乳酸菌作為DNA疫苗載體的研究進展

劉　晶，楊桂連，王春鳳，姜延龍

（吉林農業(yè)大學動物科學技術學院 吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心，吉林 長春 130118）

乳酸菌作為DNA疫苗載體的研究進展

劉晶，楊桂連，王春鳳，姜延龍

（吉林農業(yè)大學動物科學技術學院 吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心，吉林 長春 130118）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）屬于革蘭陽性、兼性厭氧菌，其基因組中GC含量較低，是一類可以利用碳水化合物發(fā)酵產生乳酸的一類菌的總稱，包括腸球菌、乳桿菌、乳球菌、明串珠菌、片球菌、鏈球菌和雙歧桿菌等眾多種屬，被廣泛地應用于食品發(fā)酵、醫(yī)藥生產、保健藥物及飼料添加劑等工業(yè)，美國食品和藥品監(jiān)督管理局（FDA）將乳酸菌認定為安全的食品級微生物[1]。乳酸菌最重要的特點是具有高度安全性，已成為一種新型載體[2]，替代了像病原微生物、脂質體和微粒子等各種細菌的弱毒菌株之類的載體。

1　乳酸菌表達系統(tǒng)的特點

乳酸菌作為一種原核表達系統(tǒng)，在保證機體安全的前提下，能夠發(fā)揮持續(xù)且高效的免疫力。Pouwels等人[3]的試驗表明，乳酸桿菌表達系統(tǒng)可將外源蛋白表達于菌體細胞內，且能誘發(fā)針對該抗原的局部或全身黏膜免疫應答，并表明乳酸桿菌作為活菌的疫苗抗原載體能夠表現(xiàn)出較高的安全性。LAB之所以能作為極具應用前景的理想抗原呈遞載體，原因有以下幾點：（1）易培養(yǎng)，且某些菌種可構建出新的表達載體系統(tǒng)；（2）遺傳操作方法簡便、重復性好且效率高；（3）能保障基因工程產品的相對安全性，構建出可供直接口服的食品級表達系統(tǒng)；（4）具有高度可調控的啟動子系統(tǒng)，能表達毒素基因；（5）外源蛋白在細胞內外均可獲得良好的表達效果；（6）能夠有效引起機體的免疫反應和免疫耐受，且持續(xù)時間較長；（7）乳酸菌安全，表達的外源蛋白無需進行純化，就可直接連同菌體一起服用。

2　DNA疫苗

DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是在分子生物學技術基礎上發(fā)展起來的第3代新型疫苗，其生產過程主要是借助基因重組技術，定向構建含病原體抗原基因片段的重組DNA真核表達載體。

2.1DNA疫苗的優(yōu)點相對于原核表達，DNA疫苗最大的優(yōu)點是其可以在遞送病毒或寄生蟲抗原的過程中，對抗原表位進行翻譯后的糖基化加工，這對某些抗原表位的構象非常重要，而原核表達系統(tǒng)中沒有糖基化過程，因此更適用于原核病原菌。

2.2DNA疫苗的不足 作為一種基因調控手段，DNA疫苗必需攜帶外源基因，外源基因導入機體后，存在激活宿主內源性原癌基因或使宿主抑癌基因失活的可能性，并且疫苗具有較低的免疫原性[4]，還能引發(fā)機體產生抗DNA抗體，人們已檢測出DNA疫苗并沒有相關整合到宿主細胞的基因組[5]。

3　乳酸菌在DNA疫苗中的作用

乳酸菌屬于食品級的細菌，其本身可作為DNA疫苗載體，但無侵入能力，因此遞送DNA的能力不強；而一些弱致病菌如減毒沙門菌由于其可侵入到細胞中，可以更好的遞送DNA。因此可模擬病原菌的侵入過程，構建侵入型重組乳酸菌，使其具有更好的遞送能力。

