半枝蓮多糖的Sevage法除蛋白工藝研究

劉曉茵，趙　帥，路　芳，靳丹虹

(1 長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，長春　130031； 2 長春中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，長春　130117)

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半枝蓮多糖的Sevage法除蛋白工藝研究

劉曉茵1，趙帥2，路芳1，靳丹虹1

(1長春醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，長春130031；2長春中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，長春130117)

摘要：以樣品濃度、試劑添加量與供試液體積比、Sevage試劑中氯仿與正丁醇體積比、溫度和料液比等為因素，采用正交試驗設(shè)計，優(yōu)化半枝蓮多糖除蛋白的純化工藝，結(jié)果表明：使純化后半枝蓮多糖中總糖含量最高的最佳工藝條件是A1B3C1，即：樣品濃度5mg/mL、試劑添加量與供試液體積比1/5、Sevage試劑中氯仿與正丁醇體積比3/1。

關(guān)鍵詞：半枝蓮多糖；正交試驗設(shè)計；Sevage法；除蛋白工藝

半枝蓮為唇形科黃芩屬植物的干燥全草，具有化瘀利尿、清熱解毒等功效，臨床上常用于跌撲傷痛、黃疸、疔瘡腫毒、水腫、蛇蟲咬傷、咽喉腫痛等癥[1]。近年來藥理研究發(fā)現(xiàn)，其中的有效成分多糖半枝蓮多糖具有一定的抗衰老作用[2]，對小鼠S180肉瘤有一定的抑制作用[3，4]，對四氯化碳致小鼠肝損傷具有保護作用[5]。對其提取純化工藝的研究少見報道，為此，作者僅對水提醇沉法制得的粗多糖進行Sevage法脫蛋白后的多糖中總糖含量工藝進行優(yōu)化。

1儀器與藥品

1.1儀器

U1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普西通用儀器責(zé)任有限公司)、電子天平BS224S(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)。

1.2藥品

佛手(長春藥材公司)、苯酚、濃硫酸、乙醇等均為分析純；標準品：無水葡萄糖(飛宇生物科技有限公司，含量大于98%，批號：FY18720206)。

2試驗方法

2.1半枝蓮粗多糖的提取[6]

半枝蓮多糖的提取工藝流程如圖1。

2.2Sevage法純化多糖

Sevage法純化多糖工藝流程如圖2。

2.3多糖的測定方法[8]

藥材多糖的測定以葡萄糖為標準品，采用硫酸-苯酚比色法[8]。

半枝蓮

藥材顆粒

提取液

沉淀

粗多糖

干燥粗多糖

圖1半枝蓮多糖的提取工藝流程

干燥至恒重的粗多糖

多糖溶液(3份)

上清液

多糖沉淀(1～9號)

半枝蓮樣品液

圖2Sevage法純化多糖工藝流程

2.4標準樣品溶液的配制

精密稱取0.014 8g干燥至恆重的標準品無水葡萄糖，加入100mL容量瓶中，用水溶解至刻度，使成147.1μg/mL即得。

2.5標準曲線的制備[9，10]

依據(jù)參考文獻[6]標準曲線制備方法得：以濃度C對吸收度A回歸方程：A=0.008 9C+0.009 4，R=0.990 4。

3半枝蓮多糖純化條件的優(yōu)化設(shè)計與統(tǒng)計分析

3.1半枝蓮多糖提取條件的優(yōu)化

采用正交試驗法，對半枝蓮多糖的純化條件進行單因素考察，依據(jù)L9(34)正交水平進行試驗，因素-水平設(shè)計如表1。

表1　正交試驗因素水平

3.2試驗結(jié)果與分析

根據(jù)表1進行正交設(shè)計試驗，結(jié)果和方差分析見表2和表3。

表2　正交試驗結(jié)果

表3　方差分析

4結(jié)論

(1)極差R反映了各因素對指標的影響大小，由結(jié)果RA>RC>RB知，影響半枝蓮多糖得率從主到次的因素排序為A、C、B，即樣品濃度、Sevage試劑中氯仿與正丁醇體積比、試劑添加量與供試液體積比。

