懸浮培養(yǎng)技術(shù)在獸用疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用

嚴(yán)　石，黃文強(qiáng)，劉兆環(huán)，楊君敬，楊小蓉，陳秋閣，周蕾蕾（.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京豐臺(tái)00070；.乾元浩生物股份有限公司，北京豐臺(tái)00070）

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懸浮培養(yǎng)技術(shù)在獸用疫苗領(lǐng)域的應(yīng)用

嚴(yán)石1，黃文強(qiáng)1，劉兆環(huán)1，楊君敬1，楊小蓉1，陳秋閣2，周蕾蕾2
（1.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京豐臺(tái)100070；2.乾元浩生物股份有限公司，北京豐臺(tái)100070）

1　動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展歷史

細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物科學(xué)中發(fā)展較為迅速的一門實(shí)驗(yàn)技術(shù)，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也因此備受關(guān)注，其歷史可追溯到1907年，美國(guó)生物學(xué)家Harrison在無(wú)菌條件下，以淋巴液為培養(yǎng)基成功地在試管中培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)組織，創(chuàng)立了體外組織培養(yǎng)法［1］。1951年Earle等成功開(kāi)發(fā)出能促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。1957年Graff用灌注培養(yǎng)法懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，數(shù)量達(dá)到1×1010～2×1010個(gè)/L。1962年，Capstick等對(duì)BHK21細(xì)胞馴化實(shí)現(xiàn)懸浮培養(yǎng)［2］，并用于獸用疫苗生產(chǎn)［3］。1967年，Van Wezel開(kāi)發(fā)了微載體［4］并實(shí)現(xiàn)在生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。隨著細(xì)胞生物學(xué)、培養(yǎng)方法及培養(yǎng)工藝等領(lǐng)域的不斷豐富和完善，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已成為生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的方法，利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價(jià)值的酶、生長(zhǎng)因子、疫苗和單抗等，已成為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分。

2　懸浮培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)及核心要素

動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)有兩種類型：一類是貼壁依賴性細(xì)胞，另一類是非貼壁依賴性細(xì)胞。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)是非貼壁依賴性細(xì)胞的一種培養(yǎng)方式，細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中生長(zhǎng)或維持，規(guī)?？梢杂蓭咨踔翑U(kuò)大到幾千升，容器之間為管道化的連接，細(xì)胞在處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，輔助以通入CO2和空氣，以保證足夠的氣體交換及pH值的調(diào)節(jié)，通過(guò)震蕩或轉(zhuǎn)動(dòng)裝置使細(xì)胞始終分散懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。與傳統(tǒng)工藝相比其優(yōu)勢(shì)在于增加了單位體積細(xì)胞的數(shù)量，減少了污染細(xì)胞的機(jī)率，自動(dòng)化程度高，減少人為操作的因素，生物反應(yīng)器容積的放大，提升了生物制品的均一性，大大降低由接種疫苗導(dǎo)致的副反應(yīng)，免疫效果更為理想。對(duì)應(yīng)的技術(shù)包括懸浮細(xì)胞系篩選及馴化、最適細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇、生物反應(yīng)器的選擇、細(xì)胞培養(yǎng)工藝的選擇等核心要素。

2.1懸浮細(xì)胞系的篩選及馴化一種細(xì)胞在不同狀態(tài)下培養(yǎng)時(shí)對(duì)病毒的敏感性會(huì)有所差異，即便是同種細(xì)胞的不同克隆株之間對(duì)同一種病毒也會(huì)表現(xiàn)出不同的敏感性，因此在使用某種細(xì)胞系進(jìn)行大規(guī)模疫苗生產(chǎn)前首先要與準(zhǔn)備增殖的病毒進(jìn)行相互適應(yīng)性選擇，再根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性選擇易于生長(zhǎng)、放大的反應(yīng)器及培養(yǎng)工藝，原因是細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)前需要經(jīng)過(guò)馴化，馴化好的細(xì)胞再根據(jù)其不同生長(zhǎng)狀態(tài)去選擇適宜的反應(yīng)器與工藝。

