增產(chǎn)物MHCⅠ2）

對擴增后獲得的單一產(chǎn)物MHCⅠ1進行測序，其序列包含引物為254 bp。該序列進行GenBank BLAST比對，結果顯示：MHCⅠ1與已報道革胡子鯰MHCⅠ的cDNA序列（序列號：EU714321.1）一致性為99％（圖3）。

圖3 MHCⅠ1基因片段序列GenBank BLAST對比結果（BLAST比對網(wǎng)頁截圖）

2.3 qPCR引物的設計與評估結果

2.3.1 qPCR引物的設計

盡管引物MHCF1-MHCR1的常規(guī)PCR具有擴增特異性，且擴增子的序列經(jīng)GenBank在線比對為革胡子鯰MHCⅠ基因片段序列，但擴增子大小為254 bp，所以該對引物并非qPCR擴增的優(yōu)良引物。因此，根據(jù)本試驗得到的254 bp的MHCⅠ基因序列，設計并得到1對擬用于qPCR擴增的引物：MHCF1-MHCR3（表2）。通過對該對引物的常規(guī)PCR擴增，其擴增產(chǎn)物（MHCⅠ3）為單一條帶（圖4），大小與理論值相符，測序為137 bp。

表2 擬用于qPCR擴增的引物序列信息

圖4 擴增產(chǎn)物MHCⅠ3的電泳結果（泳道M：DNA分子量標準；1～4：鰓、頭腎、肝胰臟、脾臟的擴增產(chǎn)物MHCⅠ3）

2.3.2 引物的qPCR評估

根據(jù)引物MHCF1-MHCR3的Tm值，設置57、60和63 ℃ 3個退火溫度進行qPCR擴增。3個退火溫度下每個qPCR反應的融解均為一個尖銳峰（結果未顯示）。表3中的數(shù)據(jù)顯示了該對引物在3個退火溫度下進行qPCR擴增的Ct值，其中以退火溫度為60 ℃時的Ct值最小。

表3 引物MHCF1-MHCR3在不同退火溫度下進行qPCR擴增時得到的Ct值

采用60 ℃為退火溫度，應用引物MHCF1-MHCR3對系列稀釋cDNA樣本進行qPCR擴增。結果顯示：在指數(shù)擴增區(qū)相鄰的擴增曲線間隔相似（圖5A）、每個反應的融解曲線為單一尖銳峰（圖5B）、從標準曲線得出引物的擴增效率為99.3％，標準曲線的相關系數(shù)R2值為0.998（圖5C）。

圖5 引物MHCF1-MHCR3 qPCR的擴增曲線（A）、融解曲線（B）和標準曲線（C）

3 討論

RNA完整性和純度是影響qPCR擴增最基本的因素。若使用有其他物質(zhì)污染或降解的RNA樣本進行qPCR擴增，會產(chǎn)生數(shù)據(jù)的偏離或不穩(wěn)定的數(shù)據(jù)[22]?？俁NA樣本的28S/18S rRNA的條帶亮度比值在1～2之間表示完整性好，而OD260/OD280在1.8～2.0之間表示RNA樣本純度高，沒有蛋白和酚的污染。本試驗提取的革胡子鯰鰓、頭腎、肝胰臟和脾臟4種組織的總RNA樣本經(jīng)檢測滿足上述條件，因此保證了本試驗中qPCR結果的可靠性。

引物序列對qPCR擴增的特異性和擴增效率至關重要。PCR擴增的引物一般應遵循以下原則：GC含量為50％～60％，Tm值為50～65 ℃，引物自身和引物間不應存在互補序列，從而避免產(chǎn)生發(fā)夾結構和引物二聚體；而對于qPCR擴增還要求擴增子的長度最好在75～200 bp之間，片段越長擴增效率越低[11]。本研究基于GenBank公布的革胡子鯰MHCⅠ基因546 bp的序列（EU714321），僅得到2對分值高的引物，即：MHCF1-MHCR1和MHCF2-MHCR2，擴增子大小的理論值分別為255 bp和189 bp。在常規(guī)PCR中，引物MHCF1-MHCR1的擴增子大小為260 bp左右，與理論值相符且擴增產(chǎn)物無雜帶；而引物MHCF2-MHCR2的擴增產(chǎn)物除了包含有目的條帶外，還有一條約450 bp的非特異條帶，表明其擴增的特異性差，應將其舍棄。前者擴增的特異性雖強，但其擴增子的大小不符合qPCR擴增的最佳要求。因此，本研究對引物MHCF1-MHCR1擴增的260 bp產(chǎn)物測序，基于該測序結果進一步設計出擬用于qPCR試驗的引物：MHCF1-MHCR3，擴增子大小的理論值為137 bp。該對引物常規(guī)PCR結果顯示擴增產(chǎn)物的電泳條帶單一，且擴增子大小與理論值一致。因此對引物MHCF1-MHCR3進行了qPCR的進一步評估。

