牛蒡子中牛蒡苷的超聲提取工藝優(yōu)化研究

劉 稱，王英超，金 紅，馬曉雨，史雪艷

（1. 天津農學院 a. 農學與資源環(huán)境學院，b. 基礎科學學院，天津 300384）

牛蒡子中牛蒡苷的超聲提取工藝優(yōu)化研究

劉 稱1a，王英超1b,通信作者，金 紅1a，馬曉雨1a，史雪艷1a

（1. 天津農學院 a. 農學與資源環(huán)境學院，b. 基礎科學學院，天津 300384）

利用超聲法對牛蒡苷最佳提取條件進行優(yōu)化研究。考察超聲功率、超聲時間、超聲溫度、料液比等因素對牛蒡苷提取率的影響，并采用正交試驗優(yōu)化提取條件。結果表明：粒徑為100目、提取溶劑為95％乙醇、預浸泡時間2 h、料液比1∶150（g∶mL）、超聲時間45 min、超聲功率114 W、超聲溫度70 ℃為最佳提取條件。在最佳提取條件下，進行了3組平行驗證試驗，牛蒡苷的平均提取率為12.69％。與其他超聲提取工藝相比，牛蒡苷提取率至少提高1.89％。

牛蒡子；牛蒡苷；含量測定

牛蒡子（Arctium lappaL．）為菊科植物牛蒡的干燥成熟果實[1]。牛蒡苷為牛蒡子的主要有效成分[2-5]，具有免疫調節(jié)、抗菌、抗病毒等多種生理功能[6]。常見牛蒡苷的提取方法有加熱回流法[7]、超臨界萃取法[8]。加熱回流法的提取時間一般較長，提取效率低；而超臨界萃取法須將極性較大的牛蒡苷水解為極性較小的牛蒡苷元才能提取的較為完全，提取步驟比較繁瑣。超聲波作為一種有效的提取技術，具有簡單、高效、低成本的特點，越來越多的應用于天然產物的提取中。

關于牛蒡苷超聲提取工藝研究報道較少，僅見武娟霞等[9]和吳楊等[10]利用超聲工藝提取牛蒡苷的研究。武娟霞等利用超聲法提取牛蒡子中牛蒡苷和牛蒡苷元，考察了超聲功率、液固比、提取時間、提取溫度等因素對牛蒡苷及牛蒡苷元提取率的影響，得到牛蒡苷的提取率為9.24％。吳楊等采用正交試驗的方法，對牛蒡子的超聲提取工藝進行優(yōu)化。選擇乙醇濃度、乙醇倍數(shù)、提取時間和粉碎粒度4個因素，采用L9（34）進行正交試驗，所得牛蒡苷的提取率為10.8％。上述提取工藝所得牛蒡苷提取率較少，小于11％，且研究多集中在對超聲的參數(shù)設置上，對于原材料牛蒡子的篩選及用提取溶劑預浸泡牛蒡子粉末未見文獻報道。筆者在前人研究的基礎上，利用超聲法提取牛蒡苷，通過前期對牛蒡子篩選除雜及用提取溶劑預浸泡牛蒡子粉末，增加與溶劑的接觸時間，并考察超聲功率、溫度等因素對牛蒡苷提取率的影響，以期得到較高提取率的牛蒡苷提取工藝，為牛蒡苷在食品及藥品方面的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

牛蒡子：購自甘肅省隴西。挑選外觀整齊一致，顆粒飽滿的牛蒡子，水洗除去泥土等雜質，60 ℃烘干4 h，備用。

1.2 試劑

95％乙醇（分析純）、無水乙醇（分析純）購自天津市風船化學試劑科技有限公司；甲醇（色譜純）購自Fisher Scientific；乙酸乙酯、丙酮購自天津市江天化工技術有限公司；牛蒡苷標準品（純度＞96％）購自中國食品藥品檢定研究院（批號：110819-201510）。

1.3 儀器與設備

1200 Series Agilent 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；FA-2004電子天平（上海方瑞儀器有限公司）；Milli-Q Advantage A10超純水儀（美國密理博（中國）有限公司）；Elmasonic P超聲波清洗器（380 W，德國艾爾瑪公司）；L550低速離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 粉碎粒徑對牛蒡苷提取率的影響

