α-硫辛酸對動脈粥樣硬化易損斑塊穩(wěn)定性的影響

王瑩，王恩，王鳳，羅華榮，李衛(wèi)玲，李彩

（臺州醫(yī)院，浙江 臺州 317000，1.神經(jīng)內(nèi)科；2.病理科）

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α-硫辛酸對動脈粥樣硬化易損斑塊穩(wěn)定性的影響

王瑩1，王恩1，王鳳1，羅華榮2，李衛(wèi)玲1，李彩1

（臺州醫(yī)院，浙江 臺州 317000，1.神經(jīng)內(nèi)科；2.病理科）

目的：探討α-硫辛酸（α-LA）對動脈粥樣硬化（AS）易損斑塊穩(wěn)定性的影響。方法：28只健康雄性日本大耳白兔，用液氮凍傷術(shù)建立AS易損斑塊模型，隨機分為α-LA組和對照組。2組分別于模型建立后即刻給予等量α-LA和0.9%氯化鈉溶液注射，隔日1次，連用4周。4周后光鏡和電鏡觀察AS斑塊形成情況，免疫組織化學法檢測治療前后斑塊中血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的表達變化，硫代巴比妥酸法測定血清丙二醛（MDA）水平，羥胺法測定血清超氧化物歧化酶（SOD）活性，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、超敏C-反應(yīng)蛋白（hsCRP）及氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）水平的變化。結(jié)果：AS易損斑塊模型成功建立。2組大耳白兔易損斑塊處均有ICAM-1、VCAM-1及MCP-1蛋白的高表達，且α-LA組陽性細胞數(shù)和染色強度明顯低于對照組（P＜0.01）。治療4周后，α-LA組血清SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低（P＜0.01），2組血清MMP-9、hsCRP及ox-LDL含量均比治療初明顯降低（P＜0.01），但α-LA組與對照組比較降低更為顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：α-LA具有抗氧化應(yīng)激、降低炎癥因子水平和改善內(nèi)皮功能等作用，從而起到穩(wěn)定AS易損斑塊的作用。[關(guān)鍵詞]α-硫辛酸；動脈粥樣硬化；易損斑塊；氧化應(yīng)激；炎癥因子；兔

目前，急性心腦血管事件已成為危害人類健康的“頭號殺手”，其發(fā)病率、致殘率及病死率有逐年上升趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）易損斑塊的破裂及繼發(fā)的血栓形成是急性心腦血管事件最根本的始動因素[1]。研究還顯示，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷的重要原因之一，被認為是AS斑塊形成的中心環(huán)節(jié)[2]，而炎癥反應(yīng)參與了斑塊破裂的整個過程，是導(dǎo)致急性心腦血管事件發(fā)生的關(guān)鍵因素[3]。因此，改善機體氧化應(yīng)激和炎癥因子水平是防治AS易損斑塊破裂的有效措施之一。目前有關(guān)抗氧化劑α-硫辛酸（α-lipoic acid，α-LA）對AS易損斑塊影響的研究在國內(nèi)外鮮見報道。本研究通過建立AS易損斑塊模型，并對易損斑塊模型進行α-LA干預(yù)治療，觀察α-LA對AS易損斑塊穩(wěn)定性的影響，為臨床應(yīng)用α-LA治療急性心腦血管事件提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：健康雄性日本大耳白兔28只，兔齡3個月左右，體質(zhì)量1.8～2.2 kg，購自溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（浙）2006-0026。所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。實驗程序遵循動物保護和應(yīng)用條例。

1.1.2 主要試劑：α-LA注射液（150 mg/支，批準文號：國藥準字H20066706）由重慶藥友制藥有限公司生產(chǎn)；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、超敏C-反應(yīng)蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hsCRP）及氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）試劑盒購自南京建成生物有限公司；兔抗血管細胞黏附分子-1 （vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）單克隆抗體購自福建邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.2 方法

1.2.1 兔AS易損斑塊模型的制作：參照Fang等[4]的方法，以3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，分離右頸總動脈，血管夾暫時阻斷血流，1 mL注射器抽取0.9%氯化鈉溶液沖洗管腔，抽空血管腔，再以1 mL注射器抽取液氮快速注入右頸總動脈，反復(fù)3次以造成血管內(nèi)皮損傷。2組術(shù)后均以高脂飼料（含1%膽固醇、3%大油、15%蛋黃和81%普通飼料）喂養(yǎng)8周。8周后隨機處死2只兔，取出右頸總動脈以驗證AS斑塊形成。剩余兔再次按上述方法于右頸總動脈注入液氮，以誘發(fā)斑塊破裂，并再次隨機處死2只兔，取出右頸總動脈以驗證AS易損或破裂斑塊形成。

