基因剪刀治療白血病的創(chuàng)新

李蕓蕓

英國倫敦大奧德蒙街醫(yī)院和倫敦大學(xué)學(xué)院兒童健康研究所的研究人員最近采用一種新的基因療法——分子剪刀（基因剪刀）來編輯基因，產(chǎn)生設(shè)計的免疫細胞，用來治療耐藥性的白血病（血癌），成功治愈了一名一歲大的白血病患兒。利用基因剪刀來治療罕見病、難治病，尤其是遺傳性疾病，是當(dāng)代醫(yī)學(xué)發(fā)展的一個方向。不過，基因療法有多種，僅僅是利用基因剪刀的方式就有多種。

基因剪刀修飾細胞

一歲的蕾拉·理查茲患有復(fù)發(fā)性急性淋巴細胞白血病，是一種難以治愈的白血病。盡管藥物化療能治愈一些白血病，但化療對于復(fù)發(fā)性急性淋巴細胞白血病還是束手無策。此前，蕾拉已經(jīng)接受過化療，但效果不佳，只能用姑息療法維持生命。在走投無路之時，大奧德蒙街醫(yī)院向蕾拉的父母提議可以試用新的基因療法，而且，這種療法已經(jīng)在小鼠身上進行過試驗，效果較好。

為了挽救女兒的生命，蕾拉的父母同意了。蕾拉的父母熱衷于嘗試新療法，蕾拉的媽媽莉莎說：“我們不想接受姑息治療，所以我們要求醫(yī)生為我們的女兒嘗試任何治療，哪怕是以前沒有嘗試過的?！倍遥委煼桨敢步?jīng)過了醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，并且由掌握這一特定基因修飾方式的法國Cellectis生物科技公司提供經(jīng)過基因修飾的T細胞。

由于蕾拉患復(fù)發(fā)性急性淋巴細胞白血病，體內(nèi)正常的免疫T細胞已經(jīng)很少，因此需要利用他人（供體）捐贈的健康T細胞。在利用之前，要對供體T細胞進行基因修飾，即用一種基因剪刀——轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）向健康的供體T細胞添加新的基因，將它們武裝起來對抗白血病。

TALEN是一種可靶向修飾特異基因序列的酶，它借助于TAL效應(yīng)子（一種由植物細菌分泌的天然蛋白）來識別特異性DNA堿基對。TAL效應(yīng)子可被設(shè)計來識別和結(jié)合所有的目的DNA序列。對TAL效應(yīng)子附加一個核酸酶就生成了TALEN。TAL效應(yīng)核酸酶可與DNA結(jié)合并在特異位點對DNA鏈進行切割，從而導(dǎo)入新的遺傳物質(zhì)（基因）。此前，TALEN的特異性切割活性在酵母、擬南芥、水稻、果蠅及斑馬魚等多個動植物體系和體外培養(yǎng)細胞中得到驗證。

利用TALEN對供體T細胞中的特定基因進行切割后會呈現(xiàn)兩種效應(yīng)。一是治療白血病的藥物不能損傷和殺滅基因修飾的T細胞，二是這種被修飾的T細胞被重新編程，因此，輸入蕾拉的體內(nèi)只是去殺滅其體內(nèi)病變的白細胞。這種被修飾的T細胞稱為UCART19細胞。

UCART19細胞由Cellectis公司研發(fā)，大奧德蒙街醫(yī)院的研究人員通過靜脈注射，用10分鐘的時間把1毫升的UCART19細胞注入了蕾拉的血流中。然后對蕾拉進行隔離，讓她不受感染，因為蕾拉的免疫系統(tǒng)非常虛弱。幾周后，蕾拉體內(nèi)的白血病細胞就明顯消失。

然而，這并非是治療的結(jié)束。輸入的UCART19細胞只是殺滅了蕾拉體內(nèi)的白血病細胞，下一步還需要接受骨髓移植來重建蕾拉被治療摧毀的整個造血和免疫系統(tǒng)。不過，經(jīng)檢查，蕾拉的骨髓細胞是健康的，血細胞計數(shù)也在恢復(fù)正常。未來就是要找到一位配型相同的供者，由其提供健康的骨髓，移植到蕾拉體內(nèi)以重建蕾拉的造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)。所以，僅從蕾拉是白血病基因療法世界第一例看，也不過是基因剪刀治療白血病的第一步成功，或成功了一半，即把患者體內(nèi)的白血病細胞清除掉。

多種基因剪刀治療多種疾病

在利用UCART19細胞治療白血病之前，采用另一種基因剪刀——鋅指核酸酶（ZFN）治療艾滋病也獲得了初步成功。

ZFN又名鋅指蛋白核酸酶，并非自然存在，而是一種人工改造的核酸內(nèi)切酶，由一個DNA識別區(qū)域和一個非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成，其中DNA識別區(qū)域有特異性，在DNA特定位點結(jié)合，而非特異性核酸內(nèi)切酶有剪切功能，兩者結(jié)合可在DNA特定位點進行定點切割。

美國加利福尼亞州Sangamo生物科學(xué)公司用ZFN對供體T細胞進行基因修飾，對T細胞上一個基因刪除和滅活，這個基因編碼的蛋白就是艾滋病病毒（HIV）進入T細胞的結(jié)合靶分子，即T細胞受體CCR5δ32。ZFN修飾CCR5δ32基因可使其縮短，并導(dǎo)致其有名無實，HIV就難以識別這個T細胞的蛋白分子（大門），從而無法入侵T細胞，由此可以治療艾滋病。

