狂犬病病毒糖蛋白生物學功能研究進展

汪孟航，朱洪偉，何民輝，溫永俊，程世鵬

（中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟動物分子生物學重點實驗室，長春130112）

狂犬病病毒糖蛋白生物學功能研究進展

汪孟航，朱洪偉，何民輝，溫永俊＊，程世鵬

（中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟動物分子生物學重點實驗室，長春130112）

摘 要：狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus，RABV）感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起的致死性人畜共患傳染病。RABV糖蛋白存在于病毒表面，它既是病毒的主要保護性抗原，誘導體液免疫產(chǎn)生中和抗體和刺激T細胞產(chǎn)生細胞免疫，又是病毒與細胞受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)，在病毒致病性和嗜神經(jīng)性中發(fā)揮重要作用，與病毒毒力直接相關(guān)。作者歸納總結(jié)國內(nèi)外RABV糖蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究進展，并對糖蛋白中和抗體的檢測與評價進行闡述。將為進一步揭示RABV糖蛋白生物學功能奠定基礎(chǔ)，為糖蛋白中和抗體的診斷提供理論參考，為控制和消滅狂犬病做出相應(yīng)貢獻。

關(guān)鍵詞：狂犬??；糖蛋白；中和抗體

狂犬?。╮abies）是一種可感染人與所有溫血動物的烈性人畜共患傳染病，是迄今為止病死率最高的急性傳染病，感染者一旦發(fā)病，死亡率幾乎為100%?？袢〉母腥就緩街饕遣～F或帶毒獸咬傷，主要的帶毒動物有犬、浣熊、臭鼬、蝙蝠和狐貍［1］?？袢〔《荆╮abies virus，RABV）是引發(fā)狂犬病的病原體，屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae）、狂犬病毒屬（Lyssavirus）、血清Ⅰ型病毒，1885年由Loues Pasteur首次分離?？袢〔《緦倏梢苑譃?種不同基因類型，分別是經(jīng)典狂犬病病毒（RABV）、DUVENHAGE病毒（DUVV）、拉各斯蝙蝠狂犬病病毒（LBV）、mokola病毒（MOKL）、歐洲蝙蝠病毒屬（EBLV，分為兩種：基因5型和基因6型，及澳大利亞蝙蝠病毒屬（ABLV）。RABV顆粒在電子顯微鏡下呈現(xiàn)子彈狀，直徑約為75nm，長度為100～300nm。RABV基因組為單股負鏈不分節(jié)段RNA，基因組大小為11 928或11 932bp，含有5種結(jié)構(gòu)基因，從3′端到5′端依次排列為N、P、M、G和L基因?；蚪M在聚合酶的作用下將5種結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄為初級mRNA，經(jīng)歷加帽、甲基化和多聚腺苷酸化后轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒靘RNA，分別編碼核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、糖蛋白（G）和大蛋白（L）。M蛋白形成病毒主要骨架結(jié)構(gòu)，維持病毒正常形態(tài)，還可以刺激增強病毒復制，且具有抑制病毒轉(zhuǎn)錄的作用。N蛋白緊密包裹著病毒RNA，構(gòu)成螺旋狀核衣殼結(jié)構(gòu)，避免基因組RNA遭到細胞核酸酶的破壞，且有研究證實病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄與復制受控于N基因的表達。P蛋白與L蛋白不僅參與組成核衣殼，更在病毒的復制與轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮著重要作用，研究證實N蛋白未與P蛋白、L蛋白相互作用時，病毒的復制與轉(zhuǎn)錄就會出現(xiàn)減少現(xiàn)象［1］。G蛋白是唯一存在于RABV表面的蛋白，它既是RABV的主要保護性抗原，能誘導機體體液免疫產(chǎn)生中和抗體和刺激T細胞作用產(chǎn)生細胞免疫，又是RABV與細胞受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)，在病毒致病性和嗜神經(jīng)性中發(fā)揮重要作用，與病毒毒力直接相關(guān)。鑒于G蛋白在病毒結(jié)構(gòu)蛋白中的重要地位，作者將歸納總結(jié)國內(nèi)外RABV糖蛋白結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)研究，并對糖蛋白中和抗體的檢測與評價進行闡述，為進一步揭示RABV糖蛋白的生物學功能奠定基礎(chǔ)。