選取40、60、80、100、120目的牛蒡子粉末各0.2 g，按料液比1∶150（g∶mL）加甲醇30 mL于50 mL三角瓶中，304 W超聲提取20 min。待提取結束后，4 000 r/min 離心5 min。上清液過0.22 μm有機濾膜，濾出液作為高效液相色譜儀進樣樣品使用。以牛蒡苷的提取率為評價指標，探討不同粉碎粒徑對牛蒡苷提取率的影響。牛蒡苷的提取率（％）＝樣品中牛蒡苷的含量（mg/mL）×提取液總體積（mL）×100÷取樣量（g）÷1 000。

1.4.2 溶劑對牛蒡苷提取率的影響

選取100目的牛蒡子0.2 g，按料液比1∶150分別加入甲醇、無水乙醇、95％乙醇、乙酸乙酯、丙酮于各個三角瓶中進行超聲提取，功率304 W，時間35 min。后續(xù)操作按照1.4.1中的方法進行，探討不同的提取溶劑對牛蒡苷提取率的影響。

1.4.3 預浸泡時間對牛蒡苷提取率的影響

選取100目的牛蒡子粉末0.2 g，按料液比1∶150加入30 mL 95％乙醇，按照預浸泡時間0、2、4、6、12、24 h對牛蒡子粉末進行處理。待預浸泡相應時間后，304 W功率下超聲35 min，后續(xù)操作按照1.4.1中的方法進行，探討不同的預浸泡時間對牛蒡苷提取率的影響。

1.4.4 超聲時間對牛蒡苷提取率的影響

選取100目的牛蒡子粉末0.2 g，按料液比1∶150加入30 mL 95％乙醇，預浸泡時間2 h，304 W功率下分別超聲15、25、35、45、55 min，后續(xù)操作按照1.4.1中的方法進行，探討不同的超聲時間對牛蒡苷提取率的影響。

1.4.5 超聲溫度對牛蒡苷提取率的影響

選取100目的牛蒡子粉末0.2 g，按料液比1∶150加入30 mL 95％乙醇，預浸泡時間2 h，304 W功率下分別在40、50、60、70、80 ℃下超聲35 min，后續(xù)操作按照1.4.1中的方法進行，探討不同的溫度對提取牛蒡苷率的影響。

1.4.6 超聲功率對牛蒡苷提取率的影響

選取100目的牛蒡子粉末0.2 g，按料液比1∶150加入30 mL 95％乙醇，預浸泡時間2 h，溫度70 ℃。超聲功率按照最大功率380 W的30％、40％、50％、60％、70％即114、152、190、228、266 W下超聲35 min，后續(xù)操作按照1.4.1中的方法進行，探討不同的超聲功率對牛蒡苷提取率的影響。

1.4.7 料液比對牛蒡苷提取率的影響

選取100目的牛蒡子粉末，按照料液比1∶300、1∶150、1∶50、1∶30、1∶20加入95％乙醇，預浸泡時間2 h，溫度70 ℃，超聲功率152 W功率下超聲35 min，后續(xù)操作按照1.4.1中的方法進行，探討不同料液比對牛蒡苷提取率的影響。

1.4.8 色譜條件

分離柱：Agilent XDB-C18（4.6 mm×50 mm，1.6 μm）；流動相：甲醇-水（V甲醇:V水＝1:1.1）；流速：0.5 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：5 μL。

1.4.9 牛蒡苷標準曲線的制作

將1.5 mg/mL的牛蒡苷標準品稀釋成濃度為0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 mg/mL，按照其上述色譜條件進行試驗，以峰面積為縱坐標，牛蒡苷的濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.4.10 正交試驗

以單因素試驗為基礎，選擇超聲溫度、功率、料液比、超聲時間4因素，進行4因素3水平正交試驗設計，見表1。

表1 4因素3水平正交試驗設計

1.4.11 數(shù)據統(tǒng)計分析

采用Excel 2003和SPSS13.0軟件進行數(shù)據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 牛蒡苷標準曲線

牛蒡苷標準曲線見圖1。從圖1可以看出，牛蒡苷標準曲線方程：y＝ 1 714.8x＋25.031，R2＝0.999 1。y代表峰面積，x代表牛蒡苷濃度（mg/mL）。

