ZNF268基因在實體瘤中的差異拼接模式

朱晨剛, 郭明雄, 邵煥杰

(1 貴州師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽 550018；

2 武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 430072；

3 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 西安 710119)

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ZNF268基因在實體瘤中的差異拼接模式

朱晨剛1,2, 郭明雄2, 邵煥杰3*

(1 貴州師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽 550018；

2 武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 430072；

3 陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 西安 710119)

摘要：為研究ZNF268基因在癌癥發(fā)生過程中的作用，以17例正常人外周血為對照，收集并分析了5例實體瘤標(biāo)本。通過提取總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用PCR、巢式PCR和測序的方法調(diào)查ZNF268在樣本中的表達模式。結(jié)果顯示，ZNF268基因在實體瘤中的差異拼接模式明顯不同于正常人外周血。剪切本ZNF268a在正常人外周血中表達概率為100%，而在實體瘤樣本中為0。該結(jié)果提示剪切本ZNF268a消失與細胞癌變密切相關(guān)，是潛在的癌癥診斷分子標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：ZNF268基因； 異常差異剪切； 實體瘤； 分子標(biāo)記

肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌等實體瘤是我國主要的癌癥發(fā)病形式，發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平[1-2]。引發(fā)腫瘤的因素有很多，包括放射性物質(zhì)、環(huán)境污染、病毒感染、先天遺傳和個人生活習(xí)慣等。這些因素作用于染色體DNA，導(dǎo)致基因功能紊亂，促成細胞永生化無序生長并發(fā)生轉(zhuǎn)移。因為轉(zhuǎn)錄因子在功能上的特殊性，在細胞癌變過程中有非常重要的作用。在高等脊椎動物細胞中，很大一部分轉(zhuǎn)錄因子由鋅指蛋白組成[3-6]。近幾十年的研究也證明，鋅指蛋白與惡性腫瘤發(fā)生有很高的關(guān)聯(lián)性，如：WT1、GATA1基因等[7-10]。

人類鋅指蛋白基因ZNF268來源于3~5周齡胚胎cDNA文庫，編碼典型的KRAB/C2H2型鋅指蛋白[11-12]。前期研究表明ZNF268在胚胎肝臟細胞內(nèi)高表達，與造血功能密切相關(guān)[12-13]。Krackhardt等利用改進的SEREX方法鑒定出14個慢性淋巴細胞白血病特異性抗原，其中之一就是ZNF268的一種剪接本KW4[14]。近期研究結(jié)果顯示，通過GATA1下調(diào)ZNF268表達，能夠促進K562細胞增殖，ZNF268異常表達則影響卵巢腫瘤的生長和遷移，ZNF268通過強化NF-ΚB信號參與宮頸癌發(fā)生[15-17]。對啟動子功能研究顯示，ZNF268基因受到CREB因子調(diào)控，該因子是一種原癌基因并參與急性髓性白血病發(fā)生[18-19]。這些實驗證據(jù)表明ZNF268基因在癌癥發(fā)生過程中有重要作用。

差異拼接顯著增加了人類基因組所編碼的蛋白質(zhì)。一個基因在發(fā)揮功能時，所應(yīng)對的拼接模式是恒定的，異常的拼接模式常與疾病關(guān)聯(lián)，成為病變發(fā)生和診斷的分子標(biāo)記[20-22]。考慮到ZNF268基因在癌癥發(fā)生中的作用，調(diào)查該基因在實體瘤中的拼接模式是研究其功能的重要方面。本文以17例正常人外周血樣本為對照，使用RT-PCR、巢式PCR和測序的方法分析ZNF268基因在5例實體瘤樣本中的差異拼接模式。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄本ZNF268a在正常人外周血中表達率為100%，而在實體瘤組織中為0。該結(jié)果提示ZNF268a消失與癌癥發(fā)生密切相關(guān)，是潛在的癌癥診斷分子標(biāo)記。

1材料和方法

1.1實體瘤和正常人外周血樣本

經(jīng)患者同意，在華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院收集到5例實體瘤樣本，分別是胃癌2例、結(jié)腸癌1例、肝癌1例、乳腺癌1例。經(jīng)同意，在武漢大學(xué)校醫(yī)院收集到17例正常人外周血樣本，以作為對照。

