煙草N基因及其介導(dǎo)的抗TMV信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)制

王　倩，劉貫山

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

煙草N基因及其介導(dǎo)的抗TMV信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)制

王倩，劉貫山*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

煙草N基因來源于粘煙草（Nicotiana glutinosa），通過特異識(shí)別煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）的解旋酶結(jié)構(gòu)引發(fā)植物的過敏性壞死反應(yīng)，介導(dǎo)植物對(duì)該病毒的抗性。N-TMV互作是研究最早且最深入的植物-病原菌互作的模型之一。從N基因的分離、轉(zhuǎn)錄表達(dá)、編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)及其抗TMV信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)制等方面進(jìn)行了綜述。

N基因；煙草；TMV；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

煙草N基因來源于煙草野生種粘煙草（Nicotiana glutinosa），是植物中鑒定的第一個(gè)TIR-NBS-LRR類（Toll-interleukin-1 receptor/nucleotide-binding site/leucine-rich repeat）抗病基因（resistance gene，R）[1]。N基因可特異識(shí)別煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）解旋酶結(jié)構(gòu)域（p50），進(jìn)而引起植物的過敏性壞死反應(yīng)（hypersensitive reaction，HR），把病毒局限在壞死部位，從而抵抗TMV的復(fù)制增殖。TMV-含N基因煙草的相互作用是研究病原物-寄主植物互作的經(jīng)典模型之一[2]。

1　煙草N基因

1.1N基因的克隆及其功能驗(yàn)證

1914年Allard等[3]發(fā)現(xiàn)，粘煙草及普通煙草與粘煙草的雜交后代在接種TMV后未表現(xiàn)出花葉癥狀，相反，接種葉片均發(fā)生HR，TMV則存在于壞死斑及其周圍。Holmes[3]以普通煙草與粘煙草的漸滲雜交系為試驗(yàn)材料，對(duì)該材料的抗TMV遺傳特性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，并首次提出了“N”基因的概念，即“對(duì)TMV侵染的壞死型反應(yīng)”（necrotic-typeresponsetoinfectionwith tobacco-mosaic virus）。研究認(rèn)為，N基因是一個(gè)顯性單基因，在普通煙草中的隱性等位基因被稱為“n”。1994年，Whitham等[1]通過轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法從抗TMV的普通煙草中克隆得到N基因，確定了N基因的序列、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，并證實(shí)了N基因介導(dǎo)了煙草對(duì)TMV的抗性。隨后，將N基因通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入番茄（Lycopersicon esculentum），再次確定N基因可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)TMV產(chǎn)生HR反應(yīng)，病毒局限于枯斑部位[4]。類似的結(jié)果也在本生煙（N.benthamiana）上被證實(shí)[5]。目前，除了TMV Ob生理小種（ToMV-Ob），N基因可介導(dǎo)煙草對(duì)其他所有的TMV小種產(chǎn)生HR[6]。

1.2N基因介導(dǎo)的過敏性壞死反應(yīng)

N基因介導(dǎo)的抗TMV反應(yīng)有兩個(gè)特點(diǎn)：（1）TMV侵染含N基因煙草后約48 h就會(huì)產(chǎn)生HR，即煙草在侵染位點(diǎn)處形成壞死斑，病毒被限制在枯斑及其鄰近部位。HR大致可分為兩個(gè)階段：侵染早期，入侵的細(xì)胞或組織急劇地解體；在隨后一段相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)，周圍剩余組織再緩慢死亡[7]；（2）N基因介導(dǎo)的TMV抗性要求特定的溫度范圍。只有在28℃以下，受TMV侵染的N基因煙草才表現(xiàn)HR反應(yīng)，當(dāng)溫度高于28℃時(shí)，TMV則在植株體內(nèi)系統(tǒng)地傳播，而溫度重新降至28℃以下后，植株會(huì)發(fā)生系統(tǒng)性的HR，造成整株死亡[8]。N基因介導(dǎo)的“抗病溫敏性”反映了病毒和寄主之間溫敏性互作的特點(diǎn)。N基因煙草產(chǎn)生HR反應(yīng)后，在隨后的一段時(shí)間內(nèi)植株能夠獲得系統(tǒng)抗性（systemic acquired resistance，SAR），對(duì)后續(xù)TMV及其他類似病原的入侵產(chǎn)生抗性[2]。

