傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化研究進展

吳進菊，胡佳琪，于　博，李云捷

（湖北文理學院化學工程與食品科學學院，湖北 襄陽 441053）

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化研究進展

吳進菊，胡佳琪，于博，李云捷

（湖北文理學院化學工程與食品科學學院，湖北 襄陽 441053）

傳統(tǒng)發(fā)酵食品制作和食用歷史悠久，其中蘊藏了豐富的微生物資源。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，可從基因水平上全面揭示傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，闡明其發(fā)酵機理，對今后傳統(tǒng)發(fā)酵食品的工業(yè)化、標準化生產(chǎn)和益生菌的開發(fā)利用具有極其重要的意義。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品；微生物多樣性；群落結(jié)構(gòu)；動態(tài)變化

傳統(tǒng)發(fā)酵食品制作和食用歷史悠久，發(fā)酵系統(tǒng)開放，蘊藏了豐富的微生物資源，經(jīng)過長期的演化過程，保留了大量優(yōu)良的微生物資源。近年來，傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化引起了國內(nèi)外學者的高度重視，紛紛開展相關研究工作，取得了較大的研究成果。本文主要介紹傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性的研究方法以及研究進展，比較傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法和非培養(yǎng)的基于宏基因組學理論方法的優(yōu)劣性，并介紹我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性的研究進展，如發(fā)酵乳制品、發(fā)酵果蔬、發(fā)酵酒飲料和發(fā)酵豆制品等。通過對傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化的研究，可以揭示其發(fā)酵機理，對今后傳統(tǒng)發(fā)酵食品的工業(yè)化、標準化生產(chǎn)和益生菌的開發(fā)利用具有極其重要的意義。

1　傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性的研究方法

1.1傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法

傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法一般是先對微生物進行分離純化，然后對分離菌株進行種屬鑒定。任曉鏷等［1］研究了新疆民族特色酸奶及酸奶疙瘩中乳酸菌的多樣性，結(jié)果表明，戊糖乳桿菌和副干酪乳桿菌為優(yōu)勢菌種。ROSANNA T等［2］研究了意大利傳統(tǒng)發(fā)酵橄欖中酵母菌的多樣性，分離出117株酵母菌，其中87株屬于啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae），其余的為畢赤酵母（Pichiagaleiformis）、假絲酵母（Candida）等。另外，該方法也被用于研究土耳其傳統(tǒng)果汁飲料gilaburu［3］、印度傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品tungrymbai和bekang［4］、云南山羊奶糕［5］的多樣性研究。該方法可以檢測到在培養(yǎng)基中生長的微生物，對于不能在培養(yǎng)基上生長的微生物無法進行分析。

1.2PCR-DGGE技術(shù)

近年來分子生物學和生物信息學發(fā)展迅速，越來越多的研究者開始應用這些不可培養(yǎng)的技術(shù)對傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的微生物多樣性進行分析，如脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleicacid，DNA）克隆和序列測定、高通量測序技術(shù)、基因芯片技術(shù)、基于聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction，PCR）的各種指紋圖譜技術(shù)等。其中聚合酶鏈式反應變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)廣泛應用于發(fā)酵食品中微生物多樣性的分析［6］。DGGE技術(shù)是利用聚丙烯酰胺凝膠中變性劑濃度梯度不同，將不同組成和排列的DNA序列分開。PCR-DGGE技術(shù)是先采用PCR將目的基因進行擴增，然后采用DGGE技術(shù)對PCR擴增產(chǎn)物進行分離得到指紋圖譜，通過測序、序列比對對指紋圖譜中的條帶進行物種鑒定［7］。DOAN T L N等［8］利用PCR-DGGE技術(shù)研究了越南發(fā)酵蔬菜中乳酸菌的多樣性，其中發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）占56.6%，戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）占24.4%，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）占17.1%，戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）占1.0%，短乳桿菌（Lactobacillus brevis）占0.5%。LIU W J等［9］從我國內(nèi)蒙古東部地區(qū)采集的198份酸牛奶樣品中分離出790株乳酸菌，經(jīng)過生理生化分析、16S rRNA基因序列分析、DGGE等手段分析，鑒定出31個種和亞種。DEVI K R等［10］利用PCRDGGE技術(shù)研究了印度東北部傳統(tǒng)發(fā)酵干魚ngari細菌動態(tài)分析。另外，PCR-DGGE技術(shù)還用于東北酸菜［11］、巴西發(fā)酵飲料chicha［12］、意大利salami香腸［13］、西非谷類食品［14］、干酪［15］等微生物研究中。PCR-DGGE技術(shù)穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性強、效率高，能夠彌補傳統(tǒng)方法分析微生物群落的不足和局限性，但是靈敏度不高，只能檢測出環(huán)境中的優(yōu)勢微生物，而低豐度微生物很難檢出，往往會偏低估計樣品中的微生物信息，不能全面的反應微生物的多樣性。