1 RABV糖蛋白

G蛋白存在于病毒顆粒表面，其抗原位點可識別宿主細胞的受體并與之結(jié)合，在病毒致病性和嗜神經(jīng)性中發(fā)揮重要作用。G蛋白基因只含有一個ORF，共含有1 675、2 059或2 069個核苷酸，編碼序列長1 575bp。在RABV 5種結(jié)構(gòu)基因中G蛋白基因的變異率最大，同一基因型不同地區(qū)的同源性為80%～100%，不同基因型間的同源性只有50%～75%［2］。G蛋白由524個氨基酸組成，前19個氨基酸構(gòu)成疏水性信號肽，成熟過程中信號肽被切除，最終含有505個氨基酸，相對分子質(zhì)量為56ku，等電點為6.7。

成熟G蛋白從結(jié)構(gòu)上分為3個部分：膜外區(qū)，即1－439位氨基酸，該區(qū)攜帶有RABV主要抗原決定位點，具有強大的免疫原性和抗原性，在受體識別和膜融合過程中發(fā)揮著重要作用；跨膜區(qū)，即440－461位氨基酸，該區(qū)參與G蛋白在病毒脂質(zhì)雙分子層膜上的固定；膜內(nèi)區(qū)，即462－505位氨基酸，該區(qū)位于病毒包膜內(nèi)，并與基質(zhì)蛋白與核蛋白相互作用有關(guān)。G蛋白功能區(qū)單一氨基酸的保守與穩(wěn)定有利于蛋白完整功能的體現(xiàn)，如成熟G蛋白第36位蘇氨酸被脯氨酸替代后，RABV中和抗體無法中和該突變毒株；第39位絲氨酸被蘇氨酸替代后，G蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生改變；第461位半胱氨酸殘基的棕櫚酸化，可將G蛋白在脂質(zhì)雙分子層膜上固定，穩(wěn)定G蛋白空間構(gòu)象并保持其完整功能［3］。另外還發(fā)現(xiàn)了一種存在于病毒細胞培養(yǎng)液中的可溶性G蛋白（Gs），在抗原性上Gs與G蛋白相差不大，但Gs無法正常結(jié)合于病毒顆粒包膜，該病毒顆粒也無法具備正常的感染能力，甚至激發(fā)動物機體產(chǎn)生的中和抗體都出現(xiàn)減少現(xiàn)象，只有G蛋白的1／15左右，這些改變是由于在結(jié)構(gòu)上Gs的C末端跨膜區(qū)缺失58個氨基酸殘基［4］。

G蛋白是RABV結(jié)構(gòu)蛋白中唯一能刺激機體產(chǎn)生中和抗體的蛋白抗原，其蛋白抗原性主要依賴于空間構(gòu)象表位，主要的抗原位點有GⅠ區(qū)、GⅡ區(qū)和GⅢ區(qū)。GⅠ區(qū)既包含空間構(gòu)象抗原表位，又包含線性抗原表位，該抗原位點相對獨立，位于226－231位氨基酸區(qū)段。GⅡ區(qū)抗原保守性較高，具有典型的不連續(xù)性空間構(gòu)象抗原表位，兩個主要抗原表位區(qū)34－42（GⅡb）和198－200（GⅡa）通過二硫鍵相互連接，構(gòu)成G蛋白空間構(gòu)象。GⅢ區(qū)是G蛋白中最主要的抗原位點，包含一段連續(xù)的空間構(gòu)象表位，位于330－338位氨基酸區(qū)段。具有空間構(gòu)象的GⅡ和GⅢ區(qū)不僅是RABV特異性中和抗體的主要結(jié)合位點，而且在蛋白折疊與運輸中具有重要作用。目前，G蛋白上還發(fā)現(xiàn)了其他的線性中和抗原位點GⅤ區(qū)，該位點免疫原性較弱，位于261－264位氨基酸區(qū)段，該區(qū)在不同RABV毒株中高度保守。除了線性位點以外，G蛋白還存在有依賴于單一氨基酸的抗原位點，如位于251位氨基酸的GⅣ區(qū)；位于264位氨基酸的GⅥ區(qū)，GⅥ區(qū)存在于GⅤ區(qū)內(nèi)部［5］。