1.3N基因?qū)?yīng)的無毒因子

根據(jù)Flor的“基因?qū)颉奔僬f，在寄主植物中存在一個(gè)抗病基因R，在病原菌中就存在一個(gè)相應(yīng)的無毒基因（avirulence，Avr）；由病原菌無毒基因編碼的無毒因子作為激發(fā)子與其寄主植物的抗病基因產(chǎn)物相互作用，從而引發(fā)抗病反應(yīng)[9]。TMV的基因組為一條單鏈正義RNA，全長(zhǎng)6395 nt，編碼至少4個(gè)蛋白，包括126 kDa和183 kDa的復(fù)制酶、30 kDa的病毒運(yùn)動(dòng)蛋白和17.5 kDa的病毒外殼蛋白[6]。早期研究發(fā)現(xiàn)，TMV 126-kDa的復(fù)制酶能夠引起N基因介導(dǎo)的HR反應(yīng)[6,10]。利用瞬時(shí)表達(dá)及轉(zhuǎn)基因技術(shù)等進(jìn)一步證實(shí)，位于126 kDa復(fù)制酶羧基端末端的約50 kDa的解旋酶片段（p50）能夠?qū)е翹基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累，并有效地引起N基因介導(dǎo)的HR反應(yīng)，且該HR反應(yīng)也對(duì)溫度敏感。因此，編碼p50的核苷酸序列又被稱為N基因?qū)?yīng)的無毒基因[11,12]。

2　煙草N基因的編碼產(chǎn)物及轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)特性

2.1N基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

N基因全長(zhǎng)6656 bp，含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，可轉(zhuǎn)錄出NS（3432 nt）和NL（1956 nt）2個(gè)轉(zhuǎn)錄本。NS編碼的全長(zhǎng)N蛋白由1144個(gè)氨基酸組成，分子量為131.4 kDa。其氨基酸端具有與果蠅Toll蛋白及哺乳動(dòng)物白細(xì)胞介素-1受體（Toll and interleukin-1 receptor，TIR）的胞質(zhì)區(qū)相似的結(jié)構(gòu)域，稱為TIR結(jié)構(gòu)。N蛋白的中間區(qū)段含有形成核酸結(jié)合區(qū)（nucleotide-binding site，NBS）所需的P-loop、kinase 2和kinase 3a 3個(gè)結(jié)構(gòu)域。216～223位的氨基酸序列為GMGGVGKT，符合P-loop的保守序列(A/G)XXXXGK(S/T)，在結(jié)合ATP/GTP的過程中起作用。N蛋白297～301位的氨基酸序列為L(zhǎng)IVLD，符合Kinase 2a的結(jié)構(gòu)特征，即4個(gè)連續(xù)疏水氨基酸緊挨1個(gè)天冬氨酸，在磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)中催化二價(jià)陽離子Mg2+或Ca2+的可逆的轉(zhuǎn)移。N蛋白320～325位的氨基酸序列為FGNGSR，符合Kinase 3a結(jié)構(gòu)特征，該結(jié)構(gòu)具有結(jié)合嘌呤或核糖的功能。N蛋白的羧基端為L(zhǎng)RR（leucine-rich repeat）結(jié)構(gòu)域，含有14個(gè)不完全的LRR重復(fù)。每個(gè)LRR約有26個(gè)氨基酸組成。由于LRR結(jié)構(gòu)域多介導(dǎo)蛋白-蛋白或蛋白-細(xì)胞膜間的特異互作，推測(cè)N蛋白可能通過LRR結(jié)構(gòu)所致的互作而行使功能[1,8]。