1.3高通量測序技術(shù)

高通量測序技術(shù)是DNA測序發(fā)展歷程的一個里程碑，也稱為二代測序技術(shù)，可一次性對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行并行測序，以Roche公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為標志。454技術(shù)是基于焦憐酸測序原理建立起來的測序系統(tǒng)，其主要原理是：利用特別設計的DNA捕獲磁珠與獨特的短DNA片段結(jié)合，采用擴增試劑乳化，形成只包含一個磁珠和一個獨特DNA片段的微反應體系，DNA片段在微反應體系中發(fā)生擴增，乳化體系被打破，然后將攜帶有PCR產(chǎn)物的磁珠進行測序。將A、T、G、C 4種堿基依次加入反應板中，如果發(fā)生堿基配對就會釋放一個焦磷酸，焦磷酸在三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）硫酸化酶和熒光素酶的作用下發(fā)出光信號。通過對光信號的捕獲和分析，可以快速、準確地獲得待測DNA的堿基序列。Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)與焦磷酸測序法的原理類似，都是進行邊合成邊測序，也就是生成新DNA互補鏈時，加入的脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）通過酶促級聯(lián)反應催化底物產(chǎn)生相應熒光，或直接加入被熒光標記的dNTP，利用其釋放的熒光信號，獲得互補鏈序列信息［16］。高通量測序技術(shù)效率高，可以在一次測序試驗中完成多個樣本的檢測，獲得海量序列，靈敏度高，不僅能檢測出優(yōu)勢微生物，對于低豐度微生物也能檢出，能全面、準確的揭示環(huán)境中微生物的多樣性。高通量測序技術(shù)已被廣泛用于發(fā)酵食品中，如干酪［17-18］、啤酒［19］、黃酒［20］、發(fā)酵豆制品［21-23］、香腸［24］、發(fā)酵蔬菜［25-26］、發(fā)酵飲料［27］等。

HIROSHI O等［25］利用焦磷酸測序技術(shù)對日本Nukadok（糠床，用于米糠腌制發(fā)酵蔬菜的基床）微生物多樣性和群落動態(tài)結(jié)構(gòu)動態(tài)變化進行了研究，在發(fā)酵的第一個星期檢出大量種類的微生物而乳酸菌沒有檢出，隨后微生物種類數(shù)量急劇減少，而乳酸菌種類顯著增加，植物乳桿菌為優(yōu)勢菌種。而利用純培養(yǎng)技術(shù)只檢出了發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌種，并且在發(fā)酵后期連優(yōu)勢菌株種都未檢出。JUSTYNA Y J等［23］比較了Illumina高通量測序技術(shù)、PCR-DGGE技術(shù)、傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)在意大利salami香腸微生物多樣性研究中的優(yōu)劣性，研究表明PCR-DGGE技術(shù)只鑒定出了腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcusxylosus）、清酒乳桿菌（Lactobacillussakei），而Illumina高通量測序技術(shù)不僅鑒定出了這幾個種屬，對豐度較低的微生物種屬也能發(fā)現(xiàn)。另外，PATRICIA E等［27］比較了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和454焦磷酸測序技術(shù)在阿根廷發(fā)酵飲料chicha中微生物多樣性的研究，NAM Y D等［22］比較了454焦磷酸測序和DGGE在韓國發(fā)酵豆制品cheonggukjang中微生物多樣性的研究，均得出了相同的結(jié)論，高通量測序技術(shù)在研究微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化方面均優(yōu)于傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法和PCR-DGGE技術(shù)。