2014年，Sangamo公司的費奧多·烏爾諾夫研究小組對12名艾滋病患者試驗，輸入經(jīng)過基因編輯的健康供者的T細胞，有效地抑制了HIV入侵T細胞，有6名患者停止服用抗HIV的藥物，說明這種基因編輯療法初步體現(xiàn)了效果。由于有了初步結(jié)果，現(xiàn)在Sangamo公司正在擴大試驗，對70多名艾滋病患者試驗這種基因編輯療法。

受到這種基因編輯療法治療結(jié)果的鼓舞，Sangamo公司還在擴大基因療法的戰(zhàn)場。2015年10月，烏爾諾夫研究小組報告了他們用ZFN對猴子試驗治療血友病的結(jié)果。研究人員對15只猴子注射攜帶編碼ZFN基因和凝血IX因子基因的病毒，以治療血友病。白蛋白是肝臟大量合成的血液蛋白，ZFN能切割基因組中編碼白蛋白的基因，并將一個健康的凝血IX因子基因?qū)牖蚪M中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，猴子肝臟開始制造更多凝血IX因子，血液中凝血IX因子增加10%。

烏爾諾夫認為，利用ZFN和TALEN基因剪刀可以治療多種疾病。例如，白蛋白基因類似人類基因組的一個USB接口，在這個位置也可利用ZFN或TALEN基因剪刀插入其他基因以治療疾病。

不過，Sangamo公司利用基因剪刀治療血友病還未取得美國食品與藥物管理局（FDA）的許可證。2015年9月美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）一個委員會同意開展基因編輯治療的臨床研究，并可能對凝血IX因子基因治療開綠燈。現(xiàn)在Sangamo公司已經(jīng)向FDA提出申請，如果獲得FDA批準，臨床試驗可望在2016年展開。

更直接的基因編輯治療疾病

無論是利用ZFN，還是TALEN基因剪刀治療疾病，目前還只是在對T細胞的某種基因進行編輯、刪除以治療疾病，是一種間接的基因療法。更為直接的用基因剪刀切除致病基因的療法也在試驗之中，這就是名為CRISPRCas的基因剪刀。

CRISPR的全稱是，成簇的規(guī)律性間隔短回文重復(fù)序列，Cas則是指與CRISPR相關(guān)的基因。CRISPRCas技術(shù)是繼ZFN、胚胎干細胞（ES）打靶和TALEN等基因編輯技術(shù)后用于定點剪切、敲除特定基因的第四種方法，不僅可以用于治療疾病，還可能修改胚胎，創(chuàng)造新的物種，甚至創(chuàng)造“超人”。

現(xiàn)在，CRISPRCas治療疾病的一個試驗是治療β地中海貧血。美國加州大學(xué)舊金山分校的簡悅威教授及其同事在2014年8月5日的《基因組研究》發(fā)表文章稱，他們嘗試用CRISPRCas治療β地中海貧血獲得初步成功。β地中海貧血是由HBB基因突變引起的，會造成嚴重的血紅蛋白缺乏。全球每10萬人中有1人受到這種疾病的影響，目前還沒有能夠治愈β地中海貧血的辦法。

研究人員先將β地中海貧血患者的皮膚細胞（成纖維細胞）轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)的多能干細胞（iPSC），然后利用CRISPRCas編輯技術(shù)來糾正HBB特殊位點的DNA序列，即切割雙鏈DNA中HBB突變位點。然后，細胞自身會通過同源重組用正確的核苷酸序列修復(fù)DNA。經(jīng)過基因校正HBB突變之后的誘導(dǎo)的多能干細胞沒有檢測到脫靶效應(yīng)，細胞保持著完全的多能性，核型也很正常。

之后，研究人員把這些誘導(dǎo)的多能干細胞分化為紅細胞，結(jié)果紅細胞的HBB表達恢復(fù)正常。不過，要將CRISPRCas編輯技術(shù)真正用于臨床治療β地中海貧血，還有較長的路要走。

采用CRISPRCas編輯技術(shù)治療β地中海貧血的另一個思路和做法來自中國研究人員。中山大學(xué)的黃軍就等人，試圖用CRISPRCas9基因編輯技術(shù)對“不能存活”的胚胎（從當(dāng)?shù)厣吃\所獲得，無法生成活胎的胚胎）來改造β地中海貧血的基因HBB。研究小組將CRISPRCas9注入到86個胚胎中，結(jié)果顯示，有28個胚胎獲得了成功的拼接，替換了突變的HBB基因。

然而，這一研究引發(fā)了爭論。因為CRISPRCas尚不能完全準確剪切基因，所以有可能對胚胎造成傷害。因此，目前無論是利用CRISPRCas技術(shù)，還是ZFN、胚胎干細胞（ES）打靶，或是TALEN基因編輯技術(shù)，都局限在對細胞的基因編輯和敲除上，對于胚胎的基因敲除和剪切，風(fēng)險很大。而且，這也涉及定制人和重造物種，倫理爭論很大，法律管理也遠遠滯后。

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