1.2RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR

按照試劑盒說明書，分別使用Trizol和Trizol LS(Invitrogen, USA)提取實體瘤和外周血樣本總RNA。使用DNase處理RNA，以排除基因組污染。然后用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA鏈。簡述如下：取總RNA 1 μg，依次加入引物Oligo dT 1 μL，MMLV酶0.5 μL，RNAsin0.5 μL，10×緩沖液1 μL，dNTP 1 μL，用DEPC處理水補足至10 μL?；靹?。按以下條件進行反轉(zhuǎn)錄：42 ℃，45 min；99 ℃，5 min；5 ℃，5 min。

取1 μL 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為PCR模板，依次加入10×緩沖液2.5 μL，MgCL2(25 mmol/L) 1.5 μL，正向引物(10 μmol/L)和反向引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA聚合酶1 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 1 μL，滅菌去離子水補足至25 μL。檢測ZNF268基因的條件：預(yù)變性96 ℃ 3 min(96 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s)，循環(huán)35個，最后72 ℃延伸7 min。檢測β-actin基因的條件：預(yù)變性96 ℃ 3 min(96 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，循環(huán)30個，最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用EDAS 290系統(tǒng)(Kodak，USA)成像。PCR引物序列見表1。

表1　引物列表

1.3巢式PCR

第一輪擴增25個循環(huán)，反應(yīng)條件同步驟1.2。產(chǎn)物稀釋100倍取1 μL作為第二輪擴增模板。檢測ZNF268的條件：預(yù)變性96 ℃ 3 min(96 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s),循環(huán)30個，最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，采用EDAS 290系統(tǒng)(Kodak，USA)成像。

1.4PCR產(chǎn)物回收、克隆和測序鑒定

隨機挑選PCR條帶進行克隆和測序鑒定。按照說明書，使用DNA凝膠回收試劑盒(北京博大泰克，中國)，回收PCR片段。連接反應(yīng)如下：純化PCR產(chǎn)物0.5 pmol/L；pGEM-T easy載體1 μL；2×連接緩沖液5 μL；T4 DNA連接酶1 μL，滅菌去離子水補足至10 μL。4 ℃連接過夜。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，獲取重組載體并測序。

2結(jié)果

2.1剪切本ZNF268a、ZNF268b在正常人外周血中的表達

ZNF268基因有8種剪切形式(圖1)，其中ZNF268a、ZNF268b豐度最高，是重點研究的兩條mRNA[23-24]。作為檢測實體瘤中ZNF268基因差異拼接模式的對照，本文收集了17例外周血樣本。提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用引物對BUN1和BDN3檢測樣品。該引物對可以檢測出ZNF268b、ZNF268f、ZNF268g(表2)。結(jié)果顯示17例正常人外周血中，表達ZNF268b的概率是100%(圖2a)。引物對e4s和BDN2可以檢測ZNF268a、ZNF268b、ZNF268g(表2)，其中ZNF268b和ZNF268g的PCR產(chǎn)物大小一致。結(jié)果顯示在樣本中ZNF268a表達概率為100%(圖2b)。

圖1　ZNF268基因剪切本(a)及引物位置(b)

BUN1BDN3e4sBDN2BU3BD1268.1BDCBU3NBD2BU1BD1268.1BD1ZNF268a+++++ZNF268b+++++++ZNF268c++++ZNF268d++++ZNF268e++++ZNF268f++++++ZNF268g+++++++KW-4++++

圖2PCR檢測正常人外周血ZNF268基因表達

Fig.2Examination ofZNF268 gene expression

in healthy peripheral blood by PCR

a.使用引物對BUN1和BDN3;b.使用引物對e4s和BDN2。

2.2剪切本ZNF268b在實體瘤中表達概率為100%，而ZNF268a表達概率為0

為檢測ZNF268基因在實體瘤中的差異拼接模式，收集了5例樣本，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)前期報道，ZNF268基因差異拼接發(fā)生在3、4、5、6號外顯子(圖1a)。引物BU3、BD1分別位于第一號、第七號外顯子(圖1b)。按照預(yù)期，這對引物能夠檢測到所有的剪切本(表2)。PCR和測序結(jié)果顯示，這對引物只檢測到ZNF268b(圖3a)。為進一步驗證結(jié)果，文章使用了另外一對引物進行實驗。268.1位于第二號外顯子，BDC位于第六號和第七號外顯子的交界處(圖1b)。按照預(yù)期，這對引物可以檢測ZNF268b、ZNF268f、ZNF268g(表2)。PCR和測序結(jié)果再次顯示在實體瘤組織中只檢測到ZNF268b(圖3b)。實驗過程中使用β-actin作為內(nèi)參(圖3c)。該結(jié)果表明ZNF268b在實體瘤中表達概率為100%，ZNF268a表達概率為0。