2　我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性的研究進展

2.1發(fā)酵乳制品中微生物多樣性的研究進展

發(fā)酵乳制品是新疆、西藏等地區(qū)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，包括酸牛乳、酸牦牛乳、酸奶油、酸奶疙瘩等。LIU W J等［28］研究表明西藏地區(qū)酸牦牛乳中優(yōu)勢乳酸菌為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus），而發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）檢出頻率較低，德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）出現(xiàn)頻率較高。李艷等［29］對自然發(fā)酵乳及傳統(tǒng)開菲爾粒中酵母菌的多樣性進行了研究，結(jié)果表明馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）為優(yōu)勢菌群，具有釀造低酒度發(fā)酵乳的潛力。西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸牛乳中富含乳酸菌和酵母菌，以乳酸菌為優(yōu)勢菌群，平均數(shù)量達到106CFU/mL，酵母菌平均數(shù)量為105CFU/mL。微生物數(shù)量的差異可能和當?shù)氐牡乩砦恢谩夂蚣爸谱鳁l件如接種量、接種時間、發(fā)酵溫度等因素有關［30］。

2.2發(fā)酵果蔬中微生物多樣性的研究進展

佟婷婷［31］對采集的20個四川農(nóng)家自制泡菜樣品中感官評分較高的3個樣品進行細菌多樣性分析，結(jié)果顯示四川泡菜中以乳桿菌屬（Lactobacillus）為主，占比達到76%～89%，是老壇中的優(yōu)勢菌，而泡菜發(fā)酵中啟動菌為魏斯氏菌屬（Weissella），含量達到74.5%。荊雪嬌等［32］對市售9種發(fā)酵蔬菜中細菌群落多樣性分析、主成分聚類分析和優(yōu)勢條帶的序列分析，包括泡菜、榨菜、醬菜和酸菜，結(jié)果表明不同加工工藝對發(fā)酵蔬菜的多樣性和群落結(jié)構(gòu)有顯著影響，相同工藝的發(fā)酵蔬菜樣品，細菌多樣性指數(shù)差異不大，主成分聚類分析聚為一類，乳桿菌為發(fā)酵蔬菜優(yōu)勢菌群。對于泡菜，蘿卜、豇豆、青菜和榨菜四種不同原料泡菜樣品中優(yōu)勢菌均包含德巴利氏酵母屬（Debaryomyces），并且蘿卜和青菜泡菜水樣品的真菌多樣性較低，豇豆和榨菜泡菜水樣品真菌多樣性指數(shù)較高［33］。

2.3發(fā)酵酒飲料中微生物多樣性的研究進展

中國白酒和黃酒有著悠久的釀造歷史，口感獨特，其中白酒被譽為世界六大蒸餾酒之一。傳統(tǒng)的中國白酒和黃酒釀造是一個相對比較開放的系統(tǒng)，參與的微生物種類眾多，現(xiàn)代分子生物學手段可以有效地幫助人們了解其中蘊藏的微生物資源。WANG P等［20］對紹興黃酒發(fā)酵過程中的細菌群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化進行了研究，共發(fā)現(xiàn)了12個種屬的細菌，包括乳桿菌（Lactobacillus）、糖多孢菌（Saccharopolyspora）、芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞菌（Pseudomonas）、葡萄球菌（Staphylococcus）、魏斯氏菌（Weissella）、乳球菌（Lactococcus）、腸球菌（Enterococcus）、水棲菌（Enhydrobac ter）等，其中乳桿菌、糖多孢菌屬于優(yōu)勢菌。在發(fā)酵第3天，乳桿菌占細菌總數(shù)的12.020%，明顯低于糖多孢菌（23.897%），而在隨后的發(fā)酵過程中，乳桿菌的比例明顯高于糖多孢菌，在發(fā)酵第10天時達到最高，為44.723%。LV X C等［34］對烏衣紅曲黃酒發(fā)酵過程中的微生物多樣性進行了研究，結(jié)果表明，發(fā)酵初期優(yōu)勢菌為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）和芽孢桿菌（Bacillus），在發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌為芽孢桿菌（Bacillus）和乳桿菌（Lactobacillus）。