圖1 牛蒡苷標準曲線

2.2 牛蒡苷標準品及樣品液相色譜圖

牛蒡苷標準品液相色譜圖及樣品色譜圖分別見圖2和圖3。從圖2看出，0.5 mg/mL牛蒡苷標準品的保留時間在2.904 min，其他峰為未知樣品。樣品超聲提取后，4 000 r / min離心10 min，取上清液定容至10 mL，經0.22 μm有機濾膜過濾后，取10 μL上樣。從圖3可以看出，樣品中牛蒡苷的保留時間在2.886 min，牛蒡苷的特征吸收波長為280 nm。本試驗色譜條件采用武娟霞等[9]的方法進行，在此條件下進行色譜分析，得到牛蒡苷的峰形對稱性良好，基線平穩(wěn)，與雜質峰分離良好，無雜峰干擾，方法可行。

圖2 牛蒡苷標準品液相色譜圖

圖3 樣品液相色譜圖

2.3 不同粉碎粒徑對牛蒡苷提取率的影響

不同粉碎粒徑對牛蒡苷提取率的影響見圖4。由圖4可知，牛蒡苷的提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。粉碎粒徑為100目時，牛蒡苷的提取率最大，為11.40％。40、60和80目的牛蒡子因為粒徑較大，牛蒡苷不易提取完全；牛蒡子粒徑過小，表面積增加，可能吸附了一部分牛蒡苷[11]，導致提取率降低，所以選擇粉碎粒徑為100目。

圖4 不同粉碎粒徑對牛蒡苷提取率的影響

2.4 不同的溶劑對牛蒡苷提取率的影響

不同的溶劑對牛蒡苷提取率的影響見圖5。由圖5可知，牛蒡苷的提取率大小為95％乙醇、丙酮、無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯。丙酮、甲醇由于具有一定的毒性，不能作為牛蒡苷提取的溶劑。無水乙醇和95％乙醇下牛蒡苷的提取率均較高，且提取劑安全無毒。牛蒡苷用極性較大的高濃度的乙醇進行提取時提取率較高[9,12]，這與本試驗結果相一致。綜上，選擇95％乙醇作為牛蒡苷提取溶劑。

圖5 不同的溶劑對牛蒡苷提取率的影響

2.5 預浸泡時間對牛蒡苷提取率的影響

預浸泡時間對牛蒡苷提取率的影響見圖6。由圖6可知，預浸泡時間2 h時牛蒡苷的提取率最大，為12.21％。隨著時間的延長，牛蒡苷的提取率變化不大。未浸泡的牛蒡子中牛蒡苷提取率較小。適當?shù)慕輹r間能夠促使牛蒡苷更多的溶解到提取溶劑中。而浸泡時間過長，牛蒡子中的牛蒡苷提取率與浸泡2 h相比，差異不大。因此，綜合考慮能源、效率等因素，選擇為預浸泡時間2 h。

圖6 預浸泡時間對牛蒡苷提取率的影響

2.6 超聲時間對牛蒡苷提取率的影響

超聲時間對牛蒡苷提取率的影響見圖7。由圖7可知，超聲時間為35 min時，牛蒡苷的提取率最大，為12.59％。超過35min后，牛蒡苷的提取率下降至8.54％。這是由于超聲時間較短，牛蒡苷未被完全提取。超聲時間過長，由于超聲波的熱效應，容易引起部分內酯鍵的破壞[13]，且能耗增加。所以最佳超聲時間為35 min。

圖7 超聲時間對牛蒡苷提取率的影響

2.7 超聲溫度對牛蒡苷提取率的影響

超聲溫度對牛蒡苷提取率的影響見圖8。由圖8可知，牛蒡苷提取率隨溫度升高而增加，當溫度達到70 ℃時，提取率最大，達到12.61％，80 ℃時提取率下降至11.1％。溫度太高，提取溶劑易揮發(fā)，降低提取效率，因此選擇超聲溫度為70 ℃。

圖8 超聲溫度對牛蒡苷提取率的影響

2.8 超聲功率對牛蒡苷提取率的影響

超聲功率對牛蒡苷提取率的影響見圖9。由圖9可知，超聲功率在152 W時，牛蒡苷的提取率達到最大11.66％。隨著超聲功率增加，牛蒡子中牛蒡苷的提取率有所下降，這可能是因為超聲功率過大，熱效應增強，牛蒡苷的內酯鍵易遭破壞[13]，所以最佳超聲功率為152 W。

