李雪芬,杜 斌,丁 軻,韓 濤
(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京 102206)
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金屬螯合肽分離純化及其抗氧化活性的研究進(jìn)展
李雪芬,杜斌,丁軻,韓濤
(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,北京102206)
摘要:綜述了金屬螯合肽的來源、分離純化及構(gòu)效關(guān)系,分析了金屬螯合肽抗氧化活性的相關(guān)研究進(jìn)展,并展望了金屬螯合肽的發(fā)展前景。
關(guān)鍵詞:金屬螯合肽;分離純化;構(gòu)效關(guān)系;抗氧化活性
近年來,金屬螯合肽引起科學(xué)家的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),在多種微生物、動物和植物細(xì)胞內(nèi)普遍存在對金屬離子具有親和能力的多肽或蛋白質(zhì),它們可與環(huán)境中的金屬離子通過化學(xué)結(jié)合作用形成復(fù)合物而降低、富集或消除金屬離子對生物細(xì)胞的毒性[1]。金屬螯合肽具有多種功能,它與金屬離子形成的螯合物能夠通過肽的吸收途徑轉(zhuǎn)運(yùn)吸收,避免與氨基酸之間的競爭,促進(jìn)機(jī)體對所需礦物元素的吸收[2],同時還因為能夠與鐵離子、銅離子的結(jié)合從而阻斷自由基的生成,實現(xiàn)其抗氧化活性。
金屬螯合肽的食品蛋白來源較廣泛,迄今為止,人們已經(jīng)從多種食品蛋白中分離和鑒定出了金屬螯合肽。例如來自于牛奶蛋白的酪蛋白磷酸肽(CPPs)[3],來源于芝麻蛋白的鋅螯合肽[4],從鷹嘴豆蛋白[5]及向日葵種子中[6]分離純化得到的銅螯合肽等。另外來自大豆[7]、鳳尾魚[8]、豬血漿[9]、鱈魚皮[10]、福吉魚[11]、羅非魚[12]、牡蠣[13]、螺旋藻[14]、肉的肌肉組織[15]以及蝦[16]的金屬螯合肽都有報道。
目前,有關(guān)金屬螯合肽的研究多集中在從食物源中將其制備的工藝優(yōu)化及進(jìn)一步的分離純化上,關(guān)于金屬螯合肽與金屬離子結(jié)合的構(gòu)效關(guān)系及其抗氧化活性的研究也正在逐漸深入。本文對目前金屬螯合肽的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期為金屬螯合肽的未來應(yīng)用和深入研究提供參考。
1金屬螯合肽的制備及分離純化
1.1金屬螯合肽的制備
金屬螯合肽的初步制備主要是通過物理、化學(xué)等方法將蛋白分解成多肽。由于酶解法具有條件溫和、安全性高、成本低、水解過程易控制等優(yōu)點(diǎn),逐漸成為金屬螯合肽初期制備的主要方法[17]。目前,關(guān)于酶解法制備金屬螯合肽的研究主要集中在酶的篩選及酶解工藝的優(yōu)化上。例如,汪嬋等[4]利用單因素法,以酶解產(chǎn)物的金屬螯合率為指標(biāo),從木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、Alacalse三種酶中篩選得到了胰蛋白酶為從芝麻蛋白中制備金屬螯合肽的最佳蛋白酶,并進(jìn)一步優(yōu)化了酶解工藝,確定了酶解工藝條件最佳條件為:底物質(zhì)量濃度5%(g/mL)、酶添加濃度20μ/g(底物)、水解時間5h,此時得到的酶解產(chǎn)物金屬螯合率最強(qiáng)。張墨楠[18]以低植酸大豆分離蛋白為原料,以水解物的亞鐵螯合率及水解度為指標(biāo),篩選得到了胰蛋白酶為制備鐵螯合肽的最佳酶。王曉萍[19]從小麥胚芽中制取鋅螯合肽時,發(fā)現(xiàn)Alcalse FG 2.4L 酶解得到小麥胚芽蛋白水解物的水解度及金屬螯合率較Flavourzyme 500MG和Papain酶解得到的酶解產(chǎn)物的高。牟雪姣等[20]以玉米蛋白粉為材料制備鋅螯合肽,通過單因素試驗,確定水解物的制備方法為木瓜蛋白酶結(jié)合中性蛋白酶法,pH值8.0。由于原料不同,其氨基酸的構(gòu)成及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)都會存在一定的差異,加上所需螯合的金屬離子也不同,所以不同金屬螯合肽酶解所需要的最適酶及酶解工藝都會存在一定的差異。
1.2金屬螯合肽的分離純化
為了得到純度更高的金屬螯合肽,還需要將酶解得到的酶解產(chǎn)物進(jìn)一步分離純化。目前金屬螯合肽主要是通過一系列連續(xù)的色譜分離方法將金屬螯合肽從蛋白酶解產(chǎn)物中純化出來。目前常用的分離方法有:固定化金屬親和色譜法(IMAC)、凝膠過濾色譜法(GFC)、離子交換色譜法(IEC)和反相高效液相色譜法(RP-HPLC)等[21]。