細(xì)胞馴化的通用方法是逐步改變環(huán)境條件，待細(xì)胞適應(yīng)后再繼續(xù)改變條件，直至細(xì)胞能在特定的條件中穩(wěn)定生長(zhǎng)為止。由于特定細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求不同，實(shí)現(xiàn)其馴化的難易程度也不同，在馴化時(shí)應(yīng)盡量采用營(yíng)養(yǎng)全面的培養(yǎng)基，并有針對(duì)性地補(bǔ)充某些營(yíng)養(yǎng)成分（如促生長(zhǎng)因子、維生素、激素、氨基酸、微量元素等）以滿足細(xì)胞的特定需求，并且馴化好的細(xì)胞可以保持其懸浮和無(wú)血清生長(zhǎng)的特性。

適合懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞需要具有：生物穩(wěn)定性高、生長(zhǎng)速率快、活力高、產(chǎn)品生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品表達(dá)效率高、可滿足工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)需求等特點(diǎn)。目前有報(bào)道稱BHK細(xì)胞、CHO細(xì)胞、Vero細(xì)胞成功馴化，可在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)［5］。

2.2最適細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基的選擇也是重要環(huán)節(jié)。通常情況下，血清是動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)所不可或缺的營(yíng)養(yǎng)成分，但由于血清成分較為復(fù)雜，不同批次間的成分各異，給疫苗的生產(chǎn)帶來(lái)諸多不便［6］。目前，在動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中無(wú)血清培養(yǎng)基已逐步替代了常規(guī)培養(yǎng)基［7］，隨著生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，無(wú)動(dòng)物成分來(lái)源培養(yǎng)基的使用可以有效降低培養(yǎng)、純化成本、提高疫苗產(chǎn)品穩(wěn)定性［8］。另外，由于一種無(wú)血清培養(yǎng)基并不能適用于多種細(xì)胞的培養(yǎng)，不同細(xì)胞甚至相同細(xì)胞的不同細(xì)胞株都無(wú)法使用同一種培養(yǎng)基，因此只有根據(jù)自身的工藝需求使用適合自身的個(gè)性化培養(yǎng)基，這也是各研發(fā)機(jī)構(gòu)企業(yè)所面臨的主要問(wèn)題。研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)血清的培養(yǎng)基中添加某些特定生物活性因子，如纖連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素等，細(xì)胞可有效生長(zhǎng)繁殖［9］，如胰島素是無(wú)血清培養(yǎng)基中的重要活性因子，它具有促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的能力。有試驗(yàn)表明，CHO細(xì)胞能在僅含重組人胰島素的一種蛋白成分的無(wú)血清培養(yǎng)基中連續(xù)傳代［10］。

2.3生物反應(yīng)器的選擇生物反應(yīng)器是一種以活細(xì)胞或酶為生物催化劑并為細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖提供無(wú)菌環(huán)境的設(shè)備，是細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵設(shè)備。近幾十年來(lái)，隨著生物工程和組織工程學(xué)的發(fā)展，相應(yīng)的生物反應(yīng)器水平也在不斷提高。現(xiàn)已研制出多種不同用途、型號(hào)的動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器，其性能也日趨完善［11-13］。生物反應(yīng)器的種類主要包括：有攪拌式、氣升式、膜式、流化床式、旋轉(zhuǎn)式、固定床式、波式、灌注式等。因此，生物制品生產(chǎn)企業(yè)在選擇反應(yīng)器的時(shí)候，首先需考慮生產(chǎn)的系統(tǒng)性、適用性，即針對(duì)細(xì)胞類型及生產(chǎn)工藝選擇適合的生物反應(yīng)器，所選反應(yīng)器應(yīng)具有良好的混合功能，便于營(yíng)養(yǎng)的供給及廢物的排出，充分的氧氣供給，低剪切力；對(duì)于固定化培養(yǎng)或是貼壁細(xì)胞來(lái)說(shuō)還應(yīng)注意表面積與體積比、功能及產(chǎn)品的穩(wěn)定性等需求特點(diǎn)。

