祛風(fēng)清熱通絡(luò)法對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)痛覺信號(hào)傳導(dǎo)途徑的影響

吳遠(yuǎn)華 司凱隆

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

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祛風(fēng)清熱通絡(luò)法對(duì)三叉神經(jīng)痛大鼠三叉神經(jīng)節(jié)痛覺信號(hào)傳導(dǎo)途徑的影響

吳遠(yuǎn)華 司凱隆1

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

目的 探討三叉神經(jīng)痛大鼠模型三叉神經(jīng)節(jié)痛覺信號(hào)傳遞機(jī)制及以祛風(fēng)清熱通絡(luò)法為核心治療本病的作用途徑。方法 采用祛風(fēng)清熱通絡(luò)法，運(yùn)用慢性縮窄環(huán)法制作三叉神經(jīng)痛大鼠模型，造模成功后進(jìn)行動(dòng)物模型三叉神經(jīng)節(jié)離體培養(yǎng)，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)三叉神經(jīng)節(jié)降鈣素基因相關(guān)肱(CGRP)mRNA，探討該法對(duì)動(dòng)物模型三叉神經(jīng)痛覺信號(hào)傳遞機(jī)制的干預(yù)作用。結(jié)果 各組三叉神經(jīng)節(jié)CGRP mRNA表達(dá)量依次為空白組<高劑量組<卡馬西平組<中劑量組<陰性對(duì)照組<低劑量組，高、中劑量組與陰性對(duì)照組相比CGRP mRNA表達(dá)下調(diào)明顯(P<0.05)；高劑量苗藥對(duì)三叉神經(jīng)節(jié)CGRP mRNA表達(dá)的抑制作用較卡馬西平強(qiáng)，但差異不顯著(P>0.05)。結(jié)論 高劑量苗藥能下調(diào)CGRP mRNA表達(dá)，可能是通過影響CGRP的合成和釋放使CGRP含量減少，從而使三叉神經(jīng)節(jié)痛覺信號(hào)傳導(dǎo)途徑受阻而起到緩解疼痛的作用。

三叉神經(jīng)痛；三叉神經(jīng)節(jié)；痛覺信號(hào)傳遞；祛風(fēng)清熱通絡(luò)法

苗藥血飛蓽茇定痛湯方藥制劑由見血飛(飛龍掌血)、蓽茇、苕葉細(xì)辛、白芷、全蝎、蜈蚣、大血藤、川芎、赤芍、白芍、炙甘草組成，具有祛風(fēng)清熱通絡(luò)之功效，常用來祛瘀止痛等。原發(fā)性三叉神經(jīng)痛以氣血失調(diào)，肝胃郁熱，釀生風(fēng)火，氣血逆亂為發(fā)病的主要機(jī)制。本研究擬以祛風(fēng)清熱通絡(luò)法為核心治法對(duì)三叉神經(jīng)痛模型大鼠展開實(shí)驗(yàn)研究，探討該法對(duì)模型動(dòng)物三叉神經(jīng)節(jié)痛覺信號(hào)傳遞的影響，為治療三叉神經(jīng)痛提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑及儀器 苗藥血飛蓽茇定痛湯方藥制劑由貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥制劑室提供。苗藥配方：見血飛(飛龍掌血)、蓽茇、苕葉細(xì)辛、白芷、全蝎，蜈蚣、大血藤、川芎、赤芍、白芍、炙甘草。紫外分光光度計(jì)；PCR擴(kuò)增儀；CGRP基因引物和探針；RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑；DNA擴(kuò)增試劑及標(biāo)準(zhǔn)品等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇、分組及給藥方法 選擇健康成年雄性SD大鼠多只，平均體重(250±20)g。術(shù)前測(cè)定疼痛閾值(作為基礎(chǔ)痛閾)后，行左側(cè)眶下神經(jīng)-慢性縮窄損傷環(huán)扎術(shù)。在手術(shù)第14天開始觀察是否出現(xiàn)痛覺超敏癥狀，出現(xiàn)了痛覺超敏癥狀者將作為入選對(duì)象。入選后的大鼠根據(jù)完全隨機(jī)分組原則進(jìn)行分組：正?？瞻捉M：自然環(huán)境、普通飼料飼養(yǎng)，以生理鹽水灌胃，每日1次，灌胃14 d。陰性對(duì)照組：測(cè)定術(shù)前疼痛閾值(作為基礎(chǔ)痛閾)后，進(jìn)行左側(cè)眶下神經(jīng)(ION-CC)環(huán)扎術(shù)制作三叉神經(jīng)痛大鼠模型，通過對(duì)環(huán)扎線標(biāo)記比較其松緊度及手術(shù)線的選擇等優(yōu)化選擇造模方法的指標(biāo)，選出最優(yōu)造模方案。造模成功后以生理鹽水灌胃，每日1次，灌胃14 d。治療組：造模成功后給予血飛蓽茇定痛湯灌胃，高、中、低劑量分別按成人臨床用藥劑量的20倍、10倍、5倍計(jì)算，每日1次，灌胃14 d。陽(yáng)性對(duì)照組：造模成功后給予卡馬西平治療，相當(dāng)于成人劑量的10倍，每日1次，灌胃14 d。