G蛋白是病毒基因組結(jié)構(gòu)蛋白中唯一的糖基化蛋白，蛋白中糖基化位點和數(shù)目隨不同毒株而改變。一般情況下，具有N－X－T蛋白結(jié)構(gòu)的糖基化效率普遍高于N－X－S蛋白結(jié)構(gòu)，蘇氨酸位點的糖基化效率可比絲氨酸位點高出2～3倍。在成熟G蛋白中發(fā)現(xiàn)了3個主要的糖基化位點：第37位氨基酸糖基化位點，該位點糖基化作用較弱，多數(shù)存在于RABV基因Ⅰ型當中。第158或247位氨基酸糖基化位點，該位點分布較集中，但并不普遍存在，同樣多數(shù)存在于基因Ⅰ型病毒當中。第319位氨基酸糖基化位點，該位點是RABV最主要的糖基化位點，存在于目前所有已知的RABV中，試驗證明利用基因工程手段敲除該位點，病毒G蛋白的免疫原性出現(xiàn)減弱現(xiàn)象，并且推測該位點可能與G蛋白的正確折疊和運輸密切相關(guān)［2］。糖基化結(jié)構(gòu)的存在對RABV G蛋白發(fā)揮其完整的生物學功能和病毒識別具有至關(guān)重要的作用。

2 糖蛋白的生物學功能

2.1糖蛋白與宿主免疫的關(guān)系

RABV G蛋白是病毒基因組結(jié)構(gòu)蛋白中的主要保護性抗原，具有B細胞、T細胞識別位點，能夠誘導宿主細胞發(fā)生細胞免疫和體液免疫應(yīng)答，刺激宿主分泌中和性抗體。G蛋白上的B細胞表位識別位點主要位于GⅡ區(qū)和GⅢ區(qū)，刺激機體產(chǎn)生具有保護作用的IgG免疫球蛋白。假如利用基因工程手段敲除小鼠的B細胞基因，抑制抗病毒中和性抗體的產(chǎn)生，那么疫苗就不能保護宿主抵抗RABV的攻擊。將RABV G蛋白基因克隆入其他病毒載體構(gòu)建的狂犬病毒工程疫苗，可成功刺激機體產(chǎn)生中和抗體，抵抗病毒攻擊。在細胞免疫應(yīng)答方面，G蛋白上的T細胞抗原表位既包含有空間構(gòu)象型，也包含有線性型，能夠有效的刺激T淋巴細胞誘導免疫應(yīng)答。激發(fā)的CD8＋T細胞能夠直接對靶細胞進行殺傷，殺死發(fā)生病變的神經(jīng)細胞，進而清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)中狂犬病毒顆粒，最終引起免疫性病理現(xiàn)象的發(fā)生［6］。但是，CD8＋T細胞介導的免疫應(yīng)答在抗病毒中并不起主要作用，并且其殺傷性具有潛在的危險性，所以應(yīng)盡量誘導宿主機體產(chǎn)生B細胞免疫反應(yīng)和CD4＋T細胞免疫反應(yīng)。Sato等［7］通過比較基因缺失病毒與完整病毒基因的表達水平來驗證G蛋白的作用，該項研究分析了3種不同重組病毒的轉(zhuǎn)基因表達水平與病毒轉(zhuǎn)錄，證實G基因缺失后病毒轉(zhuǎn)錄表達水平升高，但是缺失病毒出現(xiàn)免疫原性下降現(xiàn)象，且G蛋白具有細胞毒性作用。Hu等［8］利用G蛋白基因嵌入痘病毒載體制備重組病毒，證實可誘導免疫動物的體液免疫產(chǎn)生中和抗體和刺激T細胞作用產(chǎn)生細胞免疫。Huang等［9］利用5型副流感病毒作為載體，表達狂犬病毒的G蛋白，作為狂犬病預(yù)防和治療的手段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該重組病毒可使小鼠免受病毒感染至少6d，有潛力作為一種新型預(yù)防狂犬病的方法。類似的疫苗技術(shù)已經(jīng)在美國及歐洲廣泛使用，有效控制了該地區(qū)野生動物狂犬病的流行。

