藍(lán)曼龍魚致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析

陳亨利,莫金龍,康元環(huán),陳　龍,畢建飛,張冬星,李芳芳,李　影,單曉楓

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長春130118)

藍(lán)曼龍魚致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析

陳亨利,莫金龍,康元環(huán),陳龍,畢建飛,張冬星,李芳芳,李影,單曉楓

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長春130118)

從患病藍(lán)曼龍魚(Trichogaster trichopterus)體內(nèi)分離到1株細(xì)菌CC0323,經(jīng)人工感染試驗對藍(lán)曼龍魚有一定致病力.采用形態(tài)學(xué)觀察,生理生化鑒定,16S rRNA序列分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹等方法進(jìn)行鑒定.結(jié)果分離株CC0323為革蘭陰性短桿菌,具多形性,在RS瓊脂上可生長,呈中等大小,表面光滑的淡黃色濕潤菌落;理化特性和藥敏試驗結(jié)果與維氏氣單胞菌基本相同;系統(tǒng)發(fā)育樹可見CC0323與維氏氣單胞菌QXL0711B進(jìn)化關(guān)系最近.試驗結(jié)果,證明分離株CC0323為維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii).

藍(lán)曼龍魚;維氏氣單胞菌;分離鑒定;16S rRNA;系統(tǒng)發(fā)育分析

藍(lán)曼龍魚(Trichogaster trichopterus),也稱藍(lán)曼龍,屬鱸形目(Perciformes),攀鱸亞目(Anabantoi?dei),廣布于東南亞各國至太平洋熱帶及亞熱帶的淡水水域中,我國瀾滄江下游也有分布[1].其體型較扁,顏色艷麗,體側(cè)有幾塊形狀不規(guī)則的深藍(lán)色斑塊,腹部有兩條退化成長絲狀的腹鰭,因這些與其他觀賞魚有著明顯不同的外觀特征而受到觀賞魚愛好者的喜愛.

近年來隨著養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展,藍(lán)曼龍等熱帶淡水魚走進(jìn)了千家萬戶,對藍(lán)曼龍的研究也逐漸開展.2015年3月,吉林長春某觀賞魚養(yǎng)殖場突發(fā)疾病,出現(xiàn)藍(lán)曼龍大量死亡病例.病死魚皮膚顏色變深,剖檢可見消化道黏膜出血,消化道內(nèi)有氣體.本試驗對發(fā)病的藍(lán)曼龍魚進(jìn)行病原分離,得到一株致病菌,并對其進(jìn)行生理生化鑒定,16S rRNA序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,研究結(jié)果報告如下.

1　材料與方法

1.1試驗材料患病藍(lán)曼龍魚由長春某觀賞魚養(yǎng)殖場提供,健康藍(lán)曼龍魚,購自長春某花鳥魚市場.

1.2主要試劑RS瓊脂(購自北京陸橋生物技術(shù)股份有限責(zé)任公司);微量生化反應(yīng)管(購自杭州天和微生物試劑有限公司);rTaq、pMD18T Vector及DNA Marker,購自TaKaRa公司;Gel Extraction kit,購自O(shè)mega公司.

1.3病原分離和細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察無菌操作取瀕死魚腸道、肝臟、心臟、血液等組織接種于RS瓊脂,于28℃培養(yǎng)過夜,挑取形態(tài)大小一致的優(yōu)勢菌落進(jìn)行純培養(yǎng),保存于4℃?zhèn)溆?分離菌株于營養(yǎng)瓊脂中劃線,28℃培養(yǎng)24 h,觀察菌落形態(tài)、大小和顏色;挑取典型優(yōu)勢單菌落進(jìn)行革蘭染色,鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài).

1.4分離菌株人工感染試驗及毒力測定將分離菌株接種于營養(yǎng)肉湯中,28℃振蕩培養(yǎng),菌落計數(shù)并用0.85%滅菌生理鹽水稀釋至2.82X108CFU/mL.將健康藍(lán)曼龍魚隨機分為5個試驗組和1個對照組,每組8尾.試驗組分別腹腔注射0.3 mL 2X108、2X107、2X106、2X105、2X104CFU/mL的菌懸液,對照組腹腔注射0.3 mL 0.85%滅菌生理鹽水.水體保持25℃并持續(xù)打氧.連續(xù)觀察14 d,對觀察期間死亡魚及時剖檢,觀察病理變化,分離病原,記錄病死魚并應(yīng)用改良寇氏法計算半數(shù)致死量.