圖3　PCR檢測實體瘤組織ZNF268基因表達。

a.使用引物對BU3和BD1; b.使用引物對268.1和BDC; c.β-actin對照。

2.3巢式PCR再次證明剪切本ZNF268a在實體瘤樣本中表達概率為0

ZNF268基因在實體瘤中都表達了ZNF268b，而ZNF268a表達概率為0。這個結(jié)果非常意外，猜測可能是ZNF268a豐度過低，以至于單論PCR無法檢測陽性結(jié)果。為排除這種可能性，使用特異性更強靈敏度更高的巢式PCR法，進一步確認轉(zhuǎn)錄本ZNF268a是否存在。首先使用BU3和NBD2進行第一輪PCR擴增，然后用巢式引物對BU1和BD1(圖4a)或者268.1和BD1(圖4b)進行巢式PCR。這三對引物都可以檢測到所有剪切本(表2)，BU3、NBD2位于其他引物的外側(cè)(圖1b)。根據(jù)預(yù)測，如果實體瘤樣本中存在ZNF268a，那么巢式PCR至少應(yīng)該擴增出兩條條帶，分別是ZNF268a和ZNF268b。電泳結(jié)果顯示只有一條擴增條帶，再次證明ZNF268a在實體瘤中表達概率為0。

圖4　巢式PCR檢測實體瘤組織ZNF268基因表達

3討論

差異拼接是高等真核生物基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵模式，據(jù)報道人類大部分基因都存在差異拼接現(xiàn)象，單基因形成的mRNA從幾條到幾千條不等，基因功能發(fā)揮與特定的拼接模式成對應(yīng)關(guān)系[25-26]。癌癥是細胞異常的無序和永生化生長，是基因功能紊亂的結(jié)果。癌細胞中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)某些基因出現(xiàn)異常的差異拼接模式，導(dǎo)致該基因在細胞中的mRNA種類和比例發(fā)生變化，進而基因功能發(fā)生變化，如WT1、FHIT[27-28]。本文以17例正常人外周血為對照，研究了5例實體瘤標(biāo)本的ZNF268差異拼接模式。結(jié)果顯示剪切本ZNF268a在外周血中表達概率為100%，而在實體瘤中則為0。

細胞癌變初始階段可能由單個或少數(shù)基因功能改變開始，但是細胞徹底轉(zhuǎn)變成癌細胞，是分子系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和調(diào)控的整體改變。癌癥蛋白分子標(biāo)記對病癥診斷有重要的指示、治療靶向作用[29-30]。由于癌癥發(fā)生和發(fā)展過程的復(fù)雜性和參與分子的多樣性，癌癥分子標(biāo)記的研究十分困難。目前為止，經(jīng)FDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床診斷的癌癥分子標(biāo)記只有9個蛋白質(zhì)。ZNF268a在實體瘤中表達概率為0，而在正常人外周血中則為100%，這種有和無的存在關(guān)系提示ZNF268a消失在細胞癌變過程中扮演著重要角色，有可能成為一種癌癥診斷分子標(biāo)記。這對癌癥診斷、治療及預(yù)后都有十分重要的指示作用。

ZNF268基因有8種剪切形式，在正常細胞中剪切本ZNF268a、ZNF268b出現(xiàn)的概率為100%，本研究表明，實體瘤組織只表達剪切本ZNF268b，而ZNF268a完全消失。這說明ZNF268基因在癌癥組織中的差異拼接模式發(fā)生了很大的變化，可能是癌細胞分子系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和調(diào)控整體改變的結(jié)果。細胞在癌化過程中，與拼接有關(guān)的因子及內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化，最終導(dǎo)致ZNF268基因的拼接模式發(fā)生改變。ZNF268有兩種主要的蛋白質(zhì)形式ZNF268a和ZNF268b2，分別由剪切本ZNF268a、ZNF268b翻譯產(chǎn)生[23]。ZNF268a比ZNF268b2多了KRAB區(qū)，它們有相似的細胞定位[24,31]，共同存在以維護ZNF268基因的功能。在實體瘤組織中，平衡關(guān)系被打破，通過在細胞內(nèi)表達ZNF268a，重新建立兩種剪切本之間的平衡，可能是一種有效的治療策略。進一步研究下調(diào)ZNF268a表達所引起的下游生物學(xué)事件和對細胞產(chǎn)生的影響將會有助于對ZNF268基因功能的深入認識。