在qPCR擴增時，每次均應設置陰性對照且無擴增信號；所有的擴增樣本都應有2～3個技術重復，同時技術重復樣本的Ct值的標準差應＜0.5，否則應對樣本重新進行qPCR擴增[11]。本試驗中的陰性對照均無擴增信號，qPCR擴增樣本的2個重復（退火溫度優(yōu)化）或3個重復（標準曲線的建立）中，重復樣本的Ct值的標準差在0.056～0.397之間（本文僅顯示了退火溫度優(yōu)化的重復樣本的Ct值的標準差），說明本試驗結果的可靠性。

退火溫度的高低影響引物與目標序列的退火，不適宜的退火溫度可導致非特異性擴增和引物二聚體的形成，因此在qPCR試驗中要進行退火溫度的優(yōu)化。引物擴增的特異性是qPCR分析成敗的關鍵，因此在進行退火溫度優(yōu)化的同時要進行融解分析，判斷引物擴增的特異性。融解曲線若為單一尖銳峰則表明引物的qPCR擴增為特異性反應；相反，如果在融解曲線上不只有一個波峰則表明有非特異性的反應，應淘汰該引物[11,22-23]。本試驗根據(jù)引物的Tm值，設定3個溫度進行qPCR退火溫度的優(yōu)化。結果顯示：在退火溫度優(yōu)化的試驗中，每個qPCR擴增反應的融解曲線均為單一尖銳峰，說明引物的特異性強。此外，根據(jù)qPCR擴增的原則，應選擇Ct值最小的退火溫度進行后續(xù)的qPCR分析。本試驗中退火溫度為60 ℃時，qPCR擴增的Ct值最小，故選擇60 ℃作為退火溫度對引物進行擴增效率的檢測。

引物除了具有擴增特異性外還應具有良好的擴增效率，才能最終用于試驗樣本的qPCR分析。qPCR的擴增效率一般通過建立標準曲線來確定，而標準曲線可通過對一系列倍比稀釋的cDNA模板進行qPCR而得出。優(yōu)良的qPCR引物，對系列稀釋cDNA模板產(chǎn)生的擴增曲線應間隔均勻、擴增效率在90％～105％之間、標準曲線的決定系數(shù)（R2）＞0.980[11,22]。本試驗結果顯示引物MHCF1-MHCR3對系列稀釋樣本的擴增曲線的間隔相似、擴增效率為99.3％、標準曲線的R2值為0.998；同時，所有qPCR反應的融解曲線均為單一尖銳峰。

上述對引物MHCF1-MHCR3的退火溫度優(yōu)化和標準曲線建立的試驗結果表明該對引物可以用于樣本的qPCR分析。這一研究為今后革胡子鯰MHC基因的定量表達分析以及進一步探討高密度養(yǎng)殖條件下革胡子鯰高抗病的機理奠定了基礎。

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Design and Evaluation of Primers for Analysis on MHC Gene Expression Profiles ofClarias gariepinusby Using Real-Time Quantitative PCR Technique

LI Zhuan-zhuan1, WANG Yan2, GAO Jin-wei1, WANG Xiao-mei1,CorrespondingAuthor, CHEN Cheng-xun1, LI Tao3, MO Bao-lin1
（1. Tianjin Key Laboratory of Aqua-Ecology and Aquaculture, College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China; 2. Tianjin Ocean Pal Carol Biotech CO, Ltd, Tianjin 300350, China; 3. College of Basic Science, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to analyze the MHC gene expression profiles inClarias gariepinusby using real-time quantitative PCR（qPCR）technique, primer pairs for amplifying the MHC gene fragments ofC. gariepinuswere designed using Primer 5.0 software and then assessed by means of general PCR and qPCR amplification, respectively. The results of qPCR evaluation showed that melt curve of the primer pair named MHCF1-MHCR3presented a single sharp peak, and standard curve displayed that its amplification efficiency was 99.3％ andR2value was 0.998. The results indicated that the primer pair had good specificity and efficiency of amplification as well as met the criteria of qPCR amplification. This work laid a foundation for analyzing MHC gene expression ofC. gariepinusby using qPCR technique.

Clarias gariepinus; major histocompatibility complex; real-time fluorescence quantitative PCR; melt peak; amplification efficiency

S965.128

A

1008-5394（2016）04-0033-05

2016-03-23

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃（重點項目）“革胡子鯰抗菌肽提取與鑒別及非特異免疫因子的分子解析”（15JCZDJC33500）；天津農(nóng)學院中青年骨干創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃“漁業(yè)資源利用與生態(tài)修復”（無編號）

李轉轉（1992-），女，山西呂梁人，本科在讀，主要從事水產(chǎn)動物分子生物學的研究。E-mail：1297036725@qq.com。

王曉梅（1962-），女，天津市人，教授，博士，主要從事水產(chǎn)動物分子生物學的研究。E-mail：xiaomeiw@tjau.edu.cn。