在國(guó)外生物制品生產(chǎn)中采用的多是較大規(guī)模的、能逐級(jí)放大的生物反應(yīng)器，如攪拌式生物反應(yīng)器，因其操作簡(jiǎn)單，既適應(yīng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，也適合貼壁細(xì)胞微載體培養(yǎng)，并且規(guī)模易于放大，廣泛用于多種細(xì)胞系及多種生物制品的生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)也多采用攪拌式生物反應(yīng)器，但只有少數(shù)廠家使用，而且規(guī)模較小，且多依賴進(jìn)口。

2.4細(xì)胞培養(yǎng)工藝的選擇細(xì)胞培養(yǎng)工藝在大規(guī)模培養(yǎng)中的作用至關(guān)重要，按照培養(yǎng)方式主要分為批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)、半連續(xù)式培養(yǎng)、連續(xù)式培養(yǎng)及灌注培養(yǎng)。各種培養(yǎng)工藝都有相對(duì)應(yīng)的生物反應(yīng)器類型，并均具有各自的特點(diǎn)，針對(duì)不同的細(xì)胞株及其產(chǎn)品特性，選擇適合的培養(yǎng)工藝是當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)，進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)，首先選定合適的生產(chǎn)工藝，其次是考慮與之相匹配的工藝設(shè)計(jì)，再次是工藝的穩(wěn)定性。如Vero細(xì)胞可用多種方式培養(yǎng)，但是與批培養(yǎng)和流加培養(yǎng)相比，灌注培養(yǎng)可通過(guò)動(dòng)態(tài)地調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的灌注速率，保證Vero細(xì)胞獲得充足的營(yíng)養(yǎng)供給，不斷去除有害代謝廢物的積聚，從而提高細(xì)胞生長(zhǎng)密度和病毒擴(kuò)增效率。

3　細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)在獸用疫苗中的應(yīng)用

隨著中國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，動(dòng)物疫病的暴發(fā)與流行在某些地區(qū)呈上升趨勢(shì)，目前控制動(dòng)物疫病最行之有效的方法就是使用疫苗進(jìn)行預(yù)防，而有效提高疫苗病毒的滴度、進(jìn)行工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)是生產(chǎn)疫苗的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)在推進(jìn)獸用疫苗大規(guī)模生產(chǎn)中起決定性作用。

3.1細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)在口蹄疫疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用口蹄疫作為國(guó)際獸醫(yī)局規(guī)定的A類傳染病，在世界許多國(guó)家和地區(qū)廣泛流行。接種安全、高效的疫苗是預(yù)防口蹄疫疫情發(fā)生的最有效策略之一。當(dāng)前使用反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)BHK21細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫病毒是顯著提高口蹄疫病毒抗原濃度有效途徑，主要集中在印度、巴西、阿根廷等國(guó)家。據(jù)悉印度的口蹄疫生產(chǎn)企業(yè)使用8000 L生物反應(yīng)器生產(chǎn)口蹄疫疫苗，巴西的口蹄疫生產(chǎn)企業(yè)采用5000 L生物反應(yīng)器生產(chǎn)口蹄疫疫苗。

