草酸二甲酯和草酸的反相高效液相色譜分析

石 蕾李偉松師浩淳許春建

（天津大學(xué)化工學(xué)院化學(xué)工程國家重點實驗室，天津300072）

草酸二甲酯（dimethyl oxalate），又名乙二酸二甲酯，作為重要的化工和醫(yī)藥原料，常被用于制備各種萃取劑、黏合劑、增塑劑及多種醫(yī)藥中間體，如用來合成維生素B13，代替草酸二乙酯合成5-甲基-3-甲?；悙哼?，加氫制備乙醇酸甲酯、乙二醇［1-2］，與氨作用合成草酰胺以用作緩釋化肥或冷凝劑［3］等。

由于草酸二甲酯是煤制乙二醇過程中重要的中間產(chǎn)物，各行業(yè)及科研院所開始研究利用CO這種清潔能源制備草酸二甲酯的新方法［4-7］，但利用草酸與甲醇進(jìn)行催化酯化反應(yīng)生產(chǎn)草酸二甲酯這種傳統(tǒng)工藝仍是工業(yè)化生產(chǎn)的主要方式。為詳細(xì)研究草酸與甲醇的酯化反應(yīng)過程，需要對反應(yīng)過程中各時刻的樣品組成進(jìn)行檢測，但是由于對全部組分的實時檢測較復(fù)雜，難以進(jìn)行，所以根據(jù)酯化反應(yīng)方程式發(fā)現(xiàn)，只需準(zhǔn)確測定草酸與草酸二甲酯的含量，就可根據(jù)各物質(zhì)之間的定量關(guān)系計算出各時刻反應(yīng)液中的物質(zhì)組成，進(jìn)而研究草酸與甲醇的酯化反應(yīng)機(jī)理。

對于草酸含量的檢測，已知文獻(xiàn)中主要有酸堿滴定法［8］、電化學(xué)發(fā)光法［9］、氣相色譜法［10］以及液相色譜法［11-13］等。其中酸堿滴定法中堿性物質(zhì)的存在會使得樣品中一部分草酸二甲酯水解，即便采用非水滴定，也不能準(zhǔn)確判斷滴定終點；采用電化學(xué)發(fā)光法操作繁瑣，不能快速測出草酸含量；由于草酸遇熱易分解，故利用氣相色譜準(zhǔn)確測定草酸含量時需對草酸進(jìn)行衍生化，而衍生化處理時間較長，且無法判斷衍生是否完全，所以氣相色譜法也無法準(zhǔn)確測定草酸含量。

本研究針對生成草酸二甲酯的酯化反應(yīng)體系，建立簡單、快速的反相高效液相色譜法，該方法能夠準(zhǔn)確測定草酸及草酸二甲酯的含量。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：Shimadzu Prominence LC-20A型高效液相色譜儀，配有紫外可變波長檢測器（SPD-20A），Shimadzu液相色譜工作站和Inertsil ODS-SP柱（4.6mm×150mm，5 μm）；microBench pH600 型 pH 計；UV765型紫外可見分光光度計；TTL-6A型超純水器。

草酸二甲酯，阿拉丁試劑（中國）有限公司，分析純；無水草酸，阿拉丁試劑（中國）有限公司，分析純；乙腈，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，色譜純；磷酸，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，色譜純；水，自制超純水。

1.2 色譜條件

流動相：A相為磷酸水溶液（pH＝2.7），B相為乙腈。A與 B混合體積比為60∶40，流速0.7 mL/min，柱溫：25 ℃，檢測波長：254 nm，進(jìn)樣量：2.5 μL。

1.3 實驗方法

儲備液的配制：精確稱取草酸二甲酯1.210 g，用乙腈作為溶劑，采用50 mL容量瓶定容，配成草酸二甲酯儲備液，濃度為 24.19 g/L；取無水草酸1.007 g，用乙腈定容至50 mL，配成草酸儲備液，濃度為20.13 g/L；用草酸二甲酯和草酸的儲備液配制成標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：按照表1中所示的配比分別移取不同體積的草酸二甲酯及草酸儲備液，配制成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度如表2所示。在1.2節(jié)色譜條件下，對5份標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行色譜分析。

表1 儲備液的移取體積Table 1 Volume of stock solutions

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度Table 2 Mass concentration of standard solutions

所配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測樣品均須經(jīng)過0.45 μm的有機(jī)濾膜過濾處理備用。在1.2節(jié)色譜條件下對待測樣品進(jìn)行色譜分析，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，即可得到樣品中草酸及草酸二甲酯的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測波長的確定

利用UV765型紫外可見分光光度計對草酸標(biāo)樣、草酸二甲酯標(biāo)樣及流動相分別在200～400 nm的波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描。結(jié)果表明，在掃描波長范圍內(nèi)草酸的最大吸收峰位于200 nm，且其在300 nm之前均有吸收，具體的草酸紫外光譜圖如圖1所示。草酸二甲酯的最大吸收波長為254 nm；流動相的最大吸收波長為204 nm，且根據(jù)檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)流動相在225 nm之前均存在吸收。為消除流動相吸收對檢測結(jié)果的影響，檢測波長需大于225 nm。同時，為了保證檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確，需要將某種待測組分的最大吸收波長作為檢測波長，因而在大于225 nm的波長范圍內(nèi)，可將草酸二甲酯的最大吸收波長254 nm作為實驗的檢測波長，在此檢測波長下草酸的吸收強(qiáng)度也能滿足檢測的要求。

