提高微生物谷胱甘肽產(chǎn)率措施的探討

董永勝，馬　蕾，王艷杰

（齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南250353）

提高微生物谷胱甘肽產(chǎn)率措施的探討

董永勝，馬蕾，王艷杰

（齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，山東濟(jì)南250353）

谷胱甘肽是生物體內(nèi)具有重要生理功能的活性物質(zhì)，具有清除自由基、解毒、預(yù)防糖尿病和癌癥、抑制衰老、抑制艾滋病病毒、提高人體免疫力等功能，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健和食品等行業(yè)，谷胱甘肽主要由微生物發(fā)酵產(chǎn)生。該文介紹了微生物生產(chǎn)谷胱甘肽的現(xiàn)狀，綜述了微生物生產(chǎn)谷胱甘肽過程中優(yōu)良菌株選育、發(fā)酵過程優(yōu)化與控制等提高谷胱甘肽產(chǎn)率的策略與措施，并對發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽需解決的問題進(jìn)行了展望，旨在為微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的研究提供參考。

谷胱甘肽；微生物；產(chǎn)率；措施

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成的一種含有巰基的活性三肽物質(zhì)［1］，具有清除自由基、解毒、抑制衰老、預(yù)防糖尿病和癌癥、抑制艾滋病病毒、提高人體免疫力等重要生理功能［2-4］。谷胱甘肽不僅作為試劑廣泛應(yīng)用于生化、生物學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究與測定［5-6］，而且已在臨床醫(yī)療、防衰老、保健、食品制作、養(yǎng)殖等行業(yè)引起人們?nèi)找鎻V泛的關(guān)注［7-9］。微生物發(fā)酵法是谷胱甘肽生產(chǎn)普遍采用的方法，谷胱甘肽是由微生物胞內(nèi)的谷胱甘肽合成酶系催化而成，該酶系由γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成酶（GSH-Ⅰ）和谷胱甘肽合成酶（GSH-Ⅱ）組成。微生物在生長代謝過程中產(chǎn)生谷胱甘肽的前體物質(zhì)，進(jìn)而在酶系的催化下合成谷胱甘肽。在谷胱甘肽生產(chǎn)過程中，影響其產(chǎn)率的主要因素包括生產(chǎn)菌株胞內(nèi)谷胱甘肽合成酶系的活性、微生物發(fā)酵條件控制、谷胱甘肽代謝調(diào)控等。該文綜述了提高谷胱甘肽產(chǎn)率的策略與措施，并對發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽需解決的問題進(jìn)行了展望，旨在為微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的研究提供參考。

1　利用微生物生產(chǎn)谷胱甘肽的研究概況

谷胱甘肽的生產(chǎn)方法主要有萃取法、化學(xué)合成法、發(fā)酵法、酶（或固定化細(xì)胞）法等。微生物發(fā)酵法是以糖類為原料，利用特定微生物體內(nèi)的物質(zhì)代謝將糖類轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽的方法，是目前谷胱甘肽工業(yè)化生產(chǎn)的主要方法，該法通過選育（或構(gòu)建）谷胱甘肽合成能力強(qiáng)和胞內(nèi)含量高的微生物，篩選和優(yōu)化培養(yǎng)基配方、建立和優(yōu)化發(fā)酵控制策略、改進(jìn)和提高下游過程技術(shù)等，最終提高谷胱甘肽的產(chǎn)率和質(zhì)量。發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽所采用的微生物通常是酵母菌，基因工程大腸桿菌谷胱甘肽的產(chǎn)量一般比酵母菌高，但其生產(chǎn)技術(shù)難度較大，相對還不夠成熟。目前采用基因工程大腸桿菌生產(chǎn)谷胱甘肽的研究有了很大進(jìn)展，其發(fā)展前景廣闊。

微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的研究報(bào)道相對較多，主要是關(guān)于培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件優(yōu)化的研究，目的是為了提高谷胱甘肽的產(chǎn)量。潘亞磊等［10］對釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽采用分批補(bǔ)加葡萄糖培養(yǎng)，GSH質(zhì)量濃度達(dá)到72.49 mg/L，提高了2.86倍。吳祥庭等［11］對釀酒酵母WD-1合成谷胱甘肽的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，谷胱甘肽的產(chǎn)量達(dá)223.22 mg/L，提高了36.81%。此外，對培養(yǎng)基的特殊成分及培養(yǎng)方法也進(jìn)行了研究，鄭麗雪等［12］在釀酒酵母CS10515-1生產(chǎn)谷胱甘肽的研究中，添加K+、Mg2+、Fe2+，GSH的產(chǎn)量分別為88.53 mg/L、52.73 mg/L、41.42 mg/L，分別提高了63.50%、36.58%和44.25%。錢衛(wèi)東等［13］對多形漢遜酵母DL-1采用變溫調(diào)控分批發(fā)酵，GSH總產(chǎn)量為420.76 m g/L，提高了2.34倍。