N基因內(nèi)部第3個(gè)內(nèi)含子中含有一個(gè)70 bp的交替外顯子（alternative exon，AE）。該元件使N基因在轉(zhuǎn)錄時(shí)發(fā)生選擇性剪切，形成另一個(gè)轉(zhuǎn)錄本NL。同時(shí)，選擇性剪切導(dǎo)致相位改變，NL翻譯形成一個(gè)截短的蛋白Ntr。Ntr蛋白由652個(gè)氨基酸組成，分子量為75.3 kDa，該蛋白含有TIR結(jié)構(gòu)、NBS結(jié)構(gòu)和1個(gè)LRR，移碼突變導(dǎo)致其羧基端36個(gè)氨基酸不同于完整的N蛋白[1,8]。

N蛋白的TIR、NBS和LRR結(jié)構(gòu)域與其識(shí)別TMV配體的蛋白復(fù)合物有關(guān)，能夠激發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)防御反應(yīng)[1,8]。關(guān)鍵氨基酸基團(tuán)的缺失和定點(diǎn)氨基酸突變表明，這3個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)基因的功能都是不可缺少的[13]。

2.2N蛋白的定位及其寡聚化

植物某些R蛋白的亞細(xì)胞定位取決于其Avr。通過定位試驗(yàn)或細(xì)胞組分分離檢測(cè)，N蛋白和p50在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布。在寄主植物其他蛋白因子的協(xié)助下，細(xì)胞質(zhì)中的N蛋白識(shí)別p50，而細(xì)胞核內(nèi)的N蛋白起始抗病反應(yīng)。N基因的TMV抗性需要N蛋白的細(xì)胞核內(nèi)定位，但與p50的細(xì)胞核內(nèi)定位無關(guān)[14]。

TIR-NBS-LRR抗病蛋白家族與哺乳動(dòng)物的NOD 蛋 白 （ nucleotide binding oligomerization domain proteins）家族、類Toll受體家族（Toll-like receptors，TLRs）和白細(xì)胞介素-1受體家族（interleukin-1 receptors，IL-1R）在結(jié)構(gòu)上存在很大相似性。后三者均存在寡聚化（oligomerization）的特點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，N蛋白在p50存在的情況下可發(fā)生寡聚化[15]。對(duì)N基因突變體聚合能力和抗TMV功能進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，N蛋白的p-loop環(huán)發(fā)生氨基酸突變，影響N的聚合，N蛋白喪失抗病毒功能；RNBS-A結(jié)構(gòu)域和TIR結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸突變可導(dǎo)致N蛋白的抗病功能削弱，但具有聚合的能力。因此，推測(cè)N蛋白的寡聚化位于N基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)的上游[15]。

2.3煙草N基因的表達(dá)特性

NS和NL的表達(dá)受TMV侵染和溫度的誘導(dǎo)和調(diào)控。早期研究發(fā)現(xiàn)，健康和TMV侵染后前3 h的煙草中，N基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以NS為主；TMV侵染后4～8 h內(nèi)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物則以NL為主，表明煙草在感受TMV入侵的信號(hào)后，通過調(diào)控N基因的可變剪切，分配NS和NL的比率和表達(dá)時(shí)間來抵抗病毒。N基因下游基因組調(diào)控序列（3?genomic regulatory sequences，3?GS）和第III內(nèi)含子中包含的AE元件均能影響到可變剪切，它們?cè)贜基因介導(dǎo)的抗TMV過程中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用[16]。Levy等[17]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種TMV后，煙草接種葉和上位葉中N基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，分別增至接種前的38倍和165倍，而接種馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）后其轉(zhuǎn)錄水平無變化，表明TMV侵染可特異地誘導(dǎo)N基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)。更深入的研究發(fā)現(xiàn)，N基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)需要同時(shí)具備兩個(gè)要素，即TMV的侵染復(fù)制和一定時(shí)段的低溫處理（20℃，2～6 h）。只有低溫處理達(dá)到一定閾值后，N基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物積累到某種程度后，植物才會(huì)誘發(fā)產(chǎn)生HR。煙草對(duì)TMV的完全抗性需要NS和NL的協(xié)同參與，缺少任何一種都導(dǎo)致轉(zhuǎn)N基因煙草不具備對(duì)TMV的完全抗性[12]。

