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    生命細(xì)胞微觀世界的觀察和探索
    ——TXM顯微成像

    2016-02-05 07:21:05王聲翔馮大敏潘志云王大江韋世強(qiáng)
    科學(xué)中國人 2016年36期
    關(guān)鍵詞:襯度尼克顯微鏡

    王聲翔,馮大敏,潘志云,王大江,韋世強(qiáng)

    中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)國家同步輻射實(shí)驗(yàn)室

    生命細(xì)胞微觀世界的觀察和探索
    ——TXM顯微成像

    王聲翔,馮大敏,潘志云,王大江,韋世強(qiáng)

    中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)國家同步輻射實(shí)驗(yàn)室

    生命世界是非常神奇的,并令人震撼。自從人類進(jìn)化到會出使用工具的技能,就永不停止地對生命活動進(jìn)行探索和研究。隨著科技的進(jìn)步和文明的發(fā)展,對生命的研究也逐步從觸手可及的宏觀世界進(jìn)入未知的微觀世界。眾所周知,細(xì)小到微米尺度的細(xì)胞是生命組成的基本單位,各種不同的細(xì)胞聚集在一起,再通過復(fù)雜有規(guī)律地的連接聚集成一個鮮活的生命體。生命就象像是一部獨(dú)特精密的“機(jī)器”,能說會動卻也有生銹的時候,有獨(dú)特的思想和性格卻也總會發(fā)生變化。顯微成像就是能直接觀察生命細(xì)胞的一種技術(shù),它在生命科學(xué)和生命技術(shù)的進(jìn)步中一直發(fā)現(xiàn)和見證生命的奇跡。

    在人類認(rèn)識生命細(xì)胞及其活動的過程中,顯微鏡一直是科學(xué)家觀察微觀生物世界的眼睛。1665年羅伯特·胡克,第一次用顯微鏡發(fā)現(xiàn)了植物細(xì)胞。自此,科學(xué)家通過對光學(xué)顯微鏡的改良和使用,陸續(xù)發(fā)現(xiàn)其他生物體細(xì)胞的存在,觀察到細(xì)胞分裂現(xiàn)象,建立了細(xì)胞學(xué)說,也論證了整個生物界在結(jié)構(gòu)上的統(tǒng)一性以及生命在演化上的共同起源。1931年,恩斯特·魯斯卡和克斯·克諾爾研制了世界上第一臺透射電子顯微鏡,并最先應(yīng)用在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域。由于電子顯微鏡具有高分辨能力,可以看見細(xì)胞中的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及發(fā)現(xiàn)病毒。在后續(xù)研究中幾乎所有致病病毒的發(fā)現(xiàn)和認(rèn)證都依賴于電子顯微成像技術(shù)的運(yùn)用,如1970年英國學(xué)者戴恩等在電子顯微鏡下觀察到的乙肝病毒顆粒。這些在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的探索,每一次新發(fā)現(xiàn)都是激動人心的,無疑對疾病的診斷和防治提供了非常重要的依據(jù)。

    電子顯微鏡成像技術(shù)的發(fā)展,使我們可以看見細(xì)胞內(nèi)部未知的世界。然而還有很多艱難的科學(xué)任務(wù)擺在我們面前,現(xiàn)代生物學(xué)研究對納米分辨顯微成像技術(shù)也提出了更高的要求。毫無疑問,三維成像技術(shù)的實(shí)現(xiàn)是顯微成像技術(shù)發(fā)展的必然趨勢之一。對于細(xì)胞而言,三維成像技術(shù)無論在對細(xì)胞本身定性定量的分析還是在成果說明與知識傳播中都有重大的意義。如今,各類光學(xué)顯微鏡因?yàn)槭芟抻谘苌錁O限,空間分辨率低,難以看清亞細(xì)胞結(jié)構(gòu);而電子顯微鏡受限于電子的低穿透力,只能對先對細(xì)胞進(jìn)行切片,然后每張薄片分別進(jìn)行成像,拼湊出三維圖像。這個過程在操作上十分困難,并且切割細(xì)胞無疑會對亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不可挽回的傷害,造成信息的缺失。