IMAC的高選擇性使其成為一種很好的蛋白質(zhì)和多肽純化技術(shù),可以將金屬離子螯合能力不同的肽段分開,廣泛用于肽段的分離。IMAC具有溫和的、非變性的洗脫條件,表現(xiàn)出了高結(jié)合能力和高修復(fù)特性[22-24]。IMAC通常用于金屬螯合肽純化的第一階段。呂瑩等[25]利用鐵離子螯合親和層析分離了具有不同鐵結(jié)合能力的核桃肽,并對它們的抗氧化活性進(jìn)行了測定,探究了其鐵結(jié)合能力與抗氧化活性之間的關(guān)系。Megías等[3]利用銅螯合柱分離得到了鷹嘴豆銅螯合肽。Wang等[26]用IMAC和RP-HPLC從芝麻酶解液中純化出了6個鋅螯合肽。Guo等[10]采用Fe3+-IMAC從鱈魚皮的水解液中成功分離鑒定了鐵螯合肽。
GFC又叫分子排阻色譜(SEC),它是利用分子篩原理,將物質(zhì)按相對分子質(zhì)量的大小進(jìn)行分離的一種方法。IEC是根據(jù)物質(zhì)的帶電性質(zhì)及帶電數(shù)量的差別對待分離物質(zhì)進(jìn)行分離的一種色譜技術(shù)。這兩種方法一般用于肽純化的中間階段。
RP-HPLC通常用于金屬螯合肽的最后純化階段,是多肽類快速分離純化的有效手段,具有分離株效高、選擇性好的優(yōu)點(diǎn)[27]。經(jīng)RP-HPLC分離純化得到的組分,可直接進(jìn)行氨基酸組成及肽結(jié)構(gòu)的測定。RP-HPLC利用非極性的反相介質(zhì)為固定相,極性有機(jī)溶劑(甲醇、乙腈等)或水溶液作流動相,根據(jù)流動相中被分離溶質(zhì)極性(疏水性)的差別,使其在兩相中分配不同,進(jìn)行分離純化的色譜,其分辨力強(qiáng),流動相價格低廉[29],在金屬螯合肽分離純化中的應(yīng)用十分普遍。Huang等[29]利用IEC、GFC從蝦的副產(chǎn)物中純化得到了鐵螯合肽,通過RP-HPLC進(jìn)一步純化將其分離為4個組分。此外他們還利用此類方法,從蝦的副產(chǎn)物中純化出1個序列為Thr-Cys-His的鈣螯合肽[15]。Lee和Song[9]依次采用GFC、IEC和RP-HPLC方法從豬血蛋白中純化了1個螯合鐵納米肽。
2金屬螯合肽的結(jié)構(gòu)鑒定及氨基酸組成分析
為了分析金屬螯合肽與金屬離子的螯合機(jī)制、找到各種食物源金屬螯合肽的共性,需要將經(jīng)過RP-HPLC分離純化后的金屬螯合肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)及氨基酸組成的分析。
2.1金屬螯合肽構(gòu)效分析的常用方法
目前,鑒定分析金屬螯合肽結(jié)構(gòu)及氨基酸組成的常用方法有:質(zhì)譜分析(MS)、核磁共振(NMR)、紫外-可見吸收光譜(UV-vis)、傅里葉紅外光譜(FTIR)、圓二色譜(CD)、X-衍射(XRD)等[30]。
MS主要用于蛋白質(zhì)和多肽的一級結(jié)構(gòu)包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置,具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、易操作等優(yōu)點(diǎn)[31]。目前用于研究較多的主要有電噴霧離子化質(zhì)譜(EIS)、基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)。NMR 主要用于分析分子中含少于30個氨基酸的小肽,可以檢測小肽的優(yōu)勢構(gòu)象及較大肽中少量的二級結(jié)構(gòu)[32]。UV-vis可評估肽-金屬螯合物的形成和結(jié)構(gòu)變化[33]。紅外吸收光譜也是研究螯合物特征的重要方法,可以用來分析基團(tuán)參與配位的情況及蛋白質(zhì)側(cè)鏈情況,以此來闡明蛋白質(zhì)與金屬離子的作用機(jī)制[34,35]。CD能夠測定分子結(jié)構(gòu)的不對稱性,常用來研究螯合肽結(jié)合金屬離子過程中的結(jié)構(gòu)變化[36]。通常對一種金屬螯合肽的結(jié)構(gòu)分析需要用到幾種以上的分析方法。Wang 等[37]用MS和電噴霧電離對酪蛋白磷酸肽與鋅離子的螯合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)肽與鋅離子的螯合會受到酪蛋白磷酸化的影響。Lee 等[39]利用LC /ESI 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)確定了從豬血血漿蛋白水解物中得到的亞鐵螯合肽的氨基酸序列。
2.2金屬螯合肽的構(gòu)效關(guān)系