圖1 草酸的紫外光譜圖Fig.1 Ultraviolet spectrogram of oxalic acid

2.1.2 流動相的選擇

考慮到草酸與甲醇在常溫條件下可快速反應(yīng)生成草酸二甲酯，故流動相中不可含有甲醇。分別以乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液及純水為流動相考察分離結(jié)果。

實驗結(jié)果顯示，以乙腈-水或純水為流動相時，由于草酸在含有大量水的流動相中易解離出2個氫離子，導(dǎo)致草酸的色譜圖出現(xiàn)雙峰或拖尾等現(xiàn)象。以乙腈-磷酸水溶液為流動相時，由于在流動相中加入酸可抑制酸的電離，改善各物質(zhì)色譜峰形以及分離度，故使用此流動相時，各物質(zhì)的峰形及選擇性較乙腈-水或純水流動相有明顯改善，各峰保留時間合適，峰形窄尖，分離度較為理想，符合分離要求。

2.1.3 流動相的優(yōu)化

流速對草酸二甲酯及草酸的分離有一定影響，當(dāng)流速增加時，色譜峰變窄，保留時間變短，分離度變?。划?dāng)流速減小是，色譜峰變寬，保留時間變長，分離度增大。綜合考慮保留時間及分離度兩個因素，選定流動相流速為0.7 mL/min。

分別以乙腈-磷酸水溶液（60∶40、70∶30 和 80∶20，體積比）為流動相進(jìn)行等度洗脫，隨著流動相中乙腈的比例不斷增加，草酸二甲酯及草酸的分離度逐漸減小。綜合考慮泵壓、分離度、保留時間及色譜柱壽命等因素，選擇乙腈-磷酸水溶液（60∶40，體積比）為流動相，柱溫為25℃。

從色譜分析條件考慮，若酸的電離常數(shù)為pKa，則流動相的最適宜pH值滿足2≤pH≤pKa2［14］。 草酸的一級電離常數(shù)pKa1為1.27，二級電離常數(shù)pKa2為4.27。據(jù)此，流動相的pH值應(yīng)滿足2.00≤pH≤2.27。磷酸含量的增加雖能很好的抑制酸的電離，但長時間使用酸性流動相對色譜柱的使用壽命有不良影響。酸性過強(qiáng)會加速草酸二甲酯樣品在流動性中的水解程度，加大測量誤差。綜合考慮兩種物質(zhì)的分離效果、測量誤差及酸性條件對色譜柱性能的影響，確定流動相的pH值為2.70。

最適宜色譜條件下測得的草酸及草酸二甲酯色譜圖如圖2所示。

圖2 草酸及草酸二甲酯的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatography of oxalic acid and dimethyl oxalate

2.2 線性關(guān)系與檢出限

分別對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析，以峰面積y對質(zhì)量濃度x作線性回歸，回歸曲線如圖3所示，回歸方程如下：

草酸的線性回歸方程為：y＝110681x+88401，R2＝0.9996。

草酸二甲酯的回歸方程為：y＝88704x+5448.1，R2＝0.9998。

在已確定的色譜條件下分析，以3倍信噪比計算草酸二甲酯的檢出限為1.21 mg/L，草酸的檢出限為 1.01 mg/L。

2.3 加標(biāo)回收率和精密度

分別將不同濃度的草酸二甲酯及草酸標(biāo)準(zhǔn)品加入到已知濃度的混合樣品中，并用乙腈定容至10 mL，以1.2節(jié)的色譜條件對加標(biāo)樣品重復(fù)進(jìn)樣測定5次，計算草酸和草酸二甲酯的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表3。

圖3 草酸及草酸二甲酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.3 Standard curves of oxalic acid and dimethyl oxalate

表3 草酸及草酸二甲酯的加標(biāo)回收率Table 3 Recoveries of oxalic acid and dimethyl oxalate

2.4 樣品的測定

在生成草酸二甲酯的反應(yīng)液中取適量樣品，在優(yōu)化后的色譜條件下進(jìn)行定量分析，每個樣品重復(fù)進(jìn)樣4次，通過兩種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各物質(zhì)的濃度，分析結(jié)果如表4所示。

表4 草酸二甲酯樣品的分析結(jié)果Table 4 Analysis results of dimethyl oxalate samples

3 結(jié)論

建立了在草酸二甲酯生產(chǎn)過程中，利用反相高效液相色譜定量分析草酸二甲酯和草酸的方法。實驗結(jié)果表明，在優(yōu)化的色譜條件下，反應(yīng)液中的草酸二甲酯與草酸得到很好的分離。該方法具有回收率高，重復(fù)性好，操作方便等優(yōu)點。

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