3　煙草N基因介導(dǎo)的抗TMV信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)制

植物利用其自身的R基因抵御病原物入侵這一過程大致分為病原物的識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和防衛(wèi)反應(yīng)3個(gè)階段。煙草N基因介導(dǎo)的TMV抗性也不例外。目前，多個(gè)與N基因介導(dǎo)的抗TMV信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因得到相繼鑒定與分離，一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的模型或假設(shè)也在此基礎(chǔ)上逐漸形成。

3.1N蛋白與其無毒因子p50的互作

目前，N蛋白是否可直接結(jié)合其無毒因子p50還存在爭(zhēng)議。2006年Ueda等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，（1）p50可直接結(jié)合N蛋白；（2）兩者互作需要ATP的參與，即ATP需先與N蛋白形成ATP/N蛋白復(fù)合體；（3）N蛋白具有ATP酶活性，而p50可以提高該活性。N蛋白在ATP存在的條件下，其自身可產(chǎn)生分子內(nèi)或分子間的互作，而p50可干擾該互作過程。因此，推測(cè)N蛋白可與ATP形成復(fù)合體，p50與之互作后提高了N蛋白的ATP水解活性，導(dǎo)致ADP/N蛋白復(fù)合體構(gòu)象改變，從而加速了其與下游信號(hào)因子的互作。Burch-Smith等[14]認(rèn)為，N蛋白通過其TIR結(jié)構(gòu)與p50在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生間接地相互作用，p50與N不能直接結(jié)合，還需要植物中其他輔助因子的參與。

3.2參與N基因介導(dǎo)的抗TMV過程中的植物蛋白因子

盡管N蛋白與p50是否直接互作還存在不同觀點(diǎn)，但目前研究表明，絕大多數(shù)R蛋白是借助植物中的其他輔助因子間接識(shí)別其Avr蛋白的[14]。這種觀點(diǎn)與“防衛(wèi)假說”（guard hypothesis）基本一致。防衛(wèi)假說認(rèn)為，在病原物建立侵染的過程中，Avr蛋白引起了寄主植物中某種蛋白的變化（該蛋白通常情況下可受Avr的招募）。植物R基因可通過監(jiān)控植物自身蛋白或蛋白復(fù)合物的變化，間接地識(shí)別Avr或病原[9]。目前，從煙草中分離到的參與N介導(dǎo)的抗TMV反應(yīng)的蛋白因子包括激酶、轉(zhuǎn)錄因子、熱擊蛋白和一些生物酶等。

3.2.1NRIP 1NRIP1（N receptor-interacting protein 1）是利用酵母雙雜交方法鑒定得到的一種與N蛋白的TIR結(jié)構(gòu)域和p50均產(chǎn)生相互作用的硫氰酸酶（硫轉(zhuǎn)移酶）。沉默該基因后，N基因介導(dǎo)的TMV抗性受到一定程度的削弱。NRIP1通常定位于葉綠體，p50改變了它的定位，使之在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中也有分布。在p50存在的條件下NRIP1才與N結(jié)合。推測(cè)NRIP1在受到p50的招募后，部分蛋白的定位發(fā)生改變，與p50形成蛋白復(fù)合體，而后該復(fù)合體被N蛋白識(shí)別，激活了抗病的信號(hào)傳導(dǎo)過程[19]。