1.3 大鼠三叉神經(jīng)節(jié)離體培養(yǎng)模型的建立 三叉神經(jīng)痛大鼠模型造模成功14 d后，麻醉后用750 ml/L酒精浸泡3 min，然后進(jìn)行消毒，再行斷頭處死，用止血鉗沿枕骨大孔端層層剝開顱骨和顳骨并刮掉大腦、小腦，充分暴露三叉神經(jīng)，輕輕剪斷三個(gè)感覺根取出神經(jīng)節(jié)，將神經(jīng)節(jié)取出并放在冷的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)中，慢慢將周圍的脂肪、血管、神經(jīng)鞘膜等結(jié)締組織從神經(jīng)節(jié)中剔除，變成乳白色，保存在4℃PBS中備用。24孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔盛2 ml DMEM(Sigma，USA)培養(yǎng)液(加青霉素100 U/ml，鏈霉素100 mg/L以及兩性霉素B 25 mg/L)。放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，持續(xù)給予含50 ml/L CO2O2，把pH值維持在7.4，每24 h更換1次培養(yǎng)液。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)mRNA表達(dá)量 用FastPrepA試劑盒(QBIOgene，CA，USA)中1 ml RNA proTM液(Q-BIOgene，CA，USA)勻漿進(jìn)行處理組織，按程序提取總RNA。采用1%普通瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA。cDNA的逆轉(zhuǎn)錄采用Gene Amp RT試劑盒(PE Applied Biosystems)。Real-time PCR使用GeneAmp SYBR Green PCR試劑盒(PE Applied Biosystems)，Perkin-Elmer PCR儀(PE，GeneAmp 5700)。管家基因GAPDH：上游引物：5′-GGCCTTCCGTGTCCTACC-3′，下游引物：5′-AGGTGTTGGTGCTGGACACA-3′，引物長(zhǎng)度55 bp。CGRP(M34090)：上游引物：5′-GAGGCAGCTACAAGGTTCAGG-3′，下游引物：5′-CGGCATGTCAGATCCACAAC-3′，引物長(zhǎng)度151 bp。PCR反應(yīng)體系為50 μl，先50℃ 2 min，95℃ 10 min，再95℃ 15 s和60℃ 1 min，共循環(huán)40次，待反應(yīng)結(jié)束，采用分離曲線進(jìn)行分析，確定反應(yīng)產(chǎn)物的特異性。定量數(shù)據(jù)分析采用PCR循環(huán)閾值(Cycle threshold，Ct)，用GAPDH的Ct值作為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算CGRP mRNA的相對(duì)表達(dá)量。標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)Ct=1 g〔濃度/(1+E)〕方程繪制，代表擴(kuò)增效率，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率計(jì)算，理想斜率=3.3，理想擴(kuò)增效率=100%。標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證CGRP和GAPDH的cDNA在PCR反應(yīng)體系里擴(kuò)增效率相同。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件行單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA濃度 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各組樣本RNA的260 nm、280 nm波長(zhǎng)OD值，OD260/OD280比值為1.8～2.0，提示RNA純度較好，無明顯污染。

2.2 三叉神經(jīng)節(jié)中CGRP mRNA表達(dá)水平 高劑量組三叉神經(jīng)節(jié)CGRP mRNA表達(dá)量(0.294 8±0.003 2)最低，其余造模組均高于高劑量組，依次為：陽(yáng)性對(duì)照組(0.295 5±0.000 4)<中劑量組(0.316 5±0.003 0)<陰性對(duì)照組(0.331 8±0.004 0)<低劑量組(0.344 7±0.003 5)<空白組(0.353 2±0.004 5)；高、中劑量組與陰性對(duì)照組相比，CGRP mRNA表達(dá)下調(diào)明顯(P<0.05)；高劑量苗藥對(duì)三叉神經(jīng)節(jié)CGRP mRNA表達(dá)的抑制作用較卡馬西平強(qiáng)，但差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

原發(fā)性三叉神經(jīng)痛的原因尚未明確，臨床表現(xiàn)為三叉神經(jīng)分布區(qū)短暫而反復(fù)發(fā)作的劇烈性疼痛。三叉神經(jīng)痛屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)中“面痛”、“頭風(fēng)”等范疇〔1〕?！稄埵厢t(yī)通》云，面痛皆因于火，而虛實(shí)之殊。張運(yùn)凱等〔2〕提出：三叉神經(jīng)痛總厥陰少陽(yáng)，陽(yáng)明，肝膽風(fēng)火，腸胃燥熱，閉阻經(jīng)絡(luò)，脈滿腫脹，迫及神經(jīng)而劇痛突然發(fā)作。我國(guó)對(duì)三叉神經(jīng)痛的研究大多數(shù)為臨床分析，有研究指出運(yùn)用苗藥治療原發(fā)性三叉神經(jīng)痛取得好的療效〔3〕，但對(duì)其發(fā)病機(jī)制，特別是苗藥的作用機(jī)制方面研究較少。