4結(jié)論

以17例正常人外周血為對照，收集并分析了5例實體瘤樣本的ZNF268基因差異拼接模式。通過PCR、巢式PCR和測序的方法，發(fā)現(xiàn)剪切本ZNF268a在正常人外周血的表達概率為100%，而在實體瘤中為0。本研究提示ZNF268a消失與細胞癌變密切相關(guān)，是潛在的癌癥診斷分子標(biāo)記。

致謝：感謝美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health,NIH)Yun-Bo Shi教授提出的建議性意見。感謝貴州師范學(xué)院自然科學(xué)研究基金項目(12BSO25)的資助。

參考文獻:

[1] 王永川, 魏麗娟, 劉俊田,等. 發(fā)達與發(fā)展中國家癌癥發(fā)病率與死亡率的比較與分析[J]. 中國腫瘤臨床, 2012(10): 679-682.

[2] 陳萬青, 鄭榮壽, 張思維,等.2003—2007年中國癌癥發(fā)病分析[J]. 中國腫瘤, 2012(3): 161-170.

[3] SAKAGUCHI S, HOMBAUER M, BILIC I, et al. The zinc-finger protein MAZR is part of the transcription factor network that controls the CD4 versus CD8 lineage fate of double-positive thymocytes[J]. Nature Immunology, 2010, 11(5): 442-448.

[4] LIAN L S, YANG Y G, LIU W, et al. Zinc finger protein-activating transcription factor up-regulates vascular endothelial growth factor-a expression in vitro[J]. Chinese Medical Sciences Journal, 2012, 27(3): 171-175.

[5] CALDERON M R, VERWAY M, BENSLAMA R O, et al. Ligand-dependent corepressor contributes to transcriptional repression by C2H2zinc finger transcription factor ZBRK1 through association with KRAB-associated protein-1[J]. Nucleic Acids Research, 2014, 42(11): 7012-7027.

[6] LAWRENCE S D, NOVAK N G, JONES R W, et al. Herbivory responsive C2H2zinc finger transcription factor protein StZFP2 from potato[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2014, 80: 226-233.

[7] HANDRA-LUCA A.WT1 expression in adult granular cell tumor of the vocal cord and tongue[J]. Head and Neck Pathology, First online:2015-07-11,1-3.

[8] ZHANG R, YANG J Y, SUN H Q, et al. Comparison of minimal residual disease (MRD) monitoring byWT1 quantification between childhood acute myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia[J]. European Review for Medical and Pharmacological Sciences, 2015, 19(14): 2679-2688.

[9] BIBIKOVA E, YOUN M Y, DANILOVA N, et al. TNF-mediated inflammation repressesGATA1 and activates p38 MAP kinase in RPS19-deficient hematopoietic progenitors[J]. Blood, 2014, 124(25): 3791-3798.

[10] LI Y, KE Q, SHAO Y, et al.GATA1 induces epithelial-mesenchymal transition in breast cancer cells through PAK5 oncogenic signaling[J]. Oncotarget, 2015, 6(6): 4345-4356.

[11] GOU D M, SUN Y, GAO L, et al. Cloning and characterization of a novel Kruppel-like zinc finger gene,ZNF268, expressed in early human embryo[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2001, 1518(3): 306-310.

[12] SUN Y, GOU D M, LIU H, et al. The KRAB domain of zinc finger geneZNF268: a potential transcriptional repressor[J]. IUBMB Life, 2003, 55(3): 127-131.

[13] SUN Y, SHAO H, LI Z, et al.ZNF268, a novel kruppel-like zinc finger protein, is implicated in early human liver development[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2004, 14(6): 971-975.

[14] KRACKHARDT A M, WITZENS M, HARIG S, et al. Identification of tumor-associated antigens in chronic lymphocytic leukemia by SEREX[J]. Blood, 2002, 100(6): 2123-2131.

[15] WANG W, GUO M, HU L, et al. The zinc finger proteinZNF268 is overexpressed in human cervical cancer and contributes to tumorigenesis via enhancing NF-kappaB signaling[J]. Journal of Biological Chemistry, 2012, 287(51): 42856-42866.

[16] ZENG Y, WANG W, MA J, et al. Knockdown ofZNF268, which is transcriptionally downregulated by GATA-1, promotes proliferation of K562 cells[J]. PloS One, 2012, 7(1): e29518.

[17] HU L, WANG W, CAI J, et al. Aberrant expression ofZNF268 alters the growth and migration of ovarian cancer cells[J]. Oncology Letters, 2013, 6(1): 49-54.

[18] GUO M X, WANG D, SHAO H J, et al. Transcription of human zinc fingerZNF268 gene requires an intragenic promoter element[J]. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(34): 24623-24636.