(3)在水平α=0.05下，F(xiàn)0.05(2，2)=19，由于FA、FB、FC均大于19，故A、B、C三因素對半枝蓮多糖的純化影響均顯著。

中藥半枝蓮的主要成分是黃酮類化合物，在臨床上具有很重要的應(yīng)用價值。近年來藥理研究發(fā)現(xiàn)，半枝蓮多糖也具有多方面的生理活性。通過水提-醇沉法可以獲得較高收率的半枝蓮粗多糖，但是，純化粗多糖的效果不佳。本文嘗試采用Sevage 法純化半枝蓮多糖，由于是萃取的方法，處理的樣品量較少，在純化過程的操作中，出現(xiàn)了乳化現(xiàn)象，難免有多糖的損失。因此，本文僅對脫蛋白后的多糖溶液，再經(jīng)過醇沉后所得粗多糖中總糖含量進行測定，結(jié)果顯示含量明顯提高。當(dāng)然，用Sevage 法純化多糖仍有許多指標需要考量，如多糖的損失情況、蛋白的除去率等?！?/p>

參考文獻

[1]國家藥典編寫委員會編.中華人名共和國藥典二部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：109-110.

[2]王轉(zhuǎn)子，支德娟，等.半枝蓮多糖和白花蛇草多糖抗衰老作用的研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，1999，4：5-7.

[3]袁輝，李春江，等.半枝蓮多糖對小鼠S180肉瘤抑制作用的研究[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2012，28(4)：396-398.

[4]張秀娟，張晶，等.半枝蓮多糖對小鼠S180肉瘤及免疫功能的影響[J].齊魯藥事，2008，27(10)：629-630.

[5]趙杰，孫設(shè)宗，等.半枝蓮多糖對四氯化碳致小鼠肝損傷保護作用的研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2012，19(1)：39-40.

[6]紀耀華，紀躍芝，等.大黃粗多糖傳統(tǒng)水提醇沉法最佳工藝研究[J].中國食物與營養(yǎng)，2010，1：62-65.

[7]紀耀華，馬愛民，等.大黃多糖傳統(tǒng)水提醇沉法最佳工藝優(yōu)化研究[J].時針國醫(yī)國藥，2010，21(3)：634-635.

[8]紀躍芝，紀耀華，等.傳統(tǒng)方法提取佛手多糖的最佳工藝設(shè)計[J].中國食物與營養(yǎng)，2011，9：63-66.

[9]紀耀華，紀躍芝，等.微波法提取大黃多糖最佳工藝優(yōu)化研究[J].中藥材，2009，32(8)，1291-1293.

[10]劉曉茵，等.超聲波輔助提取大黃多糖工藝的優(yōu)化[J].中國食物與營養(yǎng)，2010，12：51-53.

(責(zé)任編輯李燕妮)

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Deproteinization Process of Barbata Polysaccharide with Sevage Method

LIU Xiao-yin1，ZHAO Shuai2，LU Fang1，JIN Dan-hong1

(1ChangchunMedicalCollege，Changchun130031，China；2GraduateSchoolofChangchunUniversityofChineseMedicine，Changchun130117，China)

Abstract：Based on the sample concentration，reagent adding quantity and the test liquid volume ratio，sevage reagent chloroform and n-butanol in volume ratio，temperature and liquid ratio of factors，the deproteinization technology of barbata polysaccharide was optimized by using orthogonal experimental design.Results showed that the total sugar content in these polysaccharide purified A1B3C1 was the best process condition which were sample concentration 5 mg/mL，reagent adding quantity and the test liquid product 1/5，and Sevage reagent in chloroform and n-butanol volume 3/1.

Keywords：barbata polysaccharides；orthogonal experimental design；sevage method；deproteinization Process

作者簡介：劉曉茵(1961—)，女，學(xué)士，副主任藥師，研究方向：天然藥物成分提取分離工藝。

基金項目：吉林省教育廳科“十一五”科學(xué)技術(shù)研究項目(項目編號：〔2013〕546)。