    透射X射線顯微鏡(Transmission X-ray Microscope,TXM)的出現(xiàn)為顯微成像開辟了一條全新的路徑。由于X射線的波長遠(yuǎn)小于可見光的波長,X射線成像的空間分辨能力遠(yuǎn)強(qiáng)于可見光成像;同時X射線具有很強(qiáng)的穿透能力,可以穿透完整的細(xì)胞。TXM成像時,通過旋轉(zhuǎn)樣品臺,系統(tǒng)采集從0°到180°包含X射線衰減信息的二維投影圖像,最后利用CT重建技術(shù),完成對完整細(xì)胞的高分辨無損三維顯微成像,這無疑對細(xì)胞生物學(xué)的研究有巨大的推動作用。

    圖1 細(xì)胞軟X射線成像三維渲染圖

    其中,能量范圍在284~543 eV之間的軟X射線具有特殊的物理性質(zhì)。此時,蛋白質(zhì)等生物樣品對X射線的吸收系數(shù)比水對X射線的吸收系數(shù)高一個數(shù)量級。利用這一天然的優(yōu)勢,軟X射線可以對含水細(xì)胞進(jìn)行成像研究,軟X射線“水窗”成像也因此得名。2004年美國ALS同步輻射光源C.A.Larabell研究小組,使用軟X射線透射顯微鏡首次對5微米的完整含水酵母細(xì)胞實(shí)現(xiàn)60納米分辨的三維成像(圖1),獲得了細(xì)胞核、液泡、囊泡等幾種重要的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)信息。為此,著名的成像專家David Attwood在2006年Nature 442,642-643上發(fā)表評論指出:“納米分辨CT時代已經(jīng)到來”。

    圖2 正常肝細(xì)胞和乙肝病毒感染后肝細(xì)胞X射線對照圖

    隨著設(shè)備的改進(jìn)和實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新,軟X射線三維顯微成像在細(xì)胞生物學(xué)研究中的重要性日益顯著,西班牙科學(xué)家利用冷凍軟X射線成像對乙肝病毒感染細(xì)胞(ACS Nano 2016,10,6597?6611)。這一生物學(xué)問題進(jìn)行研究。如圖2所示A、E分別是光學(xué)顯微鏡下的正常肝細(xì)胞和被感染的肝細(xì)胞。B、F是經(jīng)過重構(gòu)后的一些列軟線三維成像圖中的一張截面圖,C、G分別是B、F區(qū)域位置的三維渲染圖。實(shí)驗(yàn)樣品不需要任何染色和化學(xué)試劑固定處理,即可清晰的觀察細(xì)胞受感染前后亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。

    硬X射線是指能量范圍在1keV到十幾keV的X射線。由于硬X射線穿透能力很強(qiáng),細(xì)胞完全被穿透對X射線吸收較少,以至于采集的細(xì)胞吸收投影圖像襯度較低,需要對細(xì)胞進(jìn)行重金屬染色來增加吸收襯度。圖3是我們在硬X射線透射顯微鏡下對30微米尺寸大小的水稻花粉進(jìn)行內(nèi)部結(jié)構(gòu)解析的三維分割渲染圖,據(jù)此可分辨出花粉線粒體、油滴、液泡、細(xì)胞核等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),分別用藍(lán)色、綠色、黃色和黑色標(biāo)記。