[19] WANG D, GUO M X, HU H M, et al. Human T-cell leukemia virus type 1 oncoprotein tax repressesZNF268 expression through the cAMP-responsive element-binding protein/activating transcription factor pathway[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(24): 16299-16308.

[20] GABUT M, SAMAVARCHI-TEHRANI P, WANG X, et al. An alternative splicing switch regulates embryonic stem cell pluripotency and reprogramming[J]. Cell, 2011, 147(1): 132-146.

[21] AARONSON Y, MESHORER E. Stem cells: regulation by alternative splicing[J]. Nature, 2013, 498(7453): 176-177.

[22] GUEROUSSOV S, GONATOPOULOS-POURNATZIS T, IRIMIA M, et al. RNA splicing. an alternative splicing event amplifies evolutionary differences between vertebrates[J]. Science, 2015, 349(6250): 868-873.

[23] SHAO H, ZHU C, ZHAO Z, et al. KRAB-containing zinc finger geneZNF268 encodes multiple alternatively spliced isoforms that contain transcription regulatory domains[J]. International Journal of Molecular Medicine, 2006, 18(3): 457-463.

[24] WANG W, CAI J, WU Y, et al. Novel activity of KRAB domain that functions to reinforce nuclear localization of KRAB-containing zinc finger proteins by interacting with KAP1[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2013, 70(20): 3947-3958.

[25] TIKHONOV M, GEORGIEV P, MAKSIMENKO O. Competition within introns: splicing wins over polyadenylation via a general mechanism[J]. Acta Naturae, 2013, 5(4): 52-61.

[26] BLACK D L. Protein diversity from alternative splicing: a challenge for bioinformatics and post-genome biology[J]. Cell, 2000, 103(3): 367-370.

[27] BAUDRY D, HAMELIN M, CABANIS M O, et al.WT1 splicing alterations in Wilms′ tumors[J]. Clinical Cancer Research, 2000, 6(10): 3957-3965.

[28] ZUCCHINI C, CONCU M, MARTINI F, et al.FHIToncosuppressor gene expression profile in human anal cancers[J]. International Journal of Biological Markers, 2007, 22(1): 39-42.

[29] CIMA I, SCHIESS R, WILD P, et al. Cancer genetics-guided discovery of serum biomarker signatures for diagnosis and prognosis of prostate cancer[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, 108(8): 3342-3347.

[30] HIGGINS G, ROPER K M, WATSON I J, et al. Variant Ciz1 is a circulating biomarker for early-stage lung cancer[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109(45): E3128-3135.

[31] WANG W, CAI J, LIN Y, et al. Zinc fingers function cooperatively with KRAB domain for nuclear localization of KRAB-containing zinc finger proteins[J]. PloS One, 2014, 9(3): e92155.

〔責(zé)任編輯王勇〕

第一作者： 劉瑩娟，女，講師，博士，主要研究方向為動物行為與化學(xué)通訊。E-mail:liuyingjuan620@126.com

Study of alternative splicing ofZNF268 gene in human solid tumors

ZHU Chengang1,2, GUO Mingxiong2, SHAO Huanjie3*

(1 School of Chemistry and Life Sciences, Guizhou Normal College, Guiyang 550018，Guizhou，China；

2 College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan 430072， Hubei, China；

3 School of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi′an 710119， Shaanxi, China)

Abstract:In order to study the function of ZNF268 gene in tumorigenesis, five solid tumor specimens were collected and analyzed, which were compared to 17 peripheral blood specimens of healthy donors, by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), nested PCR and sequencing. Results demonstrated that the patterns of alternative splicing of ZNF268 gene in human solid tumors were dramatically different from healthy blood. The probability of appearance of ZNF268a was 100% in healthy peripheral blood, which was 0 in solid tumors. These results suggested that the disappearance of ZNF268a may contribute to cancerization and is a potential prognostic factor.

Keywords:ZNF268 gene; aberrant alternative splicing; solid tumor; biomarker

通信作者:* 張健旭，男，研究員，博士生導(dǎo)師。E-mail: zhangjx@ioz.ac.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31272322)； 河南省高等學(xué)校重點科研項目(15A180053)； 農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室開放課題(ChineseIPM1403)；南陽師范學(xué)院校級項目(Zx2014063)

收稿日期：2015-03-23

doi:10.15983/j.cnki.jsnu.2016.01.314

文章編號：1672-4291(2016)01-0071-07

中圖分類號：Q344+.14

文獻標(biāo)志碼：A