A型流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的研究進展

楊　威，王春鳳

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心，吉林 長春 130118）

A型流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的研究進展

楊威，王春鳳

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 吉林省動物微生態(tài)制劑工程研究中心，吉林 長春 130118）

A型流感病毒是引發(fā)人類和其他動物的高度接觸性呼吸道感染的一種重要病原體，對公共健康是造成了持續(xù)性威脅。由于其分段RNA的快速變化，導(dǎo)致了新的、未知的亞型出現(xiàn)，其中部分亞型可能造成流感大流行，給人類和畜禽造成巨大損失。A型流感病毒屬正黏病毒科，血清學(xué)上可分為18個血凝素（HA，H1-H18）亞型和11個神經(jīng)氨酸酶（NA，N1-N11）亞型[1]，其基因組由8個單鏈負股RNA片段構(gòu)成，可編碼17種不同蛋白質(zhì)[2]，其中HA，PB1-F2和NS1這3種蛋白對于病毒的毒力發(fā)揮具有重要作用。NS1蛋白是一種重要的毒力因子，可以與多種細胞蛋白相互作用，抑制宿主細胞的抗病毒反應(yīng)。鑒于NS1蛋白的特殊結(jié)構(gòu)和重要功能，當前國內(nèi)外已將其作為一種流感病毒的治療靶標，并逐漸將其應(yīng)用到流感病毒的鑒別診斷及疫苗的研制當中。

1　A型流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1

1.1NS基因及其編碼蛋白NS基因位于甲型流感病毒基因組中的第8分段，可編碼3種不同的蛋白質(zhì)，分別為非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1）、核輸出蛋白（NS2），以及最新發(fā)現(xiàn)的流感病毒蛋白（NS3）。NS1蛋白氨基酸序列長度在215～237之間，僅見于感染的細胞中，該蛋白在病毒感染早期大量合成，感染晚期會轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)中。NS2蛋白也稱為核輸出蛋白（Nuclear Export Protein，NEP），由不連續(xù)閱讀框編碼的121個氨基酸組成，合成較NS1蛋白晚，主要在病毒感染晚期合成，且在成熟的病毒粒子中少量存在，結(jié)構(gòu)高度保守。NS3蛋白于2012年首次報道，由NS3 mRNA編碼的194個氨基酸組成，在感染的細胞中穩(wěn)定性較好。

1.2NS1蛋白的結(jié)構(gòu)NS1蛋白由兩個不同功能的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，分別為：RNA結(jié)合域（RNA-bind?ing Domain，RBD）和RNA效應(yīng)域（Effector Domain，ED），兩個結(jié)構(gòu)域由Loop區(qū)連接。RBD位于N末端，由3個α螺旋構(gòu)成，氨基酸序列為1～73，第19～38位氨基酸為核心序列。RBD能形成一種獨特的六螺旋二聚體，可與雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）結(jié)合。在與雙鏈RNA結(jié)合的氨基酸中，只有R38氨基酸是必需的，但其相鄰的氨基酸也發(fā)揮一定的作用。ED位于C末端，由7 個β鏈和3個α螺旋構(gòu)成，氨基酸序列為85到末端，第134～161位氨基酸為核心序列。ED可以與一些細胞蛋白質(zhì)結(jié)合并使其二聚化，進而加強NS1蛋白與細胞蛋白的相互作用。此外，絕大多數(shù)NS1蛋白的RBD含有一個核輸出信號，因此，NS1蛋白可以同時在細胞質(zhì)和細胞核發(fā)揮功能。相關(guān)學(xué)者利用X射線衍射技術(shù)發(fā)現(xiàn)NS1蛋白并不是簡單的二聚體結(jié)構(gòu)。Xu等[3]通過構(gòu)建α碳的空間填充模型顯示出NS1結(jié)合域的二聚體位于帶狀結(jié)構(gòu)上陽性選擇的第22到26位點，由于其無序殘基上的定位不可用，C末端的殘基（第205位及以后）沒能顯現(xiàn)出來。

2　A型流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的功能

NS1蛋白的主要作用是抑制宿主免疫應(yīng)答，尤其是對干擾素產(chǎn)生的抑制和對干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白（如雙鏈RNA依賴性蛋白激酶R（Dou?ble-stranded RNA-dependent protein kinase，PKR）和2′，5′-A合成酶（2′-5′oligoadenylate synthetase，OAS）/RNase L）的抗病毒作用的抑制。此外，NS1蛋白也可直接調(diào)節(jié)病毒復(fù)制周期，包括病毒RNA復(fù)制，病毒蛋白的合成，并對一般宿主細胞生理指標產(chǎn)生影響等。