2　提高微生物谷胱甘肽產(chǎn)率的策略與措施

采用微生物生產(chǎn)谷胱甘肽，除了優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件外，還需要選育高產(chǎn)菌株、提高菌體的細(xì)胞密度及采取代謝調(diào)控等生產(chǎn)策略，目前，提高谷胱甘肽產(chǎn)率常采取的措施有以下幾方面。

2.1高產(chǎn)谷胱甘肽菌株的選育

由于谷胱甘肽是胞內(nèi)產(chǎn)物，野生型微生物細(xì)胞中含量普遍不高，因此，發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的關(guān)鍵技術(shù)之一在于如何提高微生物胞內(nèi)含量。高產(chǎn)谷胱甘肽的菌株主要來源于傳統(tǒng)的育種方法和基因工程技術(shù)構(gòu)建的高產(chǎn)谷胱甘肽合成酶系活性的工程菌。

2.1.1誘變育種

為提高微生物胞內(nèi)谷胱甘肽的含量，研究人員進(jìn)行了誘變育種研究，取得了一定成果。賈學(xué)杰等［14］對酵母采用硫酸二乙酯和紫外誘變及ZnCl2、乙硫氨酸抗性交替篩選，酵母胞內(nèi)GSH的含量提高了73.5%。龐德欽等［15］對啤酒酵母SC-20采用氬氣等離子體射線和紫外照射處理，獲得菌株的GSH含量提高78.33%。陳雪等［16］對酵母采用紫外線和亞硝基胍進(jìn)行誘變以及使用乙硫氨酸、氯化鋅和三氮唑?yàn)楹Y選模型，得到谷胱甘肽產(chǎn)量為864 mg/L的菌株，為出發(fā)菌株的4.9倍。目前，谷胱甘肽生產(chǎn)菌株的誘變育種方法主要采用傳統(tǒng)的化學(xué)誘變方法（亞硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等）和物理誘變方法（紫外線、X射線）相結(jié)合；為避免單一誘變劑產(chǎn)生的誘變飽和效應(yīng)，也采用等離子體和紫外線兩種誘變劑交替和復(fù)合使用的方法，并采用HgCl2和ZnCl2兩種抗性篩選物交替使用，以避免菌體對同一種抗性物質(zhì)產(chǎn)生的耐受性。

2.1.2基因工程育種

正常微生物胞內(nèi)的谷胱甘肽合成酶系活性普遍較低，且GSH-Ⅰ是一個(gè)限速酶，其活性受到谷胱甘肽的反饋抑制，為了減輕這種抑制，需要提高酶系的活力或降低酶系對谷胱甘肽的敏感性。國內(nèi)外研究人員通過將谷胱甘肽合成酶系的GSH-Ⅰ和（或）GSH-Ⅱ基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母或大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，以期獲得高產(chǎn)谷胱甘肽的基因重組菌株。目前基因工程育種都是從提高其胞內(nèi)合成能力為目標(biāo)，主要涉及谷胱甘肽的生物合成途徑［17］、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝［18］及硫同化過程［19］等相關(guān)代謝酶的過表達(dá)或失活。LIAO X Y等［20］通過在大腸桿菌中表達(dá)2個(gè)拷貝數(shù)的GSH-Ⅰ和1個(gè)拷貝數(shù)的GSH-Ⅱ來提高谷胱甘肽合成酶系的活力，結(jié)果表明谷胱甘肽的產(chǎn)量達(dá)到34.8 mg/g（細(xì)胞濕質(zhì)量），是目前所報(bào)道的在大腸桿菌（E.coli）中表達(dá)產(chǎn)量較高的。傅瑞燕等［22］將大腸桿菌的谷胱甘肽合成酶的基因克隆，轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌中，重組菌胞內(nèi)谷胱甘肽含量達(dá)到358 nmol/mg（蛋白）。FEI L W等［22］將釀酒酵母的GSH-Ⅰ和（或）GSH-Ⅱ基因克隆，并在畢赤氏酵母中表達(dá)，谷胱甘肽的產(chǎn)量達(dá)到4.14 g/L。沈繼朵等［23］克隆大腸桿菌的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，用該酶取代GSH-Ⅰ，構(gòu)建工程菌，其γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活是出發(fā)菌株E.coli DH5α的21倍，以谷氨酰胺、半胱氨酸和甘氨酸為底物合成谷胱甘肽，其產(chǎn)量達(dá)到0.524 g/L。楊建花等［24］采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)獲得嗜熱鏈球菌中的谷胱甘肽合成酶基因gshF，構(gòu)建重組畢赤酵母，重組菌生成的GSH是宿主菌的2.23倍。在谷胱甘肽生產(chǎn)菌株的基因工程育種中，由于酵母菌中的糖降解酶活性較高和大腸桿菌的生長特性，因此常用酵母或大腸桿菌作宿主菌，將GSH-Ⅰ和（或）GSH-Ⅱ基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入其細(xì)胞內(nèi)以獲得重組菌株。