成熟G蛋白分子上約有3個糖基化位點，糖蛋白的糖基化程度與病毒免疫原性息息相關(guān)，且G蛋白分子上的某個氨基酸位點的糖基化可能會增強該蛋白分子的另一端位點糖基化的發(fā)生。試驗證實Asn（247）位點糖基化可以增強Asn（319）位點糖基化的發(fā)生，促使機體產(chǎn)生更強的免疫識別。若降低G蛋白的糖基化程度，則誘導產(chǎn)生的中和抗體含量將大大減少［10］，其原因可能是G蛋白被糖基化修飾后，使得抗原表位更加突出于表面，增強其免疫原性。

2.2糖蛋白與宿主細胞受體的關(guān)系

RABV侵染宿主細胞的過程中，需要與宿主細胞表面受體結(jié)合并識別，其中病毒表面囊膜G蛋白具有介導該結(jié)合過程的最主要作用。煙堿乙酰受體（NachR）是眾多RABV細胞受體中第一個被發(fā)現(xiàn)的，主要存在于肌肉細胞的突觸后膜，有研究顯示，動物機體肌細胞中的煙堿乙酰受體含量越高，該動物對RABV就越易感，兩者呈正相關(guān)。RABV G蛋白具有的四肽空間結(jié)構(gòu)Asn194Ser195Arg196Gly197中，Arg196殘基上的氨基和Asn194殘基的羧基組成的空間構(gòu)象與NachR空間構(gòu)象有較高相似度，進一步表明G蛋白具有結(jié)合煙堿型受體的結(jié)構(gòu)。利用蛋白質(zhì)序列同源性分析，以及活性結(jié)合NachR試驗，發(fā)現(xiàn)RABV G蛋白和蛇毒箭毒樣神經(jīng)毒素蛋白具有同源性，其中G蛋白的第184－214位氨基酸與蛇毒神經(jīng)毒素蛋白的環(huán)形結(jié)構(gòu)同源性最高，進一步的試驗表面金環(huán)蛇神經(jīng)毒素單克隆抗體可對狂犬病毒與NachR的結(jié)合產(chǎn)生抑制作用［11］。然而研究人員發(fā)現(xiàn)，RABV仍然可以感染缺乏NachR的細胞系，進一步利用蛇毒處理降低細胞感染比例也沒有達到預(yù)想效果，這表明除了煙堿乙酰受體還涉及到其他受體分子。

神經(jīng)細胞黏附分子（NCAM）是RABV的新一類細胞受體，該受體的發(fā)現(xiàn)是通過不同細胞株相互比較發(fā)現(xiàn)的。利用特異性抗體或者硫酸素占據(jù)細胞表面上的神經(jīng)細胞黏附分子結(jié)合部位阻斷NCAM，將降低細胞感染狂犬病病毒比例。相反，通過轉(zhuǎn)染NCAM提高細胞表達量，該細胞的病毒易感性也隨之增大。進一步研究表明，感染前將病毒分子與NCAM預(yù)處理，該病毒失去再感染BSR細胞的能力。動物試驗結(jié)果一致，同劑量病毒分別感染野生鼠與缺少NCAM小鼠，缺乏鼠的死亡時間明顯延長［11－12］。RABV表面G蛋白具有吸附NCAM作用，占據(jù)NCAM位點后病毒增殖能力將受到影響。

此外，還有一些種類的狂犬病毒受體被不斷發(fā)現(xiàn)。神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（p75NTR）被證實為RABV 1型與6型病毒受體，通過轉(zhuǎn)染p75NTR進入RABV耐受BSR細胞株，該細胞株重新轉(zhuǎn)變?yōu)镽ABV易感細胞［13］。神經(jīng)營養(yǎng)因子受體與病毒G蛋白結(jié)合參與病毒的內(nèi)吞與運輸。也有報道RABV吸附細胞膜表面的神經(jīng)節(jié)苷脂及磷脂，可感染非神經(jīng)組織細胞并繁殖［11］。

2.3糖蛋白與病毒致病性的關(guān)系

狂犬病的致病性與病毒對神經(jīng)的侵染能力有關(guān)，具有嚴格的神經(jīng)嗜性，能引起所有溫血動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)致死性感染。主要危害感染機體的神經(jīng)系統(tǒng)，病毒在神經(jīng)元細胞漿內(nèi)聚集、增殖形成包涵體，RABV能引起神經(jīng)遞質(zhì)分泌異常和離子通道功能異常。