2.1在病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄中的作用NS1蛋白可通過激活和抑制宿主的各種生化途徑來與宿主細胞蛋白相互作用，從而有助于病毒更有效的復(fù)制，如NS1蛋白可與裂解及腺苷酸化特異因子30 （Cleavage and Polyadeny lation Specificity Protein30，CPSF30）相互作用對mRNA進行剪切，與U6小核RNA（small nuclear RNA，snRNA）的結(jié)合可抑制宿主mRNA剪接。NS1蛋白與真核翻譯起始因子 4GI（eukaryotic translation initiation factor 4GI，eIF4GI）和多聚A結(jié)合蛋白II[poly（A）binding pro? tein II，PABPII]相互作用來調(diào)節(jié)病毒蛋白的合成。Yodsheewan等[4]研究發(fā)現(xiàn)，NS1蛋白可直接與CPSF30和PABPII結(jié)合進而抑制細胞mRNA前體的加工處理、還能和eIF4GI及PABPI相互作用使它們回流到病毒mRNA 5'末端增強病毒的翻譯。磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）的信號通路對于病毒的復(fù)制至關(guān)重要，NS1蛋白能與PI3K的調(diào)節(jié)性亞基P85β相互作用，導(dǎo)致PI3K通路激活，加強病毒的復(fù)制。

2.2對宿主免疫系統(tǒng)的抑制作用NS1蛋白主要通過兩個方式擾亂宿主的免疫系統(tǒng)：結(jié)合RNA阻止細胞因子激活和抑制宿主細胞蛋白的合成。與RNA結(jié)合可以防止宿主細胞因子（PKR，RIG-I和2′-5′OAS）的激活，這些宿主細胞因子能識別異常的核糖核苷酸結(jié)構(gòu)，例如雙鏈RNA和病毒ssRNA。NS1蛋白與宿主蛋白相互作用機制是非常復(fù)雜的，在干擾素基因轉(zhuǎn)錄前或轉(zhuǎn)錄后，NS1蛋白可阻止各種干擾素途徑的激活，從而防止細胞抗病毒狀態(tài)的激活。NS1蛋白與TRIM25相互作用導(dǎo)致PKR和RIG-I失活致使干擾素基因預(yù)轉(zhuǎn)錄發(fā)生抑制，從而有效地防止了干擾素轉(zhuǎn)錄信號傳導(dǎo)的激活。干擾素基因的轉(zhuǎn)錄后抑制是通過NS1蛋白與CPSF30和PABP結(jié)合，阻止了細胞mRNA的核輸出實現(xiàn)的。NS1蛋白能與snRNA結(jié)合，阻斷mRNA前體的剪切，從而抑制宿主細胞mRNA的核輸出。NS1蛋白通過與特定細胞蛋白結(jié)合致使細胞內(nèi)各相關(guān)因子功能受阻，進而抑制宿主細胞蛋白的合成。

2.3對干擾素的拮抗作用Yavarian等[5]研究發(fā)現(xiàn)，NS1蛋白對IFN-β具有拮抗作用，可使病毒高效復(fù)制，由于各型病毒抵制細胞干擾素系統(tǒng)的能力不同，NS1蛋白的作用也存在差異，并因此對病毒的致病性也會造成不同的影響。Maite等[6]研究發(fā)現(xiàn)，缺乏NS1蛋白表達的病毒不能在正常細胞中增殖，但在缺乏產(chǎn)生干擾素能力的細胞中卻可以存活。John等[7]研究發(fā)現(xiàn)，即便是截短NS1的蛋白，仍然可以誘導(dǎo)高強度的干擾素拮抗反應(yīng)。Li 等[8]證實，NS1蛋白主要對宿主細胞的Ⅰ型干擾素系統(tǒng)進行抑制。NS1蛋白還能通過調(diào)節(jié)相關(guān)的基因的表達，干擾樹突狀細胞（DC）的成熟和遷移，使樹突狀細胞（DC）無法刺激Th1細胞分泌IFN-β。此外，并不是每種亞型的NS1蛋白都具有拮抗干擾素的作用，NS1蛋白氨基酸序列中第92位的谷氨酸是決定這種拮抗作用的重要因素，研究發(fā)現(xiàn)，第92位谷氨酸的存在有利于病毒對干擾素的抵抗能力及病毒毒力的增強，但是具體機制不詳。

