黃腐酸抗氧化作用機(jī)制研究進(jìn)展

宋游行　李寶才　張惠芬　何　靜

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南　昆明　650500)

黃腐酸抗氧化作用機(jī)制研究進(jìn)展

宋游行李寶才張惠芬1何靜

(昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500)

〔關(guān)鍵詞〕黃腐酸；抗氧化；自由基

研究表明，人體內(nèi)的氧化損傷與多種疾病如腫瘤、心腦血管疾病、機(jī)體衰老等的發(fā)生密切相關(guān)〔1〕。人體內(nèi)自由基主要包括氧自由基(OFR)，過(guò)氧化脂質(zhì)(LPO)和脂類(lèi)自由基，其對(duì)機(jī)體造成的損傷是體內(nèi)氧化作用的結(jié)果，對(duì)生物大分子和膜結(jié)構(gòu)均有不同方式的損傷作用。向系統(tǒng)內(nèi)補(bǔ)充抗氧化劑，清除過(guò)多的自由基或終止體內(nèi)自由基反應(yīng)，可防止線粒體腫脹，抑制膜的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、蛋白質(zhì)交聯(lián)等作用，對(duì)于保護(hù)生物膜結(jié)構(gòu)與功能完整性，抑制自由基誘發(fā)的疾病或增強(qiáng)體質(zhì)和治療疾病都是有意義的。因此，研究開(kāi)發(fā)新型高效、綠色環(huán)保的天然抗氧化劑刻不容緩。黃腐酸(FA)是自然界廣泛存在的一類(lèi)從泥炭、褐煤、風(fēng)化煤等提取的活性產(chǎn)物，氧化程度高，含羧基、羥基、酚羥基、醌基等多種活性官能團(tuán)，極易被人體吸收利用，是醫(yī)療效果最好的腐植酸。早在幾千年前，李時(shí)珍在《本草綱目》中已有類(lèi)似腐植酸藥用的記載，主要用以治療鼻子出血、婦女氣血痛及諸瘡毒、金瘡出血等疾病〔2〕。近年來(lái)，部分研究報(bào)道了FA及其鈉鹽在消炎、抗病毒、抗氧化、抗癌、抗?jié)兊确矫娴娘@著療效，且其抗氧化作用可能是發(fā)揮相關(guān)重要的生理功效的藥理基礎(chǔ)〔3〕。因此，對(duì)FA抗氧化作用機(jī)制的研究今后可能將成為其基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)之一。目前，對(duì)不同產(chǎn)地FA抗氧化作用的研究以證明其具備抗氧化性為多，也有一些研究涉及分析其結(jié)構(gòu)與抗氧化性的關(guān)系，但對(duì)FA抗氧化作用實(shí)現(xiàn)的途徑及其作用機(jī)制的研究報(bào)道較少〔4〕。本文結(jié)合體內(nèi)主要氧化產(chǎn)物自由基的產(chǎn)生途徑，從抑制體內(nèi)氧化物產(chǎn)生與清除已有氧化物的角度，綜述近年來(lái)國(guó)內(nèi)外有關(guān)FA抗氧化作用機(jī)制的研究工作，為FA抗氧化作用機(jī)制的研究提供一定思路。

1自由基的產(chǎn)生

自由基，化學(xué)上也稱(chēng)“游離基”，是指化合物的分子在光熱等外界條件下，共價(jià)鍵發(fā)生均裂而形成的具有不成對(duì)電子的原子或基團(tuán)。正常機(jī)體的氧化損傷和抗氧化體系處于動(dòng)態(tài)平衡，機(jī)體正常代謝產(chǎn)生的活性氧自由基能不斷地被抗氧化體系清除，以維持細(xì)胞氧化和還原穩(wěn)態(tài)。而人體可能由于受到外界刺激，使機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，也可產(chǎn)生自由基，打破動(dòng)態(tài)平衡，損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起慢性疾病及衰老效應(yīng)〔5〕。據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道，人體可產(chǎn)生各種各樣的活性自由基。自由基是人體脂質(zhì)過(guò)氧化和損傷的直接兇手，其中衰老、腫瘤產(chǎn)生、心腦血管疾病等60多種疾病與自由基產(chǎn)生密切相關(guān)。