1.2.2 實驗分組及治療方法：AS易損斑塊模型建立后，剩余24只兔改為普通飼料喂養(yǎng)，隨機分為α-LA組和對照組，每組各12只。α-LA組以α-LA（5 mg/kg）皮下注射，對照組以等量0.9%氯化鈉溶液皮下注射，2組均隔日1次，連用4周。4周末，抽取兔靜脈血后以過量戊巴比妥鈉處死兔，取出右頸總動脈標本待測。

1.2.3 組織學及免疫組織化學檢測：AS斑塊模型取出的右頸總動脈用PBS清洗后固定于3%戊二醛溶液中，超薄組織切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染色，JEM-1230透射電鏡觀察AS斑塊形成情況。AS易損斑塊模型及治療4周后取出的右頸總動脈，PBS沖洗后用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，連續(xù)切片（4 μm），分別予HE染色及免疫組織化學染色，光鏡觀察AS易損斑塊形成及炎性因子表達情況。免疫組織化學SP法測定ICAM-1、VCAM-1及MCP-1蛋白表達，DAB顯色，棕黃色顆粒狀產(chǎn)物為陽性標記。具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。

1.2.4 生化指標的檢測：治療前及治療4周后分別抽取各組兔耳緣靜脈血2 mL，離心分離血清，硫代巴比妥酸比色法（TBA）測定血清MDA含量，羥胺法測定血清SOD活性，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清MMP-9、hsCRP及ox-LDL含量。具體操作步驟參照試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。所有計量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用雙因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 AS斑塊及易損斑塊模型的鑒定 AS斑塊模型建立8周后，透射電鏡顯示右頸總動脈內(nèi)膜呈斑塊狀增生，內(nèi)彈力層增厚、變性，平滑肌細胞排列紊亂且空泡變性，膠原纖維增多，中層脂滴，可見凋亡小體和核固縮，見圖1。AS易損或破裂斑塊HE染色后，光鏡下可見斑塊肩部或纖維帽破裂，破裂斑塊附近發(fā)現(xiàn)有血栓形成，并可見膽固醇結(jié)晶及較大的脂質(zhì)核心或壞死核心，較多的炎性細胞浸潤，見圖2。

圖1 AS斑塊模型建立8周后兔右頸總動脈透射電鏡表現(xiàn)（×8 000）

圖2 AS易損或破裂斑塊模型HE染色后兔右頸總動脈光鏡表現(xiàn)（×200）

2.2 免疫組織化學檢測結(jié)果 免疫組織化學染色結(jié)果顯示，2組兔右頸總動脈斑塊處均有ICAM-1、VCAM-1及MCP-1蛋白的表達，其中ICAM-1和VCAM-1陽性細胞為胞膜和胞漿表達（見圖3-4），MCP-1陽性細胞為胞漿表達（見圖5），且α-LA組ICAM-1、VCAM-1 及MCP-1陽性細胞數(shù)和染色強度均明顯低于對照組（分別為4.26±1.23 & 18.71±3.45，6.59±2.32 & 17.80±3.03，2.47±1.15 & 14.38±4.38，P＜0.01）。

圖3 治療4周后ICAM-1免疫組織化學染色結(jié)果（DAB顯色，×200）

圖4 治療4周后VCAM-1免疫組織化學染色結(jié)果（DAB顯色，×100）

圖5 治療4周后MCP-1免疫組織化學染色結(jié)果（DAB顯色，×200）

2.3 生化指標檢測結(jié)果 治療4周后對照組血清SOD、MDA無明顯變化（P＞0.05），α-LA組血清SOD活力明顯升高，MDA含量明顯下降（P＜0.01），且與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表1。治療4周后，α-LA組血清MMP-9、hsCRP及ox-LDL水平均比治療前明顯降低（P＜0.01），對照組4周后也比治療前有所降低（P＜0.05），但α-LA組比對照組降低更為顯著，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 治療前后2組血清SOD、MDA水平的變化（n=12，±s）

表1 治療前后2組血清SOD、MDA水平的變化（n=12，±s）

與α-LA組治療前比：aP＜0.01；與對照組治療后比：bP＜0.01

表2 治療前后2組血清MMP-9、hsCRP及ox-LDL水平的變化（n= 12，±s）

3 討論

目前認為，血管內(nèi)皮損傷是AS斑塊形成的始動因素，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是AS斑塊發(fā)生發(fā)展的核心機制，其中氧化應(yīng)激是內(nèi)皮功能障礙和AS斑塊形成的共同機制[5-6]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）及其修飾LDL形成的ox-LDL所致的內(nèi)皮損傷是高膽固醇血癥導(dǎo)致AS斑塊形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究通過液氮凍傷術(shù)結(jié)合高脂飼料喂養(yǎng)建立AS斑塊或易損斑塊模型，其機制正是AS斑塊形成之內(nèi)皮損傷學說和脂質(zhì)浸潤學說的體現(xiàn)[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，SOD和MDA是一對反映機體自由基損傷的重要指標，其中SOD活力可反映機體清除自由基的能力，其對機體氧化與抗氧化的平衡起著至關(guān)重要的作用[8]，而MDA可間接反映機體細胞氧自由基損傷程度。有效抑制機體氧化應(yīng)激，改善機體氧化、抗氧化能力，能保護血管內(nèi)皮功能，抑制AS斑塊的形成和發(fā)展。

