布魯菌分型方法研究進(jìn)展

劉　帥,馬曉菁,鐘　旗,葉　鋒,吐爾洪.努爾,谷文喜,易新萍

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊830052;2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,新疆烏魯木齊830000)

布魯菌分型方法研究進(jìn)展

劉帥1,2,馬曉菁2,鐘旗2,葉鋒2,吐爾洪.努爾2,谷文喜2,易新萍2

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊830052;2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所,新疆烏魯木齊830000)

布魯菌病是一種呈世界性流行并嚴(yán)重影響畜牧業(yè)發(fā)展和人類公共衛(wèi)生安全的人獸共患病.布魯菌屬細(xì)菌是布魯菌病的病原菌.目前已發(fā)現(xiàn)的布魯菌有10個(gè)種23個(gè)亞型.建立快速、可靠的布魯菌分型技術(shù)對于布魯菌病的追根溯源、判斷毒力、免疫力、遺傳變異、流行病學(xué)特征及其防控具有重大意義.目前用于布魯菌屬細(xì)菌分型的方法主要分為生物分型和分子分型兩類.傳統(tǒng)的生物分型方法操作繁瑣,周期長,使用活菌試驗(yàn),生物安全風(fēng)險(xiǎn)較大[1].另外,由于菌株遺傳變異等原因,出現(xiàn)了大量的非典型菌株,僅靠傳統(tǒng)的分型方法已不能完全滿足布魯菌分型工作的需要.結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)快速、精確、安全等特點(diǎn),多種分子分型方法被應(yīng)用于布魯菌的快速鑒定和溯源分析,其靈敏度、特異性、分辨力、重復(fù)性等都優(yōu)于傳統(tǒng)方法[2].本文就布魯菌分型方法的應(yīng)用研究進(jìn)展予以綜述.

1　生物分型

1.1生物學(xué)分型生物學(xué)分型主要根據(jù)布魯菌的生化特性,如細(xì)菌生長時(shí)對CO2需要、H2S產(chǎn)生量、尿素酶活性、過氧化氫酶的量、阿尼林染料的敏感性、糖發(fā)酵試驗(yàn)和細(xì)胞代謝酶類(賴氨酸、谷氨酸、天門冬氨酸、葡萄糖等)活性的檢測進(jìn)行綜合判定,這種傳統(tǒng)的生物學(xué)分型法可以鑒定到種水平,也可以應(yīng)用于布魯菌的部分亞型的分型,在布魯菌病的防治工作中發(fā)揮了積極而重要的作用.

1.2噬菌體和細(xì)菌素分型應(yīng)用一系列噬菌體和細(xì)菌素對待檢細(xì)菌進(jìn)行裂解試驗(yàn)來進(jìn)行分型.1986年,FAO/WHO布魯菌病專家委員會(huì)將4種噬菌體Tb、Wb、Bk2、Fi作為布魯菌種的常規(guī)鑒定方法,基本上可以鑒別S型布魯菌.崔慶祿等研究表明,噬菌體SA對布魯菌豬1、3型,牛1、3、6型,沙林鼠種敏感,同時(shí)A2、NM-R、NMg-1、NMg-2、NMy-1、NMy-2噬菌體對布魯菌的分型鑒定有一定的參考意義[3-4].

1.3血清分型布魯菌含有A、M、R 3種抗原,這3種抗原在不同的布魯菌中含量不同.A抗原為牛種1型布魯菌的主要抗原,M抗原為羊種1型布魯菌的主要抗原,用A、M、R因子血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)對布魯菌分型有一定意義[5].

1.4菌體組分分型細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中普遍含有菌體組分(脂肪酸、脂多糖),不同種屬的細(xì)菌,其組分的組成種類和含量表現(xiàn)出不同程度的差異,根據(jù)這種差異對菌株進(jìn)行分型.國內(nèi)外研究者應(yīng)用氣-液相色譜對布魯菌脂肪酸成分進(jìn)行了研究,可以區(qū)分布魯菌的種和部分亞型[6-7].More?no等應(yīng)用核磁共振技術(shù)測定布魯菌脂多糖的結(jié)構(gòu),對布魯菌進(jìn)行分型.應(yīng)用元素分析和熱力學(xué)等技術(shù)測定布魯菌脂多糖也可對布魯菌進(jìn)行分型[8-9].雖然脂肪酸和脂多糖分型不能完全區(qū)分出布魯菌生物亞型,但是菌株的組成成分可以從另一個(gè)側(cè)面反映出布魯菌的種屬進(jìn)化關(guān)系,為布魯菌的分型工作提供了更多的參考途徑.