目前的研究表明,金屬螯合肽的螯合能力主要與肽的一些結(jié)構(gòu)特征有關(guān),例如肽的分子量、氨基酸組成和序列、以及特殊的氨基酸基團(tuán)等。
2.2.1分子大小
研究發(fā)現(xiàn),肽的分子量對肽與金屬離子的螯合有十分重要的影響,低分子量(<500 Da)的肽具有不錯的金屬螯合活性。例如,Torres-Fuentes[38]在研究從鷹嘴豆蛋白酶解得到鐵螯合肽時發(fā)現(xiàn),小分子量的肽比高分子量的肽有更高的鐵螯合活性;Huang等人[15]以蝦為原料從中純化出的1個鈣螯合肽,分子量為359 Da;Guo等人[10]從阿拉斯加鱈魚皮中鑒定出的鐵螯合肽Ser-Cys-His分子量僅為345 Da;Xia等人[39]發(fā)現(xiàn)來自于大麥谷蛋白分子量低于1 kD的小肽Fe2+螯合活性更強(qiáng)。
但是相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),一些高分子肽也具有良好的金屬螯合活性。Lv等人[40]利用Caco-2細(xì)胞研究大豆肽對鈣的吸收作用時發(fā)現(xiàn),分子量為10~30 kDa的肽要比 3~10 kDa及1~10kDa具有更強(qiáng)的鈣螯合活性;Chen[13]等從牡蠣蛋白質(zhì)中分離純化出分子量為1 882.0 Da的鋅螯合肽;Seth和Mahoney[41]研究鐵與雞肉蛋白肽的結(jié)合時發(fā)現(xiàn),大部分鐵結(jié)合到了大分子肽上(>10 kDa)上,而結(jié)合到了小肽和氨基酸上的大概只有10%。
這些研究結(jié)果存在一定的不一致,一部分原因可能是不同的食物源蛋白肽與金屬離子結(jié)合性質(zhì)存在一定的差異,另外也可能是各研究所使用的方法不同,因此分離效果和肽分子量評估上有了一定的差異。
2.2.2氨基酸組成和序列
除了分子量,肽的氨基酸組成及序列也是影響其金屬螯合活性的重要因素。研究表明,具有金屬螯合活性的肽的氨基酸組成中通常含有組氨酸(His)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、天門冬氨酸(Asp)等。Torres-Fuentes等[5]研究發(fā)現(xiàn),來源于鷹嘴豆蛋白的含有20%~30%組氨酸的小肽組分較其他組氨酸低的組分有更高的銅螯合活性;Megías等[6]從向日葵種子中得到的銅螯合肽也是富含His和Arg;Glahn和Van Campen[42]研究發(fā)現(xiàn)Cys和還原型半胱氨酸(Gly)能提高不溶性鐵的溶解性,從而提高鐵元素在Caco-2單層細(xì)胞上的吸收效果;Narin等[12]從羅非魚蛋白水解物中分離純化的1.2 kDa鈣螯合肽氨基酸序列為Trp-Glu-Trp-Leu-His-Tyr-Trp。
2.2.3特殊的基團(tuán)和殘基
隨著紅外光譜及核磁共振技術(shù)的發(fā)展,關(guān)于肽與金屬離子的螯合過程及結(jié)合位點(diǎn)已見諸報道。研究發(fā)現(xiàn)一些氨基酸基團(tuán)和殘基,如羧基、羰基、含硫巰基、負(fù)電荷和離子鍵能夠促進(jìn)金屬螯合[43]。有研究表明,金屬離子與肽類的配位發(fā)生在氨基、亞氨基或羧基上,以單齒共價鍵的形式鍵合[44-46],并發(fā)現(xiàn)小肽與鈣的結(jié)合與肽的羰基有密切關(guān)系[47]。含有殘基Asp、Glu和His的金屬螯合肽的螯合能力主要與Asp和Glu上的羧基、His上的咪唑基有關(guān)[48]。Wang等人[26]認(rèn)為主要是Asn的羧基、肽的亞氨基和Leu-Ala-Asn的羰基參與了芝麻肽與鋅的螯合。由羅非魚蛋白水解得到鈣螯合肽Trp-Glu-Trp-Leu-His-Tyr-Trp的螯合能力主要與Glu的羧基和His的咪唑基相關(guān)[12]。Chen等[13]研究指出,牡蠣肽的氨基酸組成、序列、以及肽分子表面的親水性基團(tuán)(-OH、-COOH、-NH2)的分布在與鋅的結(jié)合中起著重要的作用。有報道指出,含硫巰基主要與肌肉蛋白肽的螯合鐵能力有關(guān),肽段上Cys殘基相鄰的含硫巰基會對其鐵螯合能力產(chǎn)生一定親核性影響[40,49]。
目前,關(guān)于金屬螯合肽構(gòu)效關(guān)系的其他信息仍未明確,如肽鏈中螯合位點(diǎn)的位置、空間結(jié)構(gòu)及動態(tài)過程等[35],仍需深入研究。
3金屬螯合肽的抗氧化活性
體內(nèi)金屬離子如銅和鐵離子均含有未配對電子,作為Fenton反應(yīng)的主要催化劑,是產(chǎn)生自由基的重要來源,能夠結(jié)合銅和鐵離子的金屬螯合肽可阻斷自由基的產(chǎn)生,具有一定的抗氧化活性。肽通過與金屬離子的螯合,可改變過渡金屬的物理位置,阻礙金屬與脂類和過氧化物的相互作用,從而實現(xiàn)抗氧化[50]。因此,金屬螯合肽也被認(rèn)為具有一定的抗氧化活性。