2.2高細(xì)胞密度培養(yǎng)

為獲得高谷胱甘肽產(chǎn)率，除了提高微生物胞內(nèi)谷胱甘肽產(chǎn)量外，還需要提高發(fā)酵液中菌體的密度，因此需要對微生物進(jìn)行高細(xì)胞密度培養(yǎng)。提高微生物細(xì)胞密度需要對其生長的物理和化學(xué)環(huán)境進(jìn)行優(yōu)化，主要包括細(xì)胞生長環(huán)境的優(yōu)化（培養(yǎng)基組分優(yōu)化、特殊營養(yǎng)物質(zhì)的添加、限制代謝副產(chǎn)物的積累）、細(xì)胞培養(yǎng)模式選擇、細(xì)胞循環(huán)發(fā)酵等。趙波等［25］在流加葡萄糖的基礎(chǔ)上流加硫酸銨并控制pH，通過高密度發(fā)酵提高細(xì)胞濃度來提高GSH產(chǎn)量，GSH產(chǎn)量和細(xì)胞干質(zhì)量均大幅提高，分別為830 mg/L和41.5 g/L。尹良鴻等［26］運(yùn)用了指數(shù)速率-DO-stat組合流加策略，即采用指數(shù)速率流加實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度培養(yǎng)，采用DO-stat反饋流加實(shí)現(xiàn)GSH的高積累，細(xì)胞量、GSH產(chǎn)量和胞內(nèi)GSH含量分別達(dá)到82.5 g/L、1 120.6 mg/L和1.46%，實(shí)現(xiàn)了高細(xì)胞密度和高胞內(nèi)GSH含量的相對統(tǒng)一。實(shí)際生產(chǎn)中，不同微生物采用的高細(xì)胞密度培養(yǎng)方式不同，如采用重復(fù)補(bǔ)料分批培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)釀酒酵母，每24 h更換50%的培養(yǎng)基，持續(xù)30 d，酵母細(xì)胞的產(chǎn)量可比連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)提高3倍。

2.3添加前體物質(zhì)提高谷胱甘肽產(chǎn)量

微生物在生產(chǎn)谷胱甘肽的過程中，所需的三種氨基酸是細(xì)胞在糖類代謝的基礎(chǔ)上經(jīng)過一系列生化反應(yīng)后自身合成的，但這些合成途徑易受到細(xì)胞自身性能和狀況以及外界營養(yǎng)與環(huán)境條件的影響，如果前體物質(zhì)不能滿足谷胱甘肽合成的需要，會成為影響谷胱甘肽產(chǎn)率的因素。因此，微生物生產(chǎn)谷胱甘肽雖然是以葡萄糖為原料，但如在培養(yǎng)基中添加谷胱甘肽的前體物質(zhì)也能提高谷胱甘肽的產(chǎn)量。WEN S H等［27］采用甲醇利用型酵母生產(chǎn)谷胱甘肽時(shí)，流加L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸溶液，控制發(fā)酵液中各種前體氨基酸的濃度為5～40 mmol/L，谷胱甘肽含量可達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量的3%以上。陳珊等［28］采用酵母突變株YF生產(chǎn)谷胱甘肽時(shí)，添加濃度為2 mmol/L的L-半胱氨酸，谷胱甘肽濃度提高了102%。尹良鴻等［29］采用氨基酸添加與高密度培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，流加葡萄糖的同時(shí)添加L-谷氨酸、L-半胱氨酸、甘氨酸，酵母GSH產(chǎn)量和胞內(nèi)GSH含量分別達(dá)1 725.3 mg/L和3.29%，比高密度培養(yǎng)提高了111.4%和100.6%。在實(shí)際生產(chǎn)中，不同微生物的生長代謝狀況不同，并且三種前體氨基酸在谷胱甘肽合成中的作用不同，因此，每種氨基酸的添加時(shí)間、添加量都需要通過實(shí)驗(yàn)確定，以便達(dá)到最佳生產(chǎn)效果。

2.4發(fā)酵條件調(diào)控提高谷胱甘肽產(chǎn)量

微生物在高溫、高滲透壓或化學(xué)損傷等外在條件刺激下，會發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，此時(shí)，作為自我保護(hù)性物質(zhì)的谷胱甘肽的合成量會有應(yīng)激性的變化。利用這一特性，采取適當(dāng)?shù)臈l件刺激可以提高谷胱甘肽的含量。