    圖3 水稻花粉細(xì)胞三維渲染圖

    雖然軟X射線和硬X射線顯微成像都可以進(jìn)行細(xì)胞三維成像研究,但是由于其本身的物理性質(zhì),使其各自都有較為明顯的實(shí)驗(yàn)限制。軟X射線透射顯微鏡可以對自然狀態(tài)細(xì)胞進(jìn)行成像研究,最真實(shí)的解析細(xì)胞內(nèi)的秘密,但是軟X射線成像的焦深比較小,難以對直徑10微米以上的細(xì)胞實(shí)現(xiàn)完整細(xì)胞的納米分辨三維成像。硬X射線透射顯微鏡具有很大的焦深,可以對絕大多數(shù)細(xì)胞成像,但是吸收襯度較低,必須對細(xì)胞進(jìn)行染色等處理以提高襯度,樣品處理的難度較大,且會在一定程度上破壞細(xì)胞的自然狀態(tài)。迄今為止,對大多數(shù)含水細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行完整的納米分辨三維成像,仍然是一個懸而未決的世界性難題。我們課題組向著繪制細(xì)胞圖譜的前進(jìn)方向,從X射線成像理論和實(shí)驗(yàn)方法學(xué)兩個方向努力研究,發(fā)明了中能(2~2.5 keV)X射線澤尼克相襯顯微鏡。

    中能(2~2.5 keV)X射線澤尼克相襯顯微鏡(圖4)是在改變能量適用范圍的前提下,在原來X射線透射顯微鏡中引入澤尼克相襯,主要是在物鏡波帶片下游放置相移環(huán),用以提取樣品的相位襯度,將相襯信號轉(zhuǎn)化為光強(qiáng)信號。中能X射線澤尼克相襯顯微成像方法將在細(xì)胞納米分辨三維成像中發(fā)揮難以替代的作用。

    首先,中能(2~2.5 keV)澤尼克相位襯度與“水窗”范圍內(nèi)的吸收襯度相當(dāng),對亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)有很高的分辨能力。其次,由于軟X射線的穿透能力很弱,輻射劑量隨細(xì)胞尺寸的增加而急劇上升。對于520 eV的軟X射線,當(dāng)細(xì)胞大小為5微米時,輻射劑量僅有3.16×107Gy;當(dāng)細(xì)胞大小增加到20微米時,輻射劑量急劇增加到8.77×109Gy,是5微米大小細(xì)胞的277倍!在中能(2~2.5 keV)附近,輻射劑量隨細(xì)胞尺寸的變化非常不敏感。尺寸為5微米的細(xì)胞,輻射劑量僅僅為8.75×106Gy。隨著細(xì)胞尺寸增加到20微米,輻射劑量也只有1.1×107Gy。進(jìn)一步的計(jì)算表明,即使細(xì)胞尺寸增加到40微米,輻射劑量也只有2.5×108Gy,不會對冷凍細(xì)胞樣品造成明顯的結(jié)構(gòu)和功能損傷。這是因?yàn)?.5 keV中能X射線在20-40微米尺寸細(xì)胞中具有相當(dāng)高的透過率。最后,與“水窗”軟X射線顯微鏡相比,中能X射線澤尼克相襯顯微鏡的另一個優(yōu)勢是其擴(kuò)展的焦深,在30納米空間分辨率下,中能X射線顯微鏡具有15~25微米的焦深。這么大的焦深能夠?qū)崿F(xiàn)對更多種類的完整真核細(xì)胞的三維斷層成像,擴(kuò)大了TXM在細(xì)胞成像上的應(yīng)用空間,非常適合于完整真核細(xì)胞的納米分辨三維結(jié)構(gòu)成像。獲得細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的三維空間分布信息,將成為繪制細(xì)胞圖譜的重要利器,對生物學(xué)研究的意義十分重大。

    探索未知生命世界的腳步永不停歇,顯微技術(shù)的發(fā)展如同科學(xué)巨人的手臂,不可或缺。21世紀(jì)我們的使命嚴(yán)峻且神圣,努力終究會獲得成就,探索終究會發(fā)現(xiàn)奇跡。讓我們共同去見證生命世界的神奇,為人類發(fā)展貢獻(xiàn)出一份微薄之力。

    圖4 中能X射線澤尼克相襯顯微鏡

    王大江,博士,中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)國家同步輻射實(shí)驗(yàn)室職工。主要研究領(lǐng)域:X射線成像理論及應(yīng)用,計(jì)算機(jī)數(shù)值模擬和圖像處理等。

    王大江。

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