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是一種較為典型的乳酸菌，由于其沒有致病性，所以較安全。乳酸乳球菌可以大量產生并遞送抗原及細胞因子，最近已成為口服DNA疫苗的運載工具。為了增加DNA的遞送能力，科研人員對乳酸菌進行了改造以期獲得具有侵入能力的乳酸菌。金黃色葡萄球菌是一種具有侵入宿主細胞能力的病原菌，研究表明其細菌表面表達的纖連蛋白結合蛋白A（FnBPA）對其侵入能力至關重要[6]，因此在乳酸乳球菌中表達外源FnBPA后將使乳球菌本身獲得侵入細胞的能力。此外，一種被稱作pValac的新型質粒也可在乳酸菌中進行表達，進而成為構建真核DNA疫苗的一種載體，這種新型質粒包括巨細胞病毒啟動子（pCMV）和來自牛生長激素（BGH）中的聚腺苷酸化序列（polyA）兩個部分?？蒲腥藛T將含有綠色熒光蛋白（GFP）的pValac質粒分別轉染至PK15及Caco-2細胞中并獲得了表達[7]。由于乳酸乳球菌沒有定植能力，因此只能在黏膜水平上對蛋白質進行加工傳遞[8]，并且乳酸乳球菌在體內和體外[9]均能將功能完整的質粒遞送到真核細胞中。為了進一步提高乳酸菌的細胞侵入能力，科研人員在乳酸乳球菌中表達了外源蛋白FnBPA和InIA（產單核細胞內化蛋白），并通過體內試驗和體外試驗檢測FnBPA及InIA的表達情況。試驗結果表明，外源侵入型蛋白的表達有效增強了乳酸菌的細胞侵入能力。Danie?la Pontes和Silvia Innocentin等人[10]已證明了表達FnBPA的乳酸菌菌株FnBPA+是體內傳遞質粒的最佳選擇載體，而且不管是在體內的胃腸道中還是在體外細胞中，表達了FnBPA或InIA的乳酸乳球菌都能提高質粒的轉移效率[11]。

乳酸菌中另一典型的菌種則是乳桿菌屬中的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），此菌具有免疫調節(jié)作用，同時具有佐劑的特性[12]。之前有研究表明，植物乳桿菌能夠對醫(yī)學上重要的蛋白質進行改進，并且能夠以多種方式對其進行表面錨定。由于乳酸菌能夠將cDNA遞送到宿主細胞，因此為了提高乳酸菌遞送DNA的能力，Michon Christophe和 Katarzyna Kuczkowska等人[13]構建了表面錨定表達針對DEC-205的重組單鏈抗體（aDec）的植物乳桿菌。DEC-205是位于樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）表面的一個受體。其特異性抗體在乳桿菌表面表達能增強乳桿菌對DC的靶向作用及結合能力，從而提高cDNA向DC的傳遞能力。無論是在體外的細胞中還是在體內的胃腸道中，aDec在菌種表面上的表達都能提高質粒由乳酸菌進入到樹突狀細胞的傳遞效率。

針對上述對乳酸乳球菌和植物乳桿菌的介紹，可見構建一種侵入型的乳酸菌，使其作為DNA疫苗的載體，這對DNA疫苗傳遞載體的選擇至關重要。

4　乳酸菌作為DNA疫苗載體的優(yōu)勢

使用乳酸菌作為DNA疫苗載體具有以下幾點優(yōu)勢：（1）口服DNA疫苗載體能夠通過誘導局部的IgA免疫反應產生特異性保護對抗食物過敏；（2）與裸質粒DNA的免疫進行對比，不需要進一步的質粒擴增和純化，能夠降低成本和勞動；（3）乳酸菌是食品級的細菌，與類似的傳遞病原體的系統(tǒng)相比，能傳遞只編碼所需抗原的基因；（4）可避免像減毒沙門細菌作為疫苗載體的一些缺點。

5　展望

自從乳酸菌的第一次報道至今已有20多年歷史，關于乳酸菌作為疫苗載體的許多研究均有報道。大多數(shù)研究者使用乳酸菌作為外源蛋白載體對人體進行免疫，從而抵抗通過消化道和呼吸道黏膜進入人體內的病原體。由于DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比沒有主動侵入性，是一個依賴載體的被動俘獲過程，因此可模擬病原菌的侵入過程，從而能更好的將DNA遞送到細胞內?？梢娙樗峋鳛镈NA疫苗載體具有很好的研究價值[14]，將會成為未來研究熱點。

[1]任晟誠，艾春青，張秋香，等.乳酸菌作為黏膜重組疫苗呈遞載體的研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2014，5（4）：983-989.