研究已證實，炎癥反應(yīng)貫穿于AS發(fā)生、發(fā)展的始終。從最初的泡沫細胞和動脈硬化斑塊的形成到易損斑塊、斑塊的破裂和血栓形成均有炎癥因子的參與[9]。目前許多炎性標志物如CRP、MMPs、ICAM-1及VCAM-1等被確認為診斷易損斑塊的重要指標[10-11]。研究顯示，急性冠脈綜合征患者炎癥反應(yīng)顯著增高，其斑塊的不穩(wěn)定性也明顯增加，過度的炎癥反應(yīng)使斑塊出現(xiàn)破裂、出血，導(dǎo)致血栓形成。目前許多炎癥因子已成為動脈硬化的標志，用于不同階段危險性的評估和治療靶點[9]。所以，抑制CRP、MMPs、VCAM-1、ICAM-1等炎癥因子的活性可能成為治療急性冠脈綜合征的新途徑。α-LA是已知的天然抗氧化劑中抗氧化能力最強的一種，被譽為“萬能的抗氧化劑”，也是目前已知的唯一既可在水相又可在脂相中溶解的抗氧化劑。研究[12]表明，它能夠抑制脂質(zhì)過氧化、清除氧自由基、恢復(fù)和增加體內(nèi)其他抗氧化劑水平。α-LA正逐漸用于高血壓、糖尿病等與氧化應(yīng)激有關(guān)的疾病治療中，在抗氧化領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

本研究發(fā)現(xiàn)，由于AS斑塊破裂，早期氧化應(yīng)激和炎癥因子的釋放，斑塊處均有ICAM-1、VCAM-1及MCP-1蛋白的高表達，血清SOD活性明顯降低，MDA、MMP-9、hsCRP及ox-LDL含量明顯升高，與文獻[8，10-11]報道的一致。α-LA治療4周后，斑塊處ICAM-1、VCAM-1 及MCP-1陽性細胞數(shù)和染色強度顯著降低，血清SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，且血清MMP-9、hsCRP及ox-LDL含量也明顯下降，說明α-LA具有抗氧化應(yīng)激、降低炎癥因子水平和改善內(nèi)皮功能等作用，從而起到穩(wěn)定AS易損斑塊的作用。

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（本文編輯：趙翠翠）

The effects of alpha lipoic acid on the stability of the atherosclerotic vulnerable plaques

WANG Ying1, WANG En1, WANG Feng1, LUO Huarong2, LI Weiling1, LI Cai1.
1.Department of Neurology, Taizhou Hospital, Taizhou, 317000; 2.Department of Clinical Laboratory, Taizhou Hospital, Taizhou, 317000

Objective: To discuss the effects of alpha lipoic acid on the stability of the vulnerable plaques.Methods: Atherosclerotic vulnerable plaques model were set up by liquid nitrogen frostbite in 28 health male Japanese big ear rabbits.The rabbits were randomly divided into 2 groups: Alpha lipoic acid (α-LA) group and the control group.The 2 groups were given equal amounts of α-LA and normal saline injection 1 time every 2 days for 4 weeks immediately after establishment of atherosclerotic vulnerable plaques model.Four weeks after treatment, the AS plaque was observed under the light microscope and electron microscope.The expression of vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1), intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) and monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) were detected with immunohistochemical method before and after treatment.The serum malondialdehyde (MDA) was determined with the glucosinolates barbituric acid method, the serum superoxide dismutase (SOD) activity was determined with hydroxylamine method, and the expression of serum matrix metalloproteinases 9 (MMP-9), hypersensitive c-reactive protein (hsCRP) and oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) were determined with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) before and after treatment.Results: There was expression of ICAM-1, VCAM-1 and MCP-1 protein on atherosclerotic vulnerable plaque.The positive cells number and staining intensity in α-LA group were signifi cantly reduced than that in the control group.The serum SOD was obviously higher and MDA significantly lower in α-LA group 4 weeks after treatment (P＜0.01).The expression of MMP-9, hsCRP and ox-LDL was signifi cantly lower than that at the beginning of treatment in two groups (P＜0.01), but the α-LA group decreased signifi cantly compared with the control group (P＜0.05).Conclusion: α-LA has the function of the resistance to oxidative stress and infl ammation, thus it can protect vascular intima, and it can stabilize the atherosclerotic vulnerable plaques.

alpha lipoic acid; atherosclerosis; vulnerable plaques; oxidative stress; infl ammatory cytokines; rabbits

R543

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.12.006

2016-01-11

臺州市科技計劃項目（2013A33457）。

王瑩（1979-），女，浙江臺州人，副主任醫(yī)師，碩士。