RABV強毒株與馴化后的弱化毒株在神經(jīng)親嗜性程度上明顯不同，從外周感染部位侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的能力不同。原因主要是病毒基因結(jié)構(gòu)中的糖蛋白（G蛋白）的不同，組織弱化毒株從外周侵犯CNS的能力喪失或有限，而強毒株具有高神經(jīng)親嗜性［14］。研究人員比較了RABV強毒株（SHBRV）與實驗室弱化毒株（CVS－B2C）的臨床表現(xiàn)、致病性及病理變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHBRV的毒力比CVS－B2C強100～1 000倍，CVS－B2C可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起廣泛的炎癥，包括神經(jīng)細胞退行性病變、壞死和凋亡，淋巴細胞和單核細胞浸潤，膠質(zhì)細胞增殖等。相反，SHBRV感染小鼠大腦的病理變化非常輕微，凋亡細胞及CD3＋炎癥細胞數(shù)量顯著低于CVS－B2C感染小鼠［15］。狂犬病的致病性與病毒對神經(jīng)的侵染能力有關(guān)，不同病毒株從外周部位進入神經(jīng)系統(tǒng)的能力有明顯差異，這主要跟RABV G蛋白有關(guān)。Ghanem等［16］利用G蛋白與神經(jīng)細胞侵染能力的關(guān)系，將G基因缺失構(gòu)建重組病毒，使用現(xiàn)代光學追蹤法研究RABV在神經(jīng)元回路中的感染途徑。還有研究表明，RABV固定株（ERA、HEP、CVS）的致病性與位于G蛋白的Ⅲ位點抗原決定簇存在有關(guān)；在成年鼠內(nèi)不管接種劑量和接種途徑，由于G蛋白氨基酸的333位點的突變，使得Arg變成為Gln、Glu、Gly，RABV的致病力大大的降低［17］。Etessami等［18］研究表明，缺失G基因的重組RABV可以感染神經(jīng)元，但不能傳播到下一級神經(jīng)元；說明G蛋白在RABV狂犬病病毒從突觸前穿行到突觸后這一過程中扮演了一個很重要的角色。

狂犬病強毒株在神經(jīng)細胞內(nèi)復制，通過低表達G基因和阻礙促凋亡因子的產(chǎn)生；通過FasL及B7－H1途徑導致游走性T細胞死亡，同時還能保護神經(jīng)元的軸突和樹突免于凋亡和退行性病變，從而保持神經(jīng)元及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的完整性，這種巧妙的免疫逃避策略使病毒在神經(jīng)細胞內(nèi)成功繁殖［19］。Yang等［20］證實RABV引起天然免疫應(yīng)答中樹突狀細胞的激活，該過程依賴于病毒G蛋白的表達，街毒無法激活樹突狀細胞產(chǎn)生天然免疫是因為G基因和與它相關(guān)的前導RNA的低水平表達。Li等［21］推測RABV街毒引起神經(jīng)功能異常是由于神經(jīng)突起變性和突觸結(jié)構(gòu)的破壞，研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)接種RABVN2C株，銀染海馬切片顯示神經(jīng)元突起發(fā)生嚴重的破壞和紊亂。Jackson等在表達黃色熒光蛋白小鼠的足墊內(nèi)接種病毒來觀察神經(jīng)元突起的變化，在發(fā)病晚期，在大腦皮層第五層錐狀神經(jīng)元樹突和軸突出現(xiàn)串珠樣改變和腫脹。大量試驗表明在RABV的感染模型中，神經(jīng)遞質(zhì)包括乙酰膽堿［21－22］、五羥色胺［23］、γ氨基丁酸［24］的表達量存在異常。

3 RABV中和抗體的檢測與評價

RABV G蛋白存在于病毒顆粒表面，是病毒結(jié)構(gòu)蛋白中唯一能刺激機體產(chǎn)生中和抗體的蛋白，依靠其抗原性激發(fā)機體產(chǎn)生中和抗體是G蛋白的重要生物學功能之一。以下將對糖蛋白中和抗體的檢測與評價進行闡述。