[2]Agnieszka Wyszyńska，Patrycja Kobierecka，Jacek Bardowski，et al.Lactic acid bacteria-20 years exploring their potential as live vectors for mucosal vaccination[J].Appl Microbiol Biotechnol，2015，99：2967-2977.

[3]郭衍冰.樹突狀細胞誘導肽重組NDV HN基因乳酸菌的制備及免疫效果檢測[D].長春：吉林農業(yè)大學，2014.

[4]Sidgi Syed Anwer Abdo Hasson，Juma Khalifa Zayid Al-Busaidi，Talal Abdulmalek Sallam.The past，current and future trends in DNA vaccine immunizations[J].Asian Pac J Trop Biomed，2015，5 （5）：344-353.

[5]Sheets R L，Stein J，Manetz T S，et al.Biodistribution of DNA Plasmid Vaccines against HIV-1，Ebola，Severe Acute Respirato?ry Syndrome，or West Nile Virus Is Similar，without Integration，Despite Differing Plasmid Backbones or Gene Inserts[J].Toxico?logical Sciences，2006，91：610-619.

[6]Vanessa Bastos Pereira，Tessália Diniz Luerce Saraiva，Bianca Mendes Souza.Development of a new DNA vaccine based on my?cobacterial ESAT-6 antigen delivered by recombinant invasive Lactococcus lactis FnBPA+[J].Appl Microbiol Biotechnol，2015，99：1817-1826.

[7]Guimar?es V，Innocentin S，Chatel J M，et al.A new plasmid vec?tor for DNA delivery using lactococci[J].Genet Vaccines Ther，2009，7：1-24.

[8]Wells J M，Mercenier A.Mucosal delivery of therapeutic and pro?phylactic molecules using lactic acid bacteria[J].Nat Rev Microbi?ol，2008，6：349-362.

[9]Chatel J M，Pothelune L，Ah-Leung S，et al.In vivo transfer of plasmid from food-grade transiting lactococci to murine epithelial cells[J].Gene Ther，2008，15：1184-1190.

[10]Pontes D，Innocentin S，del Carmen S，et al.Production of Fibro?nectin Binding Protein A at the Surface of Lactococcus lactis In?creases Plasmid Transfer In Vitro and In Vivo[J].PLoS ONE，2012，7（9）：e44892.

[11]Pontes D，Azevedo M，Innocentin S，et al.Immune response elicited by DNA vaccination using Lactococcus lactis is modified by the production of surface exposed pathogenic protein[J].PLoS One，2014，9：e84509.

[12]Bron P A，van Baarlen P，Kleerebezem M.Emerging molecular in? sights into the interaction between probiotics and the host intesti?nal mucosa[J].Nat Rev Microbiol，2012，10：66-78.

[13]Michon Christophe，Katarzyna Kuczkowska，Philippe Langella，et al.Surface display of an anti-DEC-205 single chain Fv fragment in Lactobacillus plantarum increases internalization and plasmid transfer to dendritic cells in vitro and in vivo[J].Microb Cell Fact，2015，14：95.

[14]Sadnand S.Vaccination：the present and the future[J].Yale J Biol Med，2011，84（4）：35.

Q78文獻標志碼：A

0529-6005（2016）07-0067-02

2015-08-10

國家863計劃項目（2013AA102806，2011AA10A215）；國家自然科學基金項目（31272552，31272541）；吉林省科技發(fā)展計劃項目（20111816）；吉林省世行貸款農產品質量安全項目（2011-Y07）

劉晶（1991-），女，碩士生，研究方向動物微生態(tài)與黏膜免疫學，E-ail：1558755144@qq.com

姜延龍，E-mail：yjiang81@126.com