目前,很多金屬螯合肽被發(fā)現(xiàn)具備一定的抗氧化能力,一些抗氧化活性肽被證明具有螯合金屬離子的能力。呂瑩等[20]在研究核桃肽的抗氧化機(jī)制時發(fā)現(xiàn),核桃肽具有與鐵螯合的能力,且鐵結(jié)合能力越強(qiáng)抗氧化活性越高。汪嬋等[6]在從芝麻蛋白中制取金屬螯合肽時發(fā)現(xiàn),具有金屬結(jié)合能力的芝麻水解肽也具備一定的抗氧化能力,且金屬螯合率與抗氧化能力之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性。從鷹嘴豆蛋白酶解物中得到的銅螯合肽也被證明具有良好的抗氧化活性,可以有效地阻止β-胡蘿卜素的氧化[3]。從豬肌原纖維蛋白中酶解得到的具有抗氧化活性的肽也被發(fā)現(xiàn)具有較高的銅螯合能力[51]。
金屬螯合肽的抗氧化活性除了與其能夠螯合金屬離子阻止自由基的生成有關(guān),可能還跟其自身的一些活性基團(tuán)有關(guān)。能夠螯合金屬的小肽通常含有來源于酪氨酸、組氨酸和半胱氨酸的吲哚基、咪唑基和巰基等,這些基團(tuán)同樣也在肽的抗氧化中起到重要作用[5]。金屬螯合肽抗氧化活性的深入研究,將會對金屬螯合肽的進(jìn)一步開發(fā)利用產(chǎn)生重要的影響。
4展望
從天然食物源中制得的金屬螯合肽還可進(jìn)一步與金屬離子螯合,形成肽-金屬離子螯合物,例如肽-鐵螯合物、肽-鋅螯合物等,這些肽-金屬離子螯合物除了可以作為礦物元素的補(bǔ)充劑外,還因具有多種活性,可以作為抑菌劑、食品添加劑、化妝品添加劑等,具有廣闊的市場前景[52]。雖然,目前關(guān)于金屬螯合肽的分離純化及構(gòu)效關(guān)系的分析,國內(nèi)外已有了諸多報道,但是關(guān)于這方面的研究仍有部分問題尚待解決,如金屬離子與肽的螯合率、金屬螯合肽在人體內(nèi)的生物利用度等的提高問題,以及,金屬螯合肽與金屬離子作用的具體構(gòu)效關(guān)系等仍需要進(jìn)一步的揭示。另外,尋找和鑒定其他天然的新型金屬螯合肽也將會是一個十分有意義的挑戰(zhàn)。相信隨著相關(guān)技術(shù)不斷的發(fā)展和完善,金屬螯合肽的研究也將會更加深入,繼而在各個領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用?!?/p>
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(責(zé)任編輯李燕妮)
Research Progress of Separation and Purification of Metal Chelating Peptides and Antioxidant Activity
LI Xue-fen,DU Bin,DING Ke,HAN Tao
(CollegeofFoodScienceandEngineering,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China)
Abstract:The paper reviewed research progress of the preparation procedure of metal chelating peptide,such as sources,separating and purifying techniques,structural function relationship and antioxidant activity.The future development of metal chelating peptides were also prospected.
Keywords:metal chelating peptide;separating and purifying;structure-function relationship;antioxidant activity
通訊作者:韓濤(1963—),男,教授,研究方向:功能食品。
作者簡介:李雪芬(1990—),女,碩士,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏專業(yè)。
基金項目:果蔬貯藏加工營養(yǎng)安全研究(項目編號:KCT2014025);農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程-北京市重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科資助(項目編號:PXM 2014-014207-000029)。