20世紀(jì)的60年代的國(guó)外口蹄疫疫苗生產(chǎn)企業(yè)使用的細(xì)胞培養(yǎng)液是添加牛血清、磷酸肉湯或水解乳蛋白，由于添加成分如血清的差異而引起細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)的差異，從而影響疫苗質(zhì)量。同時(shí)在口蹄疫強(qiáng)制免疫的國(guó)家，牛血清中含有口蹄疫病毒抗體的可能性較大，由此影響細(xì)胞的產(chǎn)毒效果。從20世紀(jì)80年代起，國(guó)外細(xì)胞培養(yǎng)基發(fā)展迅速，低血清、無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基已逐步商品化，受國(guó)外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的影響，國(guó)內(nèi)研究機(jī)構(gòu)逐步進(jìn)行產(chǎn)品培養(yǎng)工藝的升級(jí)，開(kāi)發(fā)出了低血清、無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基及懸浮培養(yǎng)技術(shù)，并應(yīng)用到口蹄疫疫苗生產(chǎn)中，并結(jié)合細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的口蹄疫抗原146S濃度達(dá)到3 μg/mL，生產(chǎn)成本下降30%［14-18］。

3.2細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)在禽流感病毒疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用目前國(guó)內(nèi)的動(dòng)物用流感病毒疫苗的生產(chǎn)大多采用雞胚，這種傳統(tǒng)的方法存在著生產(chǎn)周期長(zhǎng)，勞動(dòng)強(qiáng)大，雞胚用量大的問(wèn)題，除此還受生物安全、殘余雞胚蛋白等問(wèn)題影響，由此迫切需要一種新的疫苗生產(chǎn)方法，采用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)的流感疫苗與傳統(tǒng)方法相比具有周期短，病毒滴度不低于雞胚滴度［19］，自動(dòng)化程度高，疫苗質(zhì)量更易控制等優(yōu)點(diǎn)。

國(guó)外懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)流感病毒使用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞主要有Vero細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、PER.C6細(xì)胞。有報(bào)道稱，Novartis公司于2007年用MDCK細(xì)胞生產(chǎn)了流感疫苗Optaflu并上市。Baxter公司于2009年通過(guò)Vero細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)生產(chǎn)了禽流感疫苗CELVAPAN并上市，此平臺(tái)可逐級(jí)放大至6000 L，細(xì)胞密度達(dá)到2×106～3×106/mL。

國(guó)內(nèi)禽流感疫苗的生產(chǎn)工藝發(fā)展較為落后，現(xiàn)已有多家單位正在開(kāi)發(fā)細(xì)胞生產(chǎn)禽流感疫苗工藝。楊濤等研究結(jié)果表明，利用MDCK細(xì)胞擴(kuò)增重組H5N3疫苗株時(shí)可獲得有效的增殖［20］。李春艷等同樣使用MDCK細(xì)胞懸浮系統(tǒng)對(duì)H9N2的生長(zhǎng)繁殖情況進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在微載體濃度為5 g/L時(shí)可以為H9N2病毒的大規(guī)模生產(chǎn)提供較好的產(chǎn)率和成本的平衡［21］。山東信得利用細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用生物反應(yīng)器進(jìn)行細(xì)胞大規(guī)模懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)禽流感疫苗的重大工藝，獲得了重組禽流感病毒（H5N1亞型）滅活疫苗的生產(chǎn)文號(hào)。