3.2.2SPL6SPL6（squamosa promoter binding

protein-like 6）是一個(gè)含有保守的SBP（squamosa promoter binding protein）結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，在Avr基因p50存在的條件下，SPL1與N蛋白在核小體內(nèi)互作。N蛋白NBS結(jié)構(gòu)域中的P-loop區(qū)是ATP結(jié)合位點(diǎn)，該區(qū)段對(duì)N的抗TMV能力和維持N-NbSPL6的互作十分關(guān)鍵，但該區(qū)域的突變不影響N-p50的結(jié)合，因此推測(cè)N蛋白與ATP的結(jié)合對(duì)N-NbSPL6十分重要。利用病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（virus-induced gene silencing，VIGS）試驗(yàn)表明N基因介導(dǎo)的TMV抗性需要SPL6的參與，沉默該基因后植株對(duì)TMV的抗性減弱[20]。核定位的RPS4介導(dǎo)的抗病過程需要SPL6的參與，而細(xì)胞膜定位的RPM1和RPS2介導(dǎo)的抗病過程則不需要SPL6的參入。因此推測(cè)，SPL6正向調(diào)控了兩種不同的TIR-NBS-LRR類R基因抗性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[20]。

3.2.3Rar1、EDS1和NRP1/NIM1Rar1、EDS1 和NRP1/NIM1是已被鑒定的參與R或水楊酸介導(dǎo)的抗病反應(yīng)的基因。Rar1是含有兩個(gè)串聯(lián)的CHORD（cysteine-and histidine-rich domains）鋅指結(jié)構(gòu)的鋅離子結(jié)合蛋白，最早從大麥中獲得，參與大麥多個(gè)R基因介導(dǎo)的白粉病抗性和調(diào)控侵染細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的積累[21]。EDS1（enhanced disease susceptibility 1）是擬南芥中報(bào)道的一個(gè)類脂肪水解酶基因，該基因參與多個(gè)TIR-NBS-LRR類基因（RPS4、SNC1和RPS6等）介導(dǎo)的抗卵菌過程[22]，其缺失突變體的抗病性明顯降低。NPR1/NIM1 （nonexpressor of PR genes 1/noninducible immunity 1）是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)蛋白，該蛋白正向調(diào)控抗病基因的表達(dá)，參與水楊酸介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性SAR[23]。為確定Rar1、EDS1和NRP1/NIM1在N介導(dǎo)的抗TMV信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的作用，利用VIGS分別沉默含N基因本生煙中的NbRar1、NbEDS1 和NbNRP1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙草的抗TMV能力均受到不同程度的削弱，表明三者均參與N介導(dǎo)的抗TMV信號(hào)傳導(dǎo)路徑[5]。

3.2.4SGT1、Hsp90和COP9蛋白互作方面的研究發(fā)現(xiàn)，Rar1可直接結(jié)合SGT1和Hsp90。SGT1 （suppressor of G2 allele of Skp1）是細(xì)胞中一種特殊的SCF連接酶E3復(fù)合體的組分。以本生煙為試驗(yàn)材料發(fā)現(xiàn)，NbRar1、NbSGT1同時(shí)與參與泛素-蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白降解過程的COP9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體（COP9 signalosome，CSN）在體內(nèi)產(chǎn)生互作，形成NbRar1-NbSGT1-COP9復(fù)合體。VIGS試驗(yàn)表明，沉默NbSKP1、NbSGT1、COP9信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體的亞基NbCSN3和NbCSN8，N基因介導(dǎo)的TMV抗性減弱，表明三者均參與了該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，同時(shí)也意味著該抗病過程涉及蛋白的泛素化[24]。

Hsp90是真核生物細(xì)胞中普遍存在且高度保守的依賴ATP的分子伴侶，它參與細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)過程，具有重要的生理功能。當(dāng)NbRar1與Hsp90互作時(shí)，由于Hsp90可直接結(jié)合N蛋白，因此形成N-Hsp90-NbRar1-NbSGT1復(fù)合體。VIGS試驗(yàn)也證實(shí)沉默Hsp90導(dǎo)致N基因介導(dǎo)的TMV抗性減弱，表明Hsp90參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[24,25]。