3.1中和抗體檢測方法

目前測定RABV中和性抗體水平的方法大致可分為兩種：抗原抗體結(jié)合檢測及病毒中和試驗檢測?？乖贵w結(jié)合檢測方法所使用的抗原，包括全病毒、純化的多肽和模擬表位等類型，通過與RABV不同抗原位點結(jié)合能力進行分析、測定血清或腦脊液（CSF）中的RABV中和抗體含量，并可測定中和抗體的親和力、活性及特異性。一般過程是將所用抗原結(jié)合到試管、平板、圓珠等固體表面，加入待測樣品，抗原抗體反應(yīng)，利用偶聯(lián)熒光標記的二抗結(jié)合或底物反應(yīng)等酶顯色技術(shù)，檢出樣品中和性抗體的活性與含量。本方法的特點是既可檢測與RABV表面抗原結(jié)合的中和性抗體，也可測定與內(nèi)部蛋白抗原結(jié)合的抗體。病毒中和試驗檢測方法是基于神經(jīng)細胞培養(yǎng)，將標準活病毒與待測樣品中和抗體進行中和反應(yīng)后，測定剩余病毒量，進而對待測血清或CSF中RABV中和抗體的含量進行評價的方法［25］。體外細胞培養(yǎng)物中的病毒中和機制，不僅依賴于RABV中和抗體與病毒抗原結(jié)合部位的相互作用，同時也受到神經(jīng)細胞上的表面受體影響。研究表明RABV侵染CNS，一般是通過與CNS細胞上的乙酰膽堿受體、神經(jīng)生長因子受體或神經(jīng)細胞粘附分子結(jié)合，而對于非CNS細胞的侵染，所結(jié)合的其他受體至今仍不清楚［26］。

3.2不同檢測方法的應(yīng)用范圍

實際應(yīng)用中，選用適當?shù)臋z測方法達到使用目的即可?？乖贵w結(jié)合檢測方法可以用于判斷中和性抗體的存在情況，免疫球蛋白的類型，也可用于機體產(chǎn)生中和抗體應(yīng)答的確認。如以診斷RABV感染情況為目的，抗原抗體結(jié)合檢測技術(shù)應(yīng)為首選方法。該方法具有簡單、易用、安全、快速等特點，能夠簡便快捷的達到檢測需求。然而為了測定疫苗接種后的免疫效果，需要對血清中的中和抗體水平及活性進行測定。盡管抗原抗體結(jié)合檢測技術(shù)有眾多優(yōu)點，但是通過中和試驗測定出來的檢測結(jié)果真實性最高，最接近中和抗體的真實抗病毒能力，所以最佳選擇應(yīng)采用病毒中和試驗檢測方法［27］。

3.3檢測方法的評價標準

1992年WHO狂犬委員會第八次報告中，第一次提出將中和抗體效價為0.5IU／mL作為全球公認的保護效力臨界值。報告關(guān)于RABV疫苗接種，指出常與RABV活毒接觸的研究人員、醫(yī)院檢測人員、疫苗生產(chǎn)工作者等需要經(jīng)常檢測自身血清樣品的中和性抗體水平，一旦抗體滴度低于0.5IU／mL，需加強疫苗接種。但是，規(guī)定的中和抗體0.5IU／mL是RABV暴露后，疫苗接種的標準，并不是動物機體有效保護能力標準［28］。Aubert［30］的研究提出利用RFFIT檢測方法測定貓和狗的中和抗體水平，建議其保護性抗體水平臨界值分別是0.1IU／mL和0.2IU／mL。但是已清除RABV地區(qū)引進外地貓和狗時，權(quán)威人士推薦RFFIT或者FAVN檢測結(jié)果保護性抗體水平臨界值為0.5IU／mL，該數(shù)值表明有足夠能力抵抗RABV的侵染［29－30］?？袢∶庖咔虻鞍桩a(chǎn)品的國際參考標準包括：WHO狂犬病免疫球蛋白第一國際標準，WHO狂犬病免疫球蛋白第二國際標準，以及OIE犬類狂犬免疫球蛋白標準。1955年，首次建立了RABV免疫球蛋白的最初國際標準，每安瓿86.6mg凍干疫苗產(chǎn)品，其效力值最低規(guī)定為86.6IU。隨后，于1984年，規(guī)定效價值為59IU為WHO狂犬免疫球蛋白第一國際標準。1993年，將效價值30IU作為WHO狂犬免疫球蛋白的第二國際標準。確立效價值6.7IU作為OIE狂犬免疫球蛋白的國際標準。1997年，USFDA對WHO提供的兩種標準效價值進行驗證對比，2006年，堪薩斯州立大學狂犬病實驗室再次進行了驗證，結(jié)果表明，1997年WHO第一國際標準的效價值相對于第二標準減少了2.5%，而在2006年卻減少了14%。雖然出現(xiàn)的差異沒有統(tǒng)計學意義，但說明了使用不同參考標準對檢測結(jié)果的影響。另外，結(jié)果計算方式對血清樣品中和抗體效價進行評價，將產(chǎn)生截然不同的效價值。Welch等［31］使用的標準臨界值分別為WHO推薦的0.5IU／mL和ACIP推薦的血清稀釋度1∶5，比較3種不同ELISA檢測方法與RFFIT檢測方法的檢測結(jié)果，利用RFFIT檢測方法驗證ELISA檢測方法的穩(wěn)定性與特異性。當使用ACIP的血清稀釋度1∶5測定出結(jié)果，換用WHO的0.5IU／mL時，出現(xiàn)了不同的檢測結(jié)果，證實了臨界值的選定對于疫苗免疫效果的評價的重要性［31］。