3.3細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)在其他畜禽疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用當(dāng)前我國(guó)畜牧業(yè)的發(fā)展不僅面臨著重大疫病的挑戰(zhàn)，同時(shí)還受其他疫病的威脅。如豬繁殖與呼吸綜合征、豬流行性腹瀉、豬瘟、流行性乙型腦炎、狂犬病、雞傳染性囊病等?？刂七@些疾病的有效措施就是使用疫苗，隨著細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，多種疫苗已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)。馮磊等在Marc-145細(xì)胞上使用微載體懸浮培養(yǎng)的方式大規(guī)模培養(yǎng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒并取得較高的病毒效價(jià)，在3 g/L的微載體用量下，采用3×105個(gè)/mL的初始細(xì)胞接種，培養(yǎng)至第3天可獲得最佳的細(xì)胞生長(zhǎng)效能，采用感染復(fù)數(shù)為0.05的接毒比例及接毒后48 h收獲毒液可獲得最高的豬繁殖與呼吸綜合征病毒增殖效價(jià)［22］。周燕等使用Vero細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)豬流行性腹瀉病毒進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的摸索，結(jié)果表明，接種密度為1.5×105個(gè)/mL時(shí)，可獲得較高的細(xì)胞密度，隨著微載體濃度的提高，最高細(xì)胞密度也增加，在CelliGen反應(yīng)器中，采用優(yōu)化的培養(yǎng)條件，細(xì)胞密度可達(dá)到1.74×106個(gè)/mL，達(dá)到方瓶培養(yǎng)的3.5倍，每個(gè)細(xì)胞的豬流行性腹瀉病毒含量與方瓶培養(yǎng)相當(dāng)，制備的疫苗免疫原性好［23］。洛陽(yáng)普萊柯生物工程有限公司利用傳代細(xì)胞懸浮培養(yǎng)方式成功地對(duì)豬瘟病毒進(jìn)行了大規(guī)模生產(chǎn)。該生產(chǎn)方式可以較大程度地提高單位容積的細(xì)胞生產(chǎn)量，提高單位抗原效價(jià)10～100倍，能有效的減少外源病毒污染及提高產(chǎn)品質(zhì)量。李薇等在懸浮培養(yǎng)的Vero細(xì)胞上進(jìn)行大規(guī)模繁殖流行性乙型腦炎病毒且摸索出較為理想的消化條件及消化液，并建立了適合大規(guī)模生產(chǎn)的消化放大程序，為細(xì)胞放大至下一級(jí)細(xì)胞罐中奠定了基礎(chǔ)，也為培養(yǎng)規(guī)模的進(jìn)一步放大建立了方法［24］。Perrin等利用BHK-21懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)狂犬病疫苗進(jìn)行了試驗(yàn)性研究，結(jié)果表明，應(yīng)用槽注系統(tǒng)的生物反應(yīng)器可獲得高滴度的狂犬病病毒，制造試驗(yàn)疫苗并用小鼠測(cè)試證明有良好的保護(hù)活性［25］。石崗等利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)Vero細(xì)胞進(jìn)行雞傳染性囊病病毒的研究，確定雞傳染性囊病病毒在Vero細(xì)胞上增殖的最佳培養(yǎng)條件，比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)方法至少提高1個(gè)毒價(jià)，可用于其規(guī)模化生產(chǎn)［26］。

4　小結(jié)

在國(guó)外，隨著懸浮培養(yǎng)技術(shù)在人用疫苗生產(chǎn)領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用，并逐漸應(yīng)用到獸用疫苗領(lǐng)域，技術(shù)發(fā)展相對(duì)成熟，在國(guó)內(nèi)，細(xì)胞懸浮技術(shù)雖然起步較晚，但經(jīng)過(guò)不斷的探索與研究，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)已有了飛速發(fā)展［27］。在其發(fā)展的過(guò)程中，掌握懸浮細(xì)胞系選擇、最適細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇、生物反應(yīng)器的選擇、細(xì)胞培養(yǎng)工藝的選擇4個(gè)核心要素，才能使細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用變得越來(lái)越容易，從而推動(dòng)獸用疫苗規(guī)?；a(chǎn)的發(fā)展。疫苗產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)質(zhì)是其關(guān)鍵核心技術(shù)的競(jìng)爭(zhēng)，質(zhì)量的競(jìng)爭(zhēng)，誰(shuí)在未來(lái)掌握了反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)平臺(tái)及工藝，誰(shuí)就有機(jī)會(huì)在下一輪行業(yè)發(fā)展中掌握市場(chǎng)主動(dòng)權(quán)。

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中圖分類號(hào)：Q813，S859.79

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0529- 6005（2016）03- 0076- 03

收稿日期：2015-05-21

作者簡(jiǎn)介：嚴(yán)石（1979-），男，獸醫(yī)師，碩士，從事獸醫(yī)生物制品研發(fā)工作，E-mail：348208535@qq.com