3.2.5MAPK級(jí)聯(lián)系統(tǒng)N基因介導(dǎo)的抗TMV信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程涉及蛋白可逆磷酸化。利用蛋白酶抑制劑進(jìn)行藥理學(xué)研究表明，一些激酶和磷酸酶參與對(duì)TMV的防御反應(yīng)[26]。TMV侵染含N基因煙草后導(dǎo)致兩種分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）的激活，分別是48 kDa的水楊酸誘導(dǎo)蛋白激酶（salicylic acid-induced protein kinase，SIPK）和 44 kDa的傷誘導(dǎo)蛋白激酶（wound-induced protein kinase，WIPK）。其中，TMV對(duì)WIPK的激活依賴于N蛋白，而不依賴于水楊酸。TMV侵染所造成的WIPK在轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)和蛋白水平的激活通常是系統(tǒng)性的。WIPK也是SIPK的激活對(duì)象[27]。NtMEK2是位于兩激酶上游的MAPK，它能激活后兩者的活性。表達(dá)SIPK/WIPK 或 單 獨(dú) 表 達(dá) 組 成 型 NtMEK2 （NtMEK2DD）均可引起類似HR的細(xì)胞死亡。采用VIGS技術(shù)抑制這3個(gè)MAPK的表達(dá)，均能有效地削弱N基因介導(dǎo)的TMV抗性[28,29]。SIPK和WIPK的活化可進(jìn)一步激活某些WRKY轉(zhuǎn)錄因子活性，從而導(dǎo)致含有W-box順式元件抗病基因的上調(diào)。推測(cè)NtMEK2-SIPK/WIPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能通過激活一些WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游抗病基因表達(dá)，在N基因介導(dǎo)的抗性過程中發(fā)揮正向調(diào)控作用[30]。

Hsp90、MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)和線粒體失活均與TMV引起的HR反應(yīng)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在植物中沉默Hsp90或抑制Hsp90的活性，只削弱了由p50誘發(fā)的HR，而對(duì)NtMEK2或Bax過表達(dá)導(dǎo)致HR無影響。抑制Hsp90也降低了NtMEK2、WIPK和SIPK的活力。缺失WIPK和SIPK，削弱了p50和NtMEK2誘發(fā)的HR反應(yīng)。這表明Hsp90位于MAPK級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的上游。因此，在N基因介導(dǎo)的抗病過程中，抗病信號(hào)按照Hsp90-MAPKs-線粒體失活的順序向下游傳遞最終引起了細(xì)胞死亡[31]。

3.2.6NbCRT2、NbCRT3、NbERp57和NbP52009 年Caplan等[32]利用雙向電泳和iTRAQ技術(shù)，分析了TMV侵染前后煙草中的表達(dá)差異蛋白，發(fā)現(xiàn)病毒侵染后的上調(diào)蛋白多是細(xì)胞質(zhì)分子伴侶和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶。沉默內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的硫鍵異構(gòu)酶基因NbERp57、NbP5和鈣網(wǎng)蛋白基因 NbCRT2和NbCRT3均導(dǎo)致抗TMV能力的部分喪失。NbCRT2 和NbCRT3在一個(gè)類誘導(dǎo)受體激酶IRK表達(dá)中發(fā)揮作用，后者則是一個(gè)定位于細(xì)胞膜的激酶，在N介導(dǎo)的超敏反應(yīng)、細(xì)胞程序性死亡和TMV抗性所需。這些數(shù)據(jù)表明定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶也參與N介導(dǎo)的TMV抗病反應(yīng)[32]。

3.2.7WRK類傷誘導(dǎo)受體蛋白激酶（wound-induced receptor-like protein kinase，WRK）是煙草中分離得到的一個(gè)在依賴N基因的過敏性細(xì)胞死亡過程的早期階段上調(diào)表達(dá)的基因，該基因編碼一個(gè)富LRR結(jié)構(gòu)的類受體激酶，具有谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶活性。該基因的表達(dá)受損傷的誘導(dǎo)，具有溫敏特性[33]。沉默WRK導(dǎo)致SIPK和WIPK的活力下降。推測(cè)WRK在SIPK和WIPK的上游發(fā)揮作用，參與損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，該基因在N介導(dǎo)的TMV抗性過程中的作用還需進(jìn)一步研究[34]。