圖9 超聲功率對牛蒡苷提取率的影響

2.9 料液比對牛蒡苷提取率的影響

料液比對牛蒡苷提取率的影響見圖10。由圖10可知，隨著料液比的增加，牛蒡苷的提取率在料液比1∶150時達到最大值，為10.16％，之后降低。主要是因為前期溶劑量越大，有效成分浸出越完全，提取率也就越大。但當溶劑過大時，超聲能量對沉滯在底層的牛蒡子顆粒的機械效應的強度減弱，從而影響超聲提取的效果，同時會造成溶劑和能源的浪費，并給后序的濃縮工作帶來困難，造成牛蒡苷的提取率減少[13]，所以選擇1∶150為最佳料液比。

圖10 不同的料液比對牛蒡苷提取率的影響

2.10 正交試驗法優(yōu)化試驗

在前期單因素試驗結果的基礎上，通過正交試驗設計優(yōu)化超聲波提取牛蒡苷工藝條件。選擇超聲溫度、功率、料液比和時間4因素做正交試驗，結果見表2。由表2中極差分析可知，對牛蒡苷提取率的影響因素從大到小依次為超聲溫度、料液比、超聲功率、超聲時間。說明超聲溫度對牛蒡苷提取率的影響最大，是主要因素。其次是料液比、功率和時間。提取條件的優(yōu)化組合為A2B1C2D3，最佳提取條件為超聲溫度70 ℃、超聲功率114 W、料液比1∶150（g∶mL）和超聲時間45 min。在此提取條件下進行3組平行驗證試驗，得出平均提取率為12.69％。

表2 4因素3水平正交試驗結果

3 討論與結論

市售牛蒡子質量不一，多含有小石子、土塊、殘存的葉片等雜質，在試驗前必須進行篩選除雜，否則影響牛蒡苷的提取率。本研究在試驗前期，對牛蒡子進行水洗、除雜，去除了一些不成熟的牛蒡子和小石子等雜質，確保了試驗結果的準確性。采用一定粒度的牛蒡子粉末在超聲前進行預浸泡處理，增加了牛蒡子粉末與溶劑的接觸時間，浸泡后再進行超聲處理，能夠顯著增加牛蒡苷的提取率。預浸泡不消耗能源，是一種能夠有效增加提取物含量的一種處理方式。經過優(yōu)化處理，牛蒡苷最佳提取工藝條件為提取溶劑為95％乙醇、預浸泡時間2 h、料液比1∶150（g∶mL）、超聲時間45 min、超聲功率152 W、超聲溫度70 ℃。在最佳提取條件下進行了3組平行驗證試驗，得到牛蒡苷的平均提取率為12.69％，高于武娟霞等[9]和吳楊等[10]利用超聲工藝提取牛蒡苷提取率。

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Study on the Extraction Conditions of Arctiin in Ultrasonic Method

LIU Chen1a，WANG Ying-chao1b,ConespondingAuthor，JIN Hong1a，MA Xiao-yu1a，SHI Xue-yan1a
（1. Tianjin Agricultural University，a. College of Agronomy and Resource Environment，b. College of Basic Science，Tianjin 300384，China）

The optimal extraction condition of arctiin was studied by ultrasonic method. The newly fresh seed of theArctium lappawas used to investigate the effects of the ultrasonic power, ultrasonic time, ultrasonic temperature, solid-liquid ratio and other factors on the extraction rate of arctiin. Orthogonal experiment was performed to optimize the extraction conditions. The results showed that the crush size was 100 mesh, extraction solvent was 95％ ethanol, pre-soaking time was 2 h, material liquid ratio was 1∶150 (g∶mL), ultrasonic time was 45 min, ultrasonic power was 114 W, ultrasonic temperature was 70 ℃ as the optimum extraction conditions. The three parallel tests were carried out under the optimum extraction conditions, the average extraction rate obtained for arctiin was 12.69％ . Compared with other ultrasonic extraction process, arctiin yield was increased at least 1.89％.

the seeds of theArctium lappa; arctiin; content determination

R284.2

A

1008-5394（2016）04-0028-05

2016-03-11

天津市大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目“牛蒡子中牛蒡子苷的提取方法比較、優(yōu)化及其利用”（20151006105）；天津市科技支撐項目“棗活性成分功效研究及產品開發(fā)”（11ZCKFNC01600）

劉稱（1993-），女，天津市人，本科在讀，主要從事生物分離與提取研究。E-mail：376147823@qq.com。

王英超（1981-），女，天津市人，實驗師，碩士，主要從事生物化學實驗教學與生物分離方面的研究。E-mail：shibiology@163.com。