2　分子分型

2.1核酸探針目前應(yīng)用于布魯菌的主要是以16S核糖體基因(16S rRNA)與探針雜交,分析雜交圖譜,對布魯菌進(jìn)行分型鑒定.Fernandez等選用3種熒光探針對所有布魯菌屬和種進(jìn)行雜交檢測,結(jié)果顯示,用B9探針可將豬種布魯菌2、3、4、5型和幾乎全部布魯菌菌屬區(qū)別開[10].駱利敏采用核酸探針技術(shù)將我國99株布魯菌分屬17個(gè)RT型,表明我國布魯菌在流行上具有復(fù)雜性[11].總體上看,核酸探針指紋圖譜與傳統(tǒng)分型有一定差異,可以作為傳統(tǒng)分型方法的一種補(bǔ)充.但與其他分子分型方法相比,核酸探針操作較為復(fù)雜,對技術(shù)要求高,費(fèi)用高,不適合在布魯菌常規(guī)檢測、鑒定分型中廣泛應(yīng)用.

2.2脈沖場凝膠電泳(PFGE)脈沖場凝膠電泳是一種分離大分子DNA的方法.利用內(nèi)切酶對細(xì)菌染色體DNA消化,在脈沖場凝膠電泳中,由于電場在不斷的在兩種方向變動(dòng),使不同大小的DNA片段分開,進(jìn)一步比對分析,從而對菌株分型鑒定.因其重復(fù)性好,分辨率高,已成為許多細(xì)菌分型鑒定、調(diào)查遺傳關(guān)系的有效方法之一.駱利敏等將76株中國分離株分為39種PFGE類型,聚為四大類,同時(shí)聚類分析圖表明牛羊豬綿羊附睪是由共同祖先進(jìn)化而來,犬種是豬種菌的主要株或剛從豬種進(jìn)化而來[12].崔步云對122株國內(nèi)分離菌株進(jìn)行PFGE檢測,建立了PulseNet China網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫[13].該方法分辨效果好,還可以將待測菌株與數(shù)據(jù)庫中菌株比較分析,但費(fèi)時(shí),成本高,且對操作人員有一定的技術(shù)要求.

2.3PCR及其衍生技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù),該方法有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性,在生物學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用.國內(nèi)外研究者建立了在屬的水平上鑒定布魯菌的普通PCR方法[14-16].2003年Bricke等建立了AMOS-PCR方法,該方法可同時(shí)鑒定布魯菌六個(gè)種,有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值,但鑒定到型存在一定困難[17].

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)將靶基因的擴(kuò)增與探針雜交檢測相結(jié)合的PCR方法.Redkar等[18]用該方法可對牛種布魯菌的7個(gè)型,羊種布魯菌的3個(gè)型以及豬種布魯菌1型進(jìn)行鑒定.該方法具有較好的特異性和靈敏度,靈敏度可達(dá)到0.25 pg.Willian等在Redkar研究的基礎(chǔ)上建立了一種實(shí)時(shí)多重PCR,可同時(shí)快速鑒定布魯菌屬、牛種布魯菌和羊種布魯菌[19].該方法比常規(guī)PCR敏感,操作簡便、快速并可以降低DNA樣品污染的風(fēng)險(xiǎn),是一種特異、敏感、高效、快速、安全的布魯菌鑒定分型方法.

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)(PCR-RFLP)是一種非常有用的通過用限制性內(nèi)切酶對DNA選擇性降解、進(jìn)一步分析PCR產(chǎn)物的工具.Cloeckaert等用該方法可鑒定出布魯菌的各種和型,但不能區(qū)分犬種和豬種布魯菌3、4型[20].崔步云等應(yīng)用PCR-RFLP法將107株國內(nèi)外布魯菌的參考菌株和地方流行菌株分為8個(gè)組[21],可用于典型和非典型布魯菌的鑒定和分型而彌補(bǔ)傳統(tǒng)分類方法的不足.擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分型(AFLP-PCR)法是將細(xì)菌基因組酶切后進(jìn)行標(biāo)記和擴(kuò)增,從而獲得DNA指紋圖并進(jìn)行分析.駱利敏等構(gòu)建出我國布魯菌株基因組擴(kuò)增片段長度多態(tài)性DNA指紋圖譜,從聚類分析樹狀圖可以在種的水平上區(qū)分布魯菌各株,甚至在種內(nèi)細(xì)分為各亞型,但是對犬種和羊種布魯菌的分型有一定程度的重疊[22].