1.5生理生化鑒定挑取分離菌株單菌落接種至微量生化反應(yīng)管,28℃培養(yǎng)24 h結(jié)果判定以生化反應(yīng)管說明書為準(zhǔn).

1.6藥敏試驗將分離菌懸液稀釋至1X106CFU/ mL,取100 μL均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板,貼上卡那霉素等24種藥敏紙片,30℃溫箱培養(yǎng)20 h,觀察并記錄抑菌圈直徑,根據(jù)美國CLSI藥敏試驗判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定.

1.716SrRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建采用熱裂解法制備模板,參照文獻(xiàn)[2]操作,引物為細(xì)菌16S rRNA通用引物,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,其序列為:上游引物5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,下游引物5′-AC?GGCTACCTTGTTACGACTT-3′.PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收純化,將純化的片段連接pMD18T載體,送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序.測得的菌株16S rRNA序列經(jīng)NCBI的Blast進(jìn)行序列相似性比對,用MEGA6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析.

2　結(jié)果

2.1病原分離及形態(tài)學(xué)觀察病死魚體內(nèi)分離到1株致病菌,暫時命名為CC0323.該菌在RS瓊脂上呈圓形、邊緣整齊的黃色菌落;在營養(yǎng)瓊脂中呈圓形,邊緣整齊的半透明乳白色菌落.革蘭染色鏡檢可見分離株為革蘭陰性短桿菌,具多型性,常呈兩端鈍圓的短桿狀,散在或成對存在.

2.2人工感染試驗及半數(shù)致死量測定接種菌株CC0323后,14 d內(nèi)試驗組死亡情況如表1,其中大部分死亡發(fā)生在攻菌后24 h內(nèi).經(jīng)計算得分離菌株CC0323對藍(lán)曼龍魚的半數(shù)致死量為3.6X 106CFU/mL,平均致死時間為14 h.

表1　分離菌株CC0323半數(shù)致死量的測定

2.3發(fā)病癥狀與病理變化病魚初期游動緩慢或停止游動,不喜食,死亡后體色變深;肛門周圍充血,腹部膨大、柔軟.剖檢可見腹內(nèi)有腹水流出,肝臟脆易碎,腸黏膜出血,腸內(nèi)脹氣,所有癥狀與自然病例相一致.

2.4生理生化結(jié)果分離菌株CC0323能夠發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、β-半乳糖等,不發(fā)酵阿拉伯糖、鼠李糖等,V-P試驗呈陽性,七葉苷、衛(wèi)矛醇、肌醇等呈陰性.具體的生化鑒定結(jié)果如表2,依據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊,初步鑒定分離菌株CC0323為維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii).

表2　分離菌株CC0323生化試驗結(jié)果

2.5藥敏試驗結(jié)果藥敏試驗結(jié)果顯示,分離株CC0323對氯霉素、磷霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、復(fù)方新諾明等藥物敏感,對青霉素、多黏菌素B、氨芐西林及克林霉素表現(xiàn)耐藥.具體藥敏試驗結(jié)果見表3.

2.616SrRNA gene擴增結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育分析經(jīng)16S rRNA gene PCR擴增得到一段約1 500 bp大小的片段(圖1),經(jīng)測序片段大小為1 560 bp.

將測序得到的序列經(jīng)NCBI上的Blast檢索比對,發(fā)現(xiàn)分離菌株16S rRNA gene序列與維氏氣單胞菌QXL0711B(登錄號FJ808727.1)的相應(yīng)序列同源性達(dá)到99%.應(yīng)用MEGA6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),可見分離菌株CC0323與維氏氣單胞菌處于同一進(jìn)化分支.