2.4調(diào)控宿主細胞的凋亡細胞凋亡是一種程序性細胞死亡，在淋巴組織和淋巴細胞之間具有重要的平衡作用。NS1蛋白可以阻塞，也可以激活細胞凋亡的信號通路，通過這種雙重作用對細胞凋亡進行調(diào)節(jié)，以確保病毒高效的復(fù)制。

2.4.1抑制細胞凋亡Zhang[9]等研究顯示，H3N2型豬流感病毒中的NS1蛋白可通過調(diào)控宿主反應(yīng)來拮抗MAVS介導(dǎo)的細胞凋亡。Sasaki等[10]研究表明，相對于野生型（WT）病毒，MFPTr病毒能通過抑制Akt磷酸化來抑制caspase-3和PARP-1的裂解進而抑制細胞凋亡的誘導(dǎo)。David等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在感染野生型病毒的MRC-5或A549細胞中，NS1蛋白的組成型表達不能阻止因細胞凋亡引起細胞死亡，表明NS1并不直接抗凋亡。Atsu?shi等[12]研究表明，NS1蛋白可通過抑制JNK信號通路的活化來抑制細胞凋亡。

2.4.2誘導(dǎo)細胞凋亡Luis等[13]研究表明，在病毒感染期間，部分細胞凋亡的誘導(dǎo)與A/NS1蛋白有關(guān)，但B/NS1蛋白沒有類似的功能。Zhirnov等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當轉(zhuǎn)染流感病毒的細胞過度增殖時，可促使NS1蛋白誘導(dǎo)細胞凋亡。Zhang等[15]將H5N1型流感病毒的NS1基因與pCMV-Myc載體相連，并轉(zhuǎn)染進A549細胞，發(fā)現(xiàn)其表達產(chǎn)物可以誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。

2.5在流感病毒鑒別診斷中的應(yīng)用A型流感病毒具有十分廣闊的宿主范圍，但一些動物感染病毒后，其臨床癥狀不明顯，難以區(qū)分感染動物和免疫動物。由于NS1蛋白僅存于感染細胞中，所以感染動物體內(nèi)存在NS1蛋白的特異性抗體，而接種傳統(tǒng)疫苗的免疫動物則沒有，因此即可區(qū)分感染動物和免疫動物。研究發(fā)現(xiàn)，用禽流感病毒NS1蛋白作為包被抗原對感染和免疫家禽樣品進行ELISA檢測，其區(qū)分效果較為明顯。相關(guān)學(xué)者通過表達126個氨基酸的NS1蛋白，拯救出了豬流感的弱毒株，對同型和異型毒株的感染都具有抵抗作用，且在感染豬中檢測到NS1抗體，因此，可通過檢測NS1抗體來確定免疫動物是否感染野毒。

3　展望

A型流感病毒在全球范圍內(nèi)引發(fā)嚴重的公共安全問題，NS1蛋白對其毒力的發(fā)揮具有重要作用。隨著對NS1蛋白的深入研究，當前已將其作為藥物開發(fā)的新途徑，并已取得階段性實驗成果，如dsRNA-NS1的相互作用，可促使先天免疫功能恢復(fù)和病毒復(fù)制抑制。NS1蛋白的磷酸化修飾被證明對病毒的復(fù)制可能是一種負調(diào)控，且不會明顯地改變其細胞定位，所以可通過加強對NS1蛋白的磷酸化修飾對病毒的復(fù)制進行抑制。目前，NS1缺陷型流感病毒疫苗的試驗也取得了良好的效果，研究表明，這種疫苗安全且可誘發(fā)顯著的抗體水平。鑒于NS1蛋白的結(jié)構(gòu)特性和重要功能，我們相信其在防治流感病毒感染上必將有著廣闊的應(yīng)用前景。

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S852.65文獻標志碼：A

0529-6005（2016）07-0061-03

2015-09-10

楊威（1990-），男，碩士生，主要從事動物微生態(tài)與黏膜免疫的研究，E-mail：648104946@qq.com

王春鳳，E-mail：wangchunfeng@jlau.edu.cn