CGRP作為一種生物活性多肽，主要存在于三叉神經(jīng)節(jié)和背根神經(jīng)節(jié)等部位〔4〕，具有強(qiáng)烈的擴(kuò)血管作用，能增加毛細(xì)血管通透性血漿蛋白的滲出。CGRP主要是通過cAMP-PKA-MEK-ERK-CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與疼痛過程。本研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于陰性對(duì)照組而言，高劑量組對(duì)三叉神經(jīng)節(jié)CGRP mRNA表達(dá)的抑制作用較強(qiáng)。原因可能是苗藥中的成分如大血藤、見血飛、苕葉細(xì)辛等達(dá)到一定濃度后，可通過多種途徑干擾CGRP合成，使得CGRP發(fā)出抑制信號(hào)，降低CGRP的合成量，阻滯了cAMP-PKA-MEK-ERK-CREB信號(hào)的傳導(dǎo)。同時(shí)，有文獻(xiàn)指出，在感覺神經(jīng)節(jié)中CGRP與背角P物質(zhì)(SP)共存，SP作為一種傳遞傷害性刺激信息的神經(jīng)遞質(zhì)，能增加傷害性信息的傳導(dǎo)〔5，6〕。在痛覺傳導(dǎo)過程中，CGRP能增加SP的釋放，增強(qiáng)了痛覺信號(hào)的傳導(dǎo)〔7〕；加上CGRP抑制SP的降解酶，延長(zhǎng)了SP的作用時(shí)間，進(jìn)一步加強(qiáng)了痛覺信號(hào)的傳遞〔8〕。而苗藥中各成分可能降低CGPR的表達(dá)，減少SP的釋放，在一定程度上激活SP降解酶，使SP在量上和活性上都可能降低，阻滯了痛覺信號(hào)傳導(dǎo)通路的傳遞。還有一種可能的原因是苗藥中各種成分的濃度較高，與CGRP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)的可能性增加，減少CGRP與相應(yīng)位點(diǎn)的結(jié)合，CGRP不能結(jié)合而被降解。

卡馬西平是治療三叉神經(jīng)痛的一線藥，卡馬西平會(huì)給患者帶來頭昏、嗜睡、共濟(jì)失調(diào)、皮炎等副作用〔9〕。一定劑量的苗藥可以降低CGRP mRNA的表達(dá)量，緩解三叉神經(jīng)痛。提示在治療三叉神經(jīng)痛時(shí)可以考慮一定劑量的苗藥和一定劑量的卡馬西平聯(lián)合使用，既能減少卡馬西平的使用量、降低卡馬西平的副作用，又能增加療效、緩解疼痛。

1 張美增，郭瑞友，王 嶺.中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)病學(xué)〔M〕.北京：科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2014：212-3.

2 張運(yùn)凱，趙錫武.偏頭痛方治療三叉神經(jīng)痛5例〔J〕.湖北民族學(xué)院報(bào)，2004；21(2)：35-6.

3 吳遠(yuǎn)華，邵 勇，朱廣旗，等.血飛蓽茇定痛湯治療原發(fā)性三叉神經(jīng)痛34例〔J〕.陜西中醫(yī)，2010；31(8)：1006-7.

4 鄭林豐，謝應(yīng)桂，許愿忠.降鈣素基因相關(guān)肽在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的作用〔J〕.創(chuàng)傷外科雜志，2006；8(6)：571-3.

5 Hutchins B，Spears R，Hinton RJ，etal.Calcitonin gene-related peptide and substance P immunoreactivity in rat tri-geminal ganglia and brainstem following adjuvant-induced inflammation of the temporomandibular joint〔J〕.Arch Oral Biol，2000；45(4)：335-45.

6 黃 飛，張 敏，張 曼，等.心理應(yīng)激對(duì)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)降鈣素基因相關(guān)肽表達(dá)的影響〔J〕.口腔醫(yī)學(xué)研究，2008；24(6)：619-21.

7 Ghatta S，Nimmagadda D.Caleitonin gene-related peptide：understanding its role〔J〕.Indian J Pharmacol，2004；36(5)：277-83.

8 朱遵燕，楊曉秋.三叉神經(jīng)慢性縮窄環(huán)術(shù)大鼠血降鈣素基因相關(guān)肽及P物質(zhì)變化〔J〕.解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2011；36(4)：376-8.

9 何俐鈞，余建萍.奧卡西平與卡馬西平治療原發(fā)性三叉神經(jīng)痛的療效及副作用比較〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2012；32(21)：4786-7.

〔2015-11-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字〔2011〕2303號(hào))

司凱隆(1989-),男，住院醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療神經(jīng)性疼痛的研究。

吳遠(yuǎn)華(1976-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療腦血管病研究。

R745.11

A

1005-9202(2016)22-5517-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.22.010

1 貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院