表3　藥物敏感試驗結(jié)果

圖1　分離菌株CC0323 16S rRNA gene擴增結(jié)果

3　討論

本研究從患病的藍(lán)曼龍魚體內(nèi)分離到一株致病菌,生理生化鑒定、生物信息學(xué)分析確定分離菌株CC0323為維氏氣單胞菌.經(jīng)革蘭染色鏡下可見分離菌株為革蘭陰性短桿菌,常散在或成對存在,觀察到此菌具有多形性,大多為短桿狀,部分呈絲狀.細(xì)菌多形性的產(chǎn)生一方面是由于環(huán)境條件而造成的,另一方面,某些細(xì)菌,如恥垢分支桿菌,其生活史中必定存在多形性[3].在本實驗室的以往實驗中,發(fā)現(xiàn)在同一培養(yǎng)條件下,多株不同動物源的維氏氣單胞菌菌體均存在多形性[4],或許能夠表明維氏氣單胞菌的生活史中同樣存在多形性這一特殊過程,具體在生活史上的哪一階段還有待進(jìn)一步實驗證明.

圖2　基于不同氣單胞菌屬菌株16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

傳統(tǒng)的生理生化、藥敏試驗鑒定和形態(tài)學(xué)觀察只能大致確定菌株的革蘭染色特性和分屬,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,16S rRNA gene序列越來越多的應(yīng)用于細(xì)菌鑒定.在生物的進(jìn)化過程中,16S rRNA gene序列變化十分緩慢,并且在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度保守性,可用于分析生物的進(jìn)化和親緣關(guān)系[5],因此可以用于菌株的鑒定分析.應(yīng)用不同氣單胞菌屬菌株16S rRNA gene序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,可見分離維氏氣單胞菌CC0323與維氏氣單胞菌QXL0711B進(jìn)化關(guān)系最相近,并與其他維氏氣單胞菌菌株同屬一支.綜合生理生化鑒定和生物信息學(xué)分析,可確定分離到的菌株為維氏氣單胞菌.

維氏氣單胞菌是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種病原菌,廣泛存在于水體環(huán)境中,該菌可引起多種經(jīng)濟(jì)魚和觀賞魚發(fā)生疾病,通常表現(xiàn)為病死魚出現(xiàn)腹水及消化道潰瘍、出血[6-10],也可引起人類的腹瀉甚至敗血癥[11-13].經(jīng)過對藍(lán)曼龍魚的半數(shù)致死量測定,可知維氏氣單胞菌CC0323在濃度低時對藍(lán)曼龍魚致病性較弱,但當(dāng)菌濃度達(dá)到一定程度,會在較短時間內(nèi)造成藍(lán)曼龍魚的大量死亡.因此在養(yǎng)殖過程中,應(yīng)密切注意水體中致病微生物,定期做好消毒措施,控制養(yǎng)殖密度,保證水體清潔,防止致病微生物大量增殖,以消除致病菌造成的疾病隱患.

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Isolation,identification and phylogenetic analysis of pathogenic Aeromonas veroniifromTrichogaster trichopterus

CHEN Heng-li,MO Jin-long,KANG Yuan-huan,CHEN Long,BI Jian-fei,ZHANG Dong-xing,LI Fang-fang,LI Ying,SHAN Xiao-feng
(College of animal science and technology,jilin agricultural university,changchun 130118,China)

A bacterial strain CC0323 was isolated from Trichogaster trichopterus,which had definite virulence to the fish after artificial infection.Morphology,physical and chemical characters,and 16S rRNA sequence analysis were used for identification. The results showed that strain CC0323 was gram negative.The isolate was pleomorphic,which could grow in RS agar and show a median,smooth surface,and yellow bacterial colony.The physical and chemical characters and the results of drug sensitivity test were identical with Aeromonas veronii.The phylogenetic analysis between strain CC0323 and A.veronii QXL0711B showed related homology.The results demonstrated that the isolate CC0323 was Aeromonas veronii.

Trichogaster trichopterus;Aeromonas veronii;isolation and identification;16S rRNA;phylogenetic analysis

s:SHAN Xiao-feng;LI Ying

S941.42

A

0529-6005(2016)06-0115-04

2015-05-08

國家自然科學(xué)基金項目(31201927);吉林省重點科技攻關(guān)項目(20150204065NY)

陳亨利(1991-),男,碩士生,從事動物微生物學(xué)研究,E-mail:chl9108@163.com

單曉楓,E-mail:sxf1997@163.com;李影,E-mail: thliying@163.com