實現(xiàn)RABV中和性抗體檢測方法的標準化，能夠?qū)Σ煌瑢嶒炇已芯拷Y(jié)果進行比較，將對抗體特性和疫苗接種效果的評估具有深遠意義。所以任何試驗檢測結(jié)果，都需要標注參考標準以及結(jié)果計算方式。

4 展 望

狂犬病作為歷史悠久的人畜共患病，致死率高，病程痛苦，對其致病機制缺乏明確的認識，造成臨床上尚無有效的治療手段。研究RABVG基因在誘導機體體液免疫產(chǎn)生中和抗體和刺激T細胞作用產(chǎn)生細胞免疫的作用，RABVG基因與細胞受體的結(jié)合機制，RABVG基因在病毒致病性和嗜神經(jīng)性中發(fā)揮的重要作用，對于揭示RABV感染機體、引起神經(jīng)癥狀的致病機制奠定一定的理論基礎(chǔ)。動物體內(nèi)中和抗體水平的高低體現(xiàn)著機體抵抗病毒入侵的能力。RABV中和性抗體的研究，對于抑制RABV的傳播與患病動物的治療中，具有重要現(xiàn)實意義。

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（責任編輯 秦 彤）

中圖分類號：Q71

文獻標識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3349－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.039

收稿日期：2016－05－16

基金項目：寵物疫病快速診斷與疫苗研究與示范（3313022）；狂犬病病毒糖蛋白干預(yù)神經(jīng)突觸體遞質(zhì)釋放循環(huán)功能的分子機制（31572505）

作者簡介：汪孟航（1990－），男，黑龍江齊齊哈爾人，碩士生，研究方向：動物病毒疫苗與分子免疫學，E－mail：wmhtcs＠163.com

通信作者：＊溫永?。?979－），男，內(nèi)蒙古呼和浩特人，副研究員，碩士生導師，研究方向：動物病毒疫苗與分子免疫學，E－mail：wenyongjun＠caas.cn

Advances in Biological Function of Rabies Virus Glycoprotein

WANG Meng－h(huán)ang，ZHU Hong－wei，HE Min－h(huán)ui，WEN Yong－jun＊，CHENG Shi－peng
（StateKeyLaboratoryforMolecularBiologyofSpecialEconomicAnimals，InstituteofWildEconomic AnimalsandPlants，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Changchun130112，China）

Abstract：Rabies is a lethal zoonotic infectious disease caused by rabies virus（RABV），which infected the central nervous system.The RABV glycoprotein exists on the surface of the virus particles，it is a major protective antigen which stimulate the body to produce the humoral immunity and cellular immunity；It is the identification of structure of the cell receptors；It plays an important role in the viral pathogenicity and tropism in the nerve，directly related to the virulence of virus.In this review，we summarized research progress of structure and function of RABV glycoprotein，and also reviewed the detection and evaluation of the neutralizing antibody.All these fundamental studies are important for the control and elimination of the RABV，to provide research basis for further revealing the biological function of RABV glycoprotein.

Key words：rabies；glycoprotein；neutralizing antibody