2.4多位點(diǎn)序列(MLST)多位點(diǎn)序列分型(MLST)是一種通過對多個(gè)管家基因的測序,用核苷酸序列變異來發(fā)現(xiàn)細(xì)菌型別差異的分型方法.Whatmore等對160株布魯菌進(jìn)行MLST分析,共發(fā)現(xiàn)了27個(gè)序列型(ST).種系發(fā)生樹顯示各ST形成的類群與傳統(tǒng)分類基本一致.46株海洋哺乳動(dòng)物分離株分成5個(gè)ST,并可形成一個(gè)獨(dú)立種[23].周曉艷等對分離自我國的47株羊種3型布魯菌進(jìn)行MLST分析,結(jié)果顯示,19株布魯菌的omp25基因與目前已有的等位基因型不同,被定義為1個(gè)新的等位基因型,即ST28.其余28株與已知的ST8型的各等位基因型一致[24].MLST具有較高的分辨率,但是需要測序,提高了成本,另外對于發(fā)生微小變異的菌株無法較好地區(qū)分.該方法可用于分子流行病學(xué)研究,適合于數(shù)據(jù)庫儲(chǔ)存和軟件分析的基因分型方法.

2.5多位點(diǎn)可變數(shù)量串連重復(fù)序列(MLVA)多位點(diǎn)可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)序列分型(MLVA)是利用細(xì)菌在進(jìn)化過程中由于錯(cuò)配和重組而不斷產(chǎn)生的可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR),基于在同源重復(fù)序列上出現(xiàn)差異數(shù)目而設(shè)計(jì)的一種細(xì)菌分型方法.Bricker等利用布魯菌基因序列中的8個(gè)位點(diǎn)(MLVA-8)對美國的105株布魯菌(包括標(biāo)準(zhǔn)株和分離株)進(jìn)行分型,較好地區(qū)分各生物型[25].在此基礎(chǔ)上Philippe等建立了布魯菌MLVA-15分型方法并對236株布魯菌進(jìn)行了試驗(yàn).結(jié)果顯示,能準(zhǔn)確鑒定一些傳統(tǒng)方法難以鑒定的布魯菌[26]. 2008年,Mireille等對該方法進(jìn)一步完善并利用MLVA-16對527株布魯菌(包括標(biāo)準(zhǔn)株和分離株)進(jìn)行分型,獲得了384個(gè)基因型,由此建立了布魯菌2007數(shù)據(jù)庫供各不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對分析[27],結(jié)果表明,該分型方法與傳統(tǒng)方法有較高的一致性.MLVA分型方法不僅可用于闡明布魯菌病的流行病學(xué)特征,也可用于傳染源的追溯,而且標(biāo)準(zhǔn)化的MLVA方法還可用于國際間菌株的比較分析,對確定分離株的親緣關(guān)系及遺傳進(jìn)化變異研究具有重要作用.

3　結(jié)束語

布魯菌分型的目的是反映細(xì)菌在進(jìn)化過程中較為重要的有意義的突變,尋找細(xì)菌衍化的內(nèi)在規(guī)律,為疾病的預(yù)防與控制提供依據(jù).目前還沒有一種分型方法能完全反映布魯菌的進(jìn)化關(guān)系和分類地位,同時(shí)在臨床和流行病學(xué)上又具有現(xiàn)實(shí)意義.相對于傳統(tǒng)的布魯菌生物分型方法,分子分型方法有極大的飛躍.該類方法不僅具有快速、準(zhǔn)確、低生物風(fēng)險(xiǎn)等特點(diǎn),而且還可以開展遺傳進(jìn)化、追蹤溯源、分子流行病學(xué)等多種研究.到目前為止,還未見有哪一種分子分型方法完全能夠取代傳統(tǒng)的布魯菌分型方法.因此,在進(jìn)行布魯菌的分型鑒定時(shí),應(yīng)因地制宜、結(jié)合實(shí)際,應(yīng)多法并用,相互參考,盡可能多的提供相關(guān)的信息,為布魯菌病預(yù)防和控制提供科學(xué)的理論依據(jù).

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S852.61+4

A

0529-6005(2016)06-0069-03

2015-09-28

新疆維吾爾自治區(qū)高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(201311102)

劉帥(1992-),男,碩士生,主要從事動(dòng)物疫病診斷與防控研究,E-mail:312447562@qq.com

易新萍,E-mail:yxp0925@sina.com