2.4.1壓力提高谷胱甘肽產(chǎn)量

壓力對微生物也是一種刺激因子，在大多數(shù)情況下，生物反應(yīng)器的壓力對微生物的生長及胞內(nèi)特定產(chǎn)物的含量有顯著影響，因此，利用高壓作為刺激條件，可以提高微生物胞內(nèi)谷胱甘肽的含量。DONG Y S等［30］對處于對數(shù)生長期的酵母進(jìn)行加壓培養(yǎng)，在1.0 MPa壓力下、培養(yǎng)6 h時(shí)酵母胞內(nèi)谷胱甘肽比常壓下同樣培養(yǎng)時(shí)間提高了68.8%。周斌等［31］對面包酵母CICC1447采用加壓處理，在壓力0.5 MPa下處理，谷胱甘肽的產(chǎn)量比常壓下提高了17.21%。

2.4.2鹽脅迫提高谷胱甘肽產(chǎn)量

高滲透壓條件對微生物也是一種外界刺激條件，微生物在高濃度鹽溶液下培養(yǎng)也可提高谷胱甘肽的含量。王玉磊等［32］對產(chǎn)朊假絲酵母采用不同的無機(jī)鹽（NaCl、K2SO4、KCl、Na2SO4）進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度的Na+和K+對谷胱甘肽的合成具有促進(jìn)作用，如在酵母細(xì)胞生長后期添加10 g/L的Na2SO4，谷胱甘肽的含量提高了22.6%。

2.4.3極端pH值提高谷胱甘肽產(chǎn)量

極端pH值對微生物也是一種外界刺激因素，聶薇等［33］對產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）WSH 02-08細(xì)胞賦予短時(shí)間的pH脅迫，GSH總產(chǎn)量達(dá)到737.1 mg/L，比恒定pH=5.5條件下的GSH產(chǎn)量提高了24.9%。鄭麗雪等［34］對釀酒酵母2-10515的種子在pH3.5的條件下培養(yǎng)，然后進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，其生物量、胞內(nèi)谷胱甘肽含量分別提高了38.3%和39.5%。低pH使細(xì)胞膜的通透性改變，使胞內(nèi)部分谷胱甘肽分泌到胞外［35］。SM IRNOVA G等［36］通過調(diào)控菌株培養(yǎng)的pH值，改變了谷胱甘肽分泌和攝入的動力學(xué)平衡，實(shí)現(xiàn)了谷胱甘肽的胞外積累。BACHHAWAT A K等［37］發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)或通透性發(fā)生改變時(shí)，谷胱甘肽才有可能直接通過細(xì)胞膜滲透。因此，采用低pH處理微生物細(xì)胞，可使細(xì)胞通過二次合成谷胱甘肽使其產(chǎn)量增加。

3　展望

目前，對微生物發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的研究主要集中在上述所述的幾個(gè)方面，并取得了一定成果，國內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)要求已逐步得到滿足，但仍存在菌株谷胱甘肽含量較低、分離純化收率低、成本高等問題。隨著谷胱甘肽需求的日益增加，對谷胱甘肽生產(chǎn)技術(shù)的研究也會更加深入，預(yù)期今后將在菌株育種方法、谷胱甘肽代謝機(jī)制、前體物的應(yīng)用策略、膜通透性改變、應(yīng)激機(jī)制以及分離純化技術(shù)方面得到更有效和低廉的方法，以提高谷胱甘肽的產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本，拓展其應(yīng)用領(lǐng)域，加速谷胱甘肽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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Discussion of enhancing glutathione yield by microbes

DONG Yongsheng，MA Lei，WANG Yanjie
（College of Bioengineering，Qilu University of Technology，Jinan 250353，China）

Glutathione is an active substance with important physiological function in organism，which has functions of scavenging free radical，detoxification，prevention of diabetes and cancer，inhibition of aging and HIV，improving human immunity and so on.It is widely applied in health care and food and other industries，and it is mainly produced by microbial fermentation.In this article，a brief introduction of the current situations of glutathione production by microorganism was presented.The measures for enhancing glutathione yield through strain screening，fermentation conditions optimization，metabolic regulation and so on were described in detail.In the end，the problems to be solved in fermentation process for glutathione production were briefly prospected.The aim was to provide reference for the research of glutathione produced by microbes.

glutathione；microorganism；yield；measuress

Q93-335

0254-5071（2016）05-0006-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．002

2016-01-06

山東省自然科學(xué)基金（2014ZRB01120）

董永勝（1964-），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵。