圈養(yǎng)滇金絲猴糞便可培養(yǎng)菌群的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

黃小蘭，李素華，尹紅斌，許　潔，武　悅

（1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2.云南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南 昆明 650051；3.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460）

圈養(yǎng)滇金絲猴糞便可培養(yǎng)菌群的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

黃小蘭1，李素華1，尹紅斌2，許潔3，武悅1

（1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2.云南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南 昆明 650051；3.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460）

本試驗(yàn)采用選擇性培養(yǎng)基分離了滇金絲猴新鮮糞便5種優(yōu)勢菌，生化反應(yīng)法進(jìn)行菌落鑒定，K-B藥敏紙片法測定細(xì)菌藥物敏感性。結(jié)果顯示，從滇金絲猴糞便中分離鑒定出了7種好氧細(xì)菌：埃希大腸桿菌（Escherichia coli）、志賀菌（Shigella）、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、偽產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）、摩氏摩根菌（Mor?ganella morganii）、屎腸球菌（Entercoccus faecium）、腸球菌PNS-E3（Entercoccus PNS-E3）；3種厭氧菌：糞便擬桿菌（B ster?coris）、乳桿菌（Lactobacillus brevis）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，10種腸道菌對紅霉素、青霉素G、頭孢唑啉、呋喃妥因、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶（復(fù)合）、克林霉素、氯霉素、頭孢他啶、環(huán)丙沙星呈現(xiàn)出不同程度的藥物敏感性。

滇金絲猴；糞便菌群；分離鑒定；藥敏性

滇金絲猴（Rhinopithecus bieti）又名黑白仰鼻猴、黑金絲猴、云南仰鼻猴，隸屬于哺乳綱（Mam?malia），靈長目（Primates），猴科（Cercopithecidae），疣猴亞科（Colobinae），仰鼻猴屬（Rhinopithecus）。滇金絲猴是我國國家Ⅰ級重點(diǎn)保護(hù)物種，現(xiàn)存種群數(shù)量約為1 000～1 500只[1]。雖然眾多學(xué)者與專家從滇金絲猴的生活習(xí)性、棲息地等生態(tài)學(xué)方面做了大量的研究，為制定其保護(hù)舉措提供了理論基礎(chǔ)，但是滇金絲猴種群數(shù)量依舊不容樂觀。患病死亡是滇金絲猴種群瀕危一個不可忽視的因素，在所有野生動物疾病中，消化系統(tǒng)疾?。ㄈ缦涣?、腹瀉等）最為常見[2]。動物機(jī)體腸道內(nèi)定植著大量的細(xì)菌細(xì)胞，數(shù)量多達(dá)1 014個，種類超過500種[3]。一般來說腸道菌群分析最少要分析類桿菌（擬桿菌）、雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸桿菌和腸球菌等這5類菌，大致就包括了下消化道的優(yōu)勢菌群[4]。動物的下消化道菌群即結(jié)腸菌群基本上與糞便菌群無異。因此，采集糞便標(biāo)本可以進(jìn)行腸道菌群分析，尤其是了解下消化道菌群的變化。本研究采用選擇性培養(yǎng)基分離滇金絲猴新鮮糞便5種優(yōu)勢菌，生化法進(jìn)行菌落鑒定，并將分離到的細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)以探討其致病性并篩選臨床治療高敏藥物，以期完善滇金絲猴保護(hù)措施。

1　研究方法

1.1主要試劑營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）、腦心浸出液（brain heart infusion，BHI）、腸桿菌選擇性培養(yǎng)基（luria-bertani，LB）、腸球菌選擇性培養(yǎng)基膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂（bile esculin azide agar，BEA）、雙歧桿菌培養(yǎng)基（bifidobacterium selective agar，BLS）、擬桿菌培養(yǎng)基（bacteroid selective agar，BDS）、乳桿菌培養(yǎng)基（lactobacillus selective agar，MRS），購自青島日水生物技術(shù)有限公司；三糖鐵瓊脂（triple sugar iron agar，TSI）、水解酪蛋白瓊脂（muller-hinton agar，MH）、細(xì)菌生化鑒定管及配套指示劑，均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2樣品采集及增菌培養(yǎng)本研究中的糞便樣品均來自昆明圓通山動物園圈養(yǎng)的1只成年雄性滇金絲猴。取樣時間從2011年11月至2013年2月，每月至少取樣1次，共收集到可進(jìn)行菌群分離培養(yǎng)的糞便樣品16次。取樣前確定滇金絲猴機(jī)體處于健康水平，無排便異常，且1周內(nèi)無抗生素使用史。用無菌鑷子將自然排出的新鮮糞便3份，放入無菌干燥采樣袋內(nèi)，置于冰盒中，30 min內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。同樣的方法取糞便周圍土壤樣品。超凈工作臺內(nèi)剔除糞便樣品表層，并稱取1 g接種于50 mL NB中置于37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行好氧培養(yǎng)24 h。同法處理土樣。另取0.5 g接種于15 mL BHI培養(yǎng)基中，用液體石蠟封口，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行厭氧培養(yǎng)48 h。

1.3菌落的計(jì)數(shù)及檢出率統(tǒng)計(jì)將NB培養(yǎng)液倍比稀釋至10-9，吸取10-5～10-95個稀釋度菌液20 μL接種于LB和BEA上，37℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落的生長情況。BHI培養(yǎng)液倍比稀釋至10-6，方法同上，接種于MRS、BDS、BLS平板，37℃厭氧培養(yǎng)48～72 h后觀察菌落的生長情況。進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，根據(jù)稀釋度計(jì)算菌落數(shù)量，用每克糞便樣品所含的各種微生物數(shù)目的常用對數(shù)表示，即lgN/g。計(jì)算16次菌落數(shù)量的均值，以Mean±SEM表示。將各菌種在16次培養(yǎng)中出現(xiàn)的次數(shù)除以采樣次數(shù)得到其檢出率。

1.4細(xì)菌的分離純化挑取純菌落，接種于各選擇性培養(yǎng)基中，采取劃線法進(jìn)行分離純化。來源于土壤樣品的菌落亦接種于LB培養(yǎng)基進(jìn)行分離純化。

1.5生化鑒定參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[5]，腸桿科細(xì)菌生化鑒定根據(jù)杭州天和腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊第二代15e系統(tǒng)進(jìn)行鑒定；腸球菌生化鑒定采用杭州天和試劑有限公司腸球菌科細(xì)菌生化鑒定套管。針對不同的菌株選擇相應(yīng)的生化試驗(yàn)項(xiàng)目進(jìn)行試驗(yàn)，將細(xì)菌鑒定到屬、種。

1.6藥敏試驗(yàn)按照CLSL（Clinical and Laborato?ry Standards Institute）推著的K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行，測量各種藥物的抑菌圈直徑，以判定藥物對細(xì)菌的抑制作用。判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會（NCCLS）藥敏紙片擴(kuò)散法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1細(xì)菌計(jì)數(shù)5種選擇性培養(yǎng)基上的細(xì)菌菌落數(shù)量及檢出率見表1。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，腸桿菌、腸球菌為滇金絲猴腸道的優(yōu)勢菌群，檢出率為100%，其次為乳桿菌，檢出率為87.5%，擬桿菌、雙歧桿菌的檢出率最低，分別為12.5%、25%。

2.2生化鑒定結(jié)果菌液在選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)24～48 h后，挑取單菌落，通過3代劃線分離培養(yǎng)，得到不同形態(tài)特征的純菌株共27個。從糞便樣品分離到的純菌落分別為19株，土壤樣品分離到8株，其中19株腸桿菌科菌落、3株腸球菌科菌落、5個厭氧菌株。

19株腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)酵革蘭陰性菌有14株，其中有3株均被確定為志賀菌屬（Shigella）；11株確定到種，2株為摩氏摩根菌（Morganella morganii）、6株為大腸埃希菌（Escherichia coli）、1株為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）、2株為黏質(zhì)沙雷桿菌（Serratia marcescens）。非發(fā)酵革蘭陰性桿菌5株均確定到種，2株為偽產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas pseudoalcaligenes）、2株為惡臭假單胞菌（P.putica）、1株為溶血巴斯德菌（Pasteurella trevisan）。根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色特征及菌體形態(tài)及初步鑒定，將試驗(yàn)所得菌落歸為擬桿菌屬、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬3類厭氧菌。3株腸球菌科菌落進(jìn)行生化鑒定，2株為屎腸球菌（Enter?coccus faecium）、1株為腸球菌PNS-E3（Entercoccus PNS-E3），且均確定到種。對分離得到的5個厭氧菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)，最終將此5個菌落中1株確定到種，為糞便擬桿菌（B stercoris）；4株確定到屬：1株為乳桿菌屬（Lactobacillus brevis）、3株為雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）。

經(jīng)鑒定，糞便樣品分離到的菌落與周圍土樣樣品分離到的菌落僅有一種共同的菌落，即大腸埃希菌（Escherichia coli），提示試驗(yàn)過程中以去除了糞便表面的部分為樣品來源具有可行性。

2.3動物藥敏試驗(yàn)結(jié)果本次試驗(yàn)選取了紅霉素（15 μg/片）、青霉素G（10 μg/片）、頭孢唑啉（30 μg/片）、呋喃妥因（300 μg/片）、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶（復(fù)合）（23.75 μg/1.25 μg/片）、克林霉素（20 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、頭孢他啶（30 μg/片）、環(huán)丙沙星（50 μg/片）這9類抗生素藥敏紙片，研究顯示，10種腸道菌對9種藥物呈現(xiàn)出不同程度的藥物敏感性（見表2）。即10種菌都對呋喃妥因、環(huán)丙沙星敏感，對克林霉素產(chǎn)生了耐藥性；5種致病菌都對磺胺甲噁唑/甲氧芐啶（復(fù)合）敏感；屎腸球菌、腸球菌、乳桿菌、雙氣桿菌4種革蘭陽性菌對青霉素G敏感，對氯霉素、紅霉素和頭孢他啶產(chǎn)生了耐藥性；大腸埃希菌、志賀菌、陰溝腸桿菌、偽產(chǎn)堿單胞菌、摩氏摩根菌5種革蘭陰性菌對氯霉素和頭孢他啶敏感，對青霉素G產(chǎn)生了耐藥性。

3　討論

了解健康動物消化道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)，可以監(jiān)測異常生理狀態(tài)以及預(yù)防疾病的發(fā)生，完善野生動物的保護(hù)措施。目前研究者針對大熊貓、朱鹮、魚類等野生動物腸道微生物種類有一定的研究，對于制定合理的保護(hù)舉措提供了一定的參考。鮑楠[6]等從大熊貓糞便中分離鑒定了12種細(xì)菌，依次為鼠李糖乳桿菌、短乳桿菌、多黏芽孢桿菌、耐久腸球菌、兩歧雙歧桿菌、四聯(lián)消化鏈球菌、稍變棒桿菌、面包乳桿菌、大腸埃希菌、變形桿菌、奇異菌、梭菌。史懷平[7]從朱鹮糞便中分離鑒定了22種細(xì)菌，對其中的9種乳酸菌進(jìn)行抑制大腸桿菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩歧雙歧桿菌、最小雙歧桿菌、馬里乳桿菌、瑞士乳桿菌及乳酸鏈球菌對大腸桿菌有明顯的抑制作用，其中最小雙歧桿菌抑菌效果最好，可適合選做微生態(tài)制劑的菌種。顏秉秉[8]等從團(tuán)頭魴腸道中分離純化到4株細(xì)菌，均為革蘭陰性直桿狀菌，分別為鯰魚愛德華菌、摩氏摩根菌、嗜線蟲致病桿菌、弗氏志賀菌。本試驗(yàn)中分離到埃希大腸桿菌、志賀菌、陰溝腸桿菌、偽產(chǎn)堿假單胞菌和摩氏摩根菌5種好氧菌群；屎腸球菌、腸球菌兩種兼性厭氧菌；糞便擬桿菌、乳桿菌、雙歧桿菌3種厭氧菌群，但是仍有一些腸道常見菌群（如韋榮球菌、梭桿菌、葡萄球菌、酵母菌等）未能檢出。經(jīng)分析可能的原因?yàn)椋海?）各地區(qū)的養(yǎng)殖條件、地理環(huán)境、水土成分等不一樣，造成滇金絲猴的腸道菌群的不同，特別是圈養(yǎng)滇金絲猴，長期生活在一個固定的環(huán)境，它們采食的無脊椎動物單一，導(dǎo)致胃腸道內(nèi)的菌群長期處于一個比較固定的動態(tài)平衡中；（2）此外，取樣滇金絲猴為人工飼養(yǎng)，飲食結(jié)果單一，可能對腸道菌群的多樣性有一定影響。

本次試驗(yàn)選取的滇金絲猴是圈養(yǎng)的，在臨床少見抗生素的使用及濫用，因此試驗(yàn)中選擇的臨床常用的抗生素，藥物反應(yīng)依舊表現(xiàn)敏感。但是分離出的5種致病菌均對青霉素G、克林霉素均產(chǎn)生了耐藥性，是因?yàn)檫@5種菌均為革蘭陰性菌，而革蘭陽性菌通常對青霉素類、克林霉素等高度敏感，革蘭陰性菌對第3代頭孢菌素（頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松等）、氨基糖苷類（慶大霉素、妥布霉素等）高度敏感，對鏈霉素、頭孢菌素類和第2代頭孢菌素也較敏感。

[1]龍勇誠，鐘泰，肖李.滇金絲猴地理分布、種群數(shù)量與相關(guān)生態(tài)學(xué)的研究[J].動物學(xué)研究，1996，17（4）：437-441．

[2]黃恭情.野生動物疾病及防治[M].北京：中國林業(yè)出版社，2001.

[3]Shen J，Zhang B R，Wei G F，et al.Molecular profiling of the Clostridium leptum subgroup in human fecal microflora by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis and clone library analysis [J].Appl Environ Mierobiol，2006，72：5232-5238.

[4]王凱.斷奶前后健康仔豬與腹瀉仔豬糞便菌群的比較研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007．

[5]布坎南RE.伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M].8版，中國科學(xué)院微生物研究所，譯.北京：科學(xué)出版社，1984：382-462．

[6]鮑楠，劉成君，譚志，等.野外放歸大熊貓腸道菌群變化的研究[J].畜牧與獸醫(yī)，2005，37（8）：10-13．

[7]史懷平，楊增岐，操勝.健康朱鶚消化道正常菌群的分離與鑒定[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008，36 （3）：69-74．

[8]顏秉秉，呂愛軍，駱偉潔.團(tuán)頭魴腸道細(xì)菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（12）：164-167．

Species Identification and Drug Sensitivity Study of Fecal Bacteria fromRhinopithecus bieti

HUANG Xiao-lan1，LI Su-hua1，YIN Hong-bin2，XU Jie3，WU Yue1
（1.College of Life Sciences，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China；2.Yunnan Animal Health Inspection，Kunming 650051，China；3.Department of Veterinary Medicine，Rongchang Campus，Southwest University，Chongqing 402460，China）

In this study，the selective medium was used to isolate and identify the five dominant bacteria strains in fresh feces of Rhinopithecus bieti，and then K-B susceptibility paper method was used to investigate the antibiotic susceptibility.Ten bacteria were isolated and identified by using morphological and cultural characteristics，which included seven aerobic bacteria，Escherichia coli，Shigella，Enterobacter cloacae，Pseudomonas pseudoalcaligenes，Morganella morganii，Entercoccus faecium，Entercoccus PNSE3，and three anaerobic ones，B stercoris，Lactobacillus brevis and Bifidobacterium.K-B susceptibility experiment showed that ten kinds of intestinal bacteria displayed distinct susceptibility to erythromycin，penicillin G，cefazolin，nitrofurantoin，sulfamethoxa?zole/trimethoprim（composite），clindamycin，chloramphenicol，ceftazidime，and ciprofloxacin.

Rhinopithecus bieti；fecal bacteria；isolation and identification；antibiotic Susceptibility

LI Su-hua

S865.1+6

A

0529-6005（2016）07-0092-03

2015-07-31

云南省生物多樣性基金資助項(xiàng)目；云南省優(yōu)勢特色重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)一級學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（50097505）

黃小蘭（1990-），女，碩士，研究方向?yàn)閯游锷鷳B(tài)學(xué)，E-mail：1067716681@qq.com

李素華，E-mail：li.suhua@hotmail.com