3.3N基因介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型

2013年Dinesh-Kumar課題組[20]綜合多年的研究結(jié)果，提出了N基因介導(dǎo)的TMV識(shí)別過程及下游抗病基因誘導(dǎo)過程。在TMV未侵染的細(xì)胞中，N蛋白（或借助寄主蛋白）處于活性被抑制的狀態(tài)，分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。NRIP1定位于葉綠體中，核內(nèi)的N蛋白并未與SPL6結(jié)合。當(dāng)TMV通過機(jī)械損傷進(jìn)入植物體內(nèi)后，病毒在細(xì)胞質(zhì)中脫殼，進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。病毒126 kDa的復(fù)制酶或p50激發(fā)子引起了NRIP1的重新定位，NRIP1與p126 或p50結(jié)合后，被細(xì)胞質(zhì)中的N蛋白識(shí)別，三者形成NRIP1-p50-N復(fù)合體。隨著三者的結(jié)合，p50引起了N蛋白構(gòu)象上的變化（該變化可能需要ATP結(jié)合或水解）。結(jié)合ATP的N蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與SPL6互作從而激活了下游抗性基因的表達(dá)。另一種可能是，在NRIP1-p50-N復(fù)合體形成后，N蛋白利用LRR區(qū)域與p50形成次級(jí)結(jié)合，釋放出TIR-NBS區(qū)段以提高核酸結(jié)合能力，促成N蛋白的聚合。該聚合過程不排除其他寄主蛋白的協(xié)助。聚合且處于激活狀態(tài)的N蛋白進(jìn)入核內(nèi)，與SPL6結(jié)合，引起下游基因的表達(dá)。

另外一種N基因介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程涉及Hsp90和MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)。TMV p50激活N基因的表達(dá)后，N通過某種機(jī)制將信號(hào)傳遞給Hsp90，Hsp90進(jìn)而通過MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)放大信號(hào)，導(dǎo)致線粒體的機(jī)能失調(diào)，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡[31]。或通過該途徑激活某些參與抗病過程的WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，由WRKY誘導(dǎo)或上調(diào)抗病基因的表達(dá)水平，引起植物的抗病反應(yīng)[30]。

4　問題與展望

近年來，N基因介導(dǎo)的TMV信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制研究取得了很大進(jìn)展，一些參與該過程的基因被分離并得以鑒定。但由于該過程涉及多個(gè)通路、多個(gè)細(xì)胞器和眾多蛋白復(fù)合體的參與，還有很多問題懸而未決，闡明其抗病機(jī)理尚需大量深入細(xì)致的研究。TMV寄主廣泛，能夠侵染200多種植物，不僅嚴(yán)重危害煙草的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，也是其他蔬菜類作物，尤其是茄科、葫蘆科等經(jīng)濟(jì)作物的重要病原，造成的經(jīng)濟(jì)損失十分重大。在目前已發(fā)現(xiàn)的抗TMV基因中，N基因介導(dǎo)的抗性最廣泛且最有效。如何高效利用N基因是研究人員亟待解決的問題。

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The Tobacco N Gene and the Signal Transduction of N-mediated TMV Resistance

WANG Qian,LIU Guanshan*
(Tobacco Research Institute,ChineseAcademy ofAgricultural Sciences,Qingdao 266101,China)

Tobacco N gene,cloned from wild tobacco Nicotiana glutinosa,confers resistance to tobacco mosaic virus(TMV)by recognizing the helicase domain of 126 kDa TMV replicase and triggering the hypersensitive reaction at the infection site in plants. The N-TMV interaction is one of the earliest and most studied models of plant-pathogen interaction.Here,we review the isolation, expression,protein structure-function analysis of N gene and the current understanding of the N-mediated signal transduction and other aspects.

N gene;tobacco;TMV;signal transduction

S572.03

1007-5119（2016）03-0093-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.03.016

中國(guó)煙草總公司基因組重大專項(xiàng)項(xiàng)目[110201301005（JY-05）]

王倩（1984-），副研究員，主要從事煙草突變體研究。E-mail：wangqian01@caas.cn。*通信作者，Email:liuguanshan@caas.cn

2016-05-15

2016-06-23