ZHANG X等［35］采用焦磷酸測序?qū)η宀?、后火、紅心3種清香型中國白酒大曲進行了多樣性分析，在97%相似度情況下香濃指數(shù)分別為5.0、4.2和4.2，表明清茬的生物多樣性最高。另外，葉光斌等［36-37］分別對四川瀘州、貴州、四川宜賓等地區(qū)白酒窖泥中的微生物多樣性進行了研究，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢種群分別為梭菌綱細菌（Clostridia）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformi）、梭狀芽孢桿菌（Clostridium）。

2.4發(fā)酵豆制品中微生物多樣性的研究進展

柳陳堅等［38］對云南省普洱市豆豉中微生物群落多樣性進行了分析，結(jié)果表明豆豉中的細菌都屬于厚壁菌門（Firmicutes），主要的優(yōu)勢細菌是嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetrageno coccus halophilus），其次是葡萄球菌屬（Staphylococcus），真菌都屬于假絲酵母屬（Candida）。而云南省玉溪豆豉中乳酸桿菌（Lactobacillus）是豐度最高的細菌，占總序列數(shù)的72%，在豆豉發(fā)酵中起重要作用；芽孢桿菌（Bacillus）也是重要的細菌，占序列總數(shù)的10%［39］。四川郫縣傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆瓣在發(fā)酵中期（5個月）優(yōu)勢菌為芽孢桿菌（Bacillus）、假絲酵母（Candida）和異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces），成熟期（10個月）優(yōu)勢菌為芽孢桿菌（Bacillus）、海洋芽孢桿菌（Oceanobacillus）［40］。醬油醬醅中的乳酸菌以魏斯氏菌（Weissella）為主，在發(fā)酵8d的樣品中，魏斯氏菌（Weissella）占61%，庫特氏菌（Kurthia gibsonii）占11%，芽孢桿菌（Bacillus）只占檢測到細菌的6%；發(fā)酵16 d時魏斯氏菌（Weissella）降為42%，庫特氏菌（Kurthia gibsonii）和芽孢桿菌（Bacillus）則占比上升，分別達到25%；發(fā)酵25 d時只檢測到芽孢桿菌（Bacillus）的存在，而其他的細菌菌群都沒有被檢測到［41］。

3　展望

傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性非常豐富，并蘊藏了豐富的益生菌資源。針對傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性，早期的研究基本是建立在傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)研究方法上的，只能獲得微生物總量中極少的一部分，存在很大的局限性和片面性，從而對發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化、種群多樣性和微生物功能多樣性了解不夠清楚。隨著科技的發(fā)展，分子生物學手段逐漸取代傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法用于微生物多樣性的研究，它可從基因水平上全面揭示傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，避免了基于純培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法的局限性，是目前研究微生物多樣性常用的方法。

目前，我國很多傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)依然在沿用傳統(tǒng)的工藝，存在很多的問題，如生產(chǎn)規(guī)模小，生產(chǎn)工藝落后，乳酸發(fā)酵緩慢，發(fā)酵周期較長，受環(huán)境因子影響很大，使產(chǎn)品質(zhì)量很不穩(wěn)定，存在一定的食品安全隱患等，因此制約了傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)展。通過對傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)變化的研究，可以揭示其發(fā)酵機理，獲得優(yōu)勢菌群，開發(fā)自然微生物資源，對今后傳統(tǒng)發(fā)酵食品的工業(yè)化、標準化生產(chǎn)和益生菌的開發(fā)利用具有極其重要的意義。

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Research progress on microbial diversity and dynamic changes of community structure in the traditional fermented food

WU Jinju，HU Jiaqi，YU Bo，LI Yunjie

（College of Chemical Engineering and Food Science，Hubei University of Arts and Science，Xiangyang 441053，China）

The traditional fermented food has a long history of production and consumption，which contains rich microbial resources.With the continuous development of molecular biology technology，the microbial diversity and dynamic changes of the traditional fermented food can be fully revealed at the genetic level，and the fermentation mechanism can be illuminated.It has very important significance on industrialization and standardized production of the traditional fermented food，as well as development and utilization of probiotics.

traditional fermented food；microbial diversity；community structure；dynamic change

TS205.5

0254-5071（2016）09-0020-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.005

2016-05-06

國家自然科學基金青年項目（31501456）

吳進菊（1983-），女，副教授，博士，研究方向為食品加工高新技術(shù)和食品生物技術(shù)。