具體而言，人體內(nèi)自由基的產(chǎn)生有內(nèi)源性和外源性?xún)煞N途徑。例如化學(xué)誘導(dǎo)、環(huán)境污染、吸煙、微波震蕩等外界因素都會(huì)使人體內(nèi)產(chǎn)生外源性自由基〔6〕。而內(nèi)源性自由基的產(chǎn)生則不然，主要源于機(jī)體自身代謝和酶促反應(yīng)，例如線粒體中電子傳導(dǎo)系統(tǒng)、線粒體腫脹、線粒體脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程等引起。人體在呼吸代謝中需要能量，而適量的自由基則不斷傳遞著能量，保持呼吸代謝正常運(yùn)轉(zhuǎn)。

2FA的抗氧化作用機(jī)制研究

FA可能通過(guò)不同途徑抑制或清除氧化損傷機(jī)體的自由基，從而發(fā)揮其抗氧化作用，但目前對(duì)FA抗氧化作用實(shí)現(xiàn)的途徑及其作用機(jī)制的研究報(bào)道較少。

2.1FA化學(xué)結(jié)構(gòu)決定其具有抗氧化作用FA是一類(lèi)從泥炭、褐煤、風(fēng)化煤等提取的活性產(chǎn)物,氧化程度高，含羧基、羥基、酚羥基、醌基等多種活性官能團(tuán)。FA中的氧68%～91%存在于官能團(tuán)上，最重要的官能團(tuán)是總酸性基團(tuán)和醌基，這些基團(tuán)決定了FA的化學(xué)性質(zhì)和生物活性。

FA自身的多酚-醌基結(jié)構(gòu)和芳香共軛體系對(duì)自由基具有清除作用。其在某些情況下是電子接受體，表現(xiàn)為氧化劑，而在有些情況下則是電子給予體，表現(xiàn)為還原劑，這證實(shí)了FA本身就是一個(gè)氧化-還原體系，存在醌基-半醌-酚基的轉(zhuǎn)換、硝基、酚羥基等的各種轉(zhuǎn)換〔7〕。在這種轉(zhuǎn)換的過(guò)程中，struyk提出“自生電子傳遞中間體”的假說(shuō)。而這種氧化-還原體系在體內(nèi)必然會(huì)參與到生理和能量代謝中。Nardi等〔8〕認(rèn)為，F(xiàn)A進(jìn)入植物體主要作為氫的受體影響植物的氧化還原，促進(jìn)植物體內(nèi)糖的積累，特別是在缺少氧的條件下，可以促進(jìn)ATP的積累合成，或者為多酚供應(yīng)源，起呼吸催化劑的作用。Aiken等〔9〕提出，F(xiàn)A的芳香共軛體系，順磁水平(自由基濃度)與生理藥理活性呈現(xiàn)正相關(guān)，并建議用自由基的濃度作為評(píng)價(jià)FA生理藥理活性的重要指標(biāo)?？梢?jiàn)，F(xiàn)A的結(jié)構(gòu)組成與其生理藥理活性密切相關(guān)，可能是其抗氧化機(jī)制之一。

2.2FA對(duì)相關(guān)酶和激素活性的影響有報(bào)道認(rèn)為，F(xiàn)A的藥理作用實(shí)際就是激素的作用。動(dòng)植物自身的體內(nèi)激素有上百種之多，而FA是由微生物的代謝產(chǎn)生，所以FA中也有幾十種激素，他們有的是和FA以化學(xué)或者物理鍵結(jié)合，有的可能本來(lái)就是FA組成中的一份子，不過(guò)是存在形式不一樣而已。

也有部分報(bào)道認(rèn)為，F(xiàn)A是酶的激活劑或者抑制劑，大致包括以下幾種：(1)抑制透明質(zhì)酸酶，與抗感染和減少炎癥滲出有關(guān)；(2)抑制紅細(xì)胞中三磷酸腺苷酶，以調(diào)節(jié)基礎(chǔ)代謝；(3)抑制膽堿酯酶，與減緩疼痛相關(guān)；(4)激活己糖激酶，促進(jìn)糖氧化磷酸化和糖代謝；(5)激活凝血酶，或誘導(dǎo)纖維蛋白溶解酶原激活劑(t-PA)釋放,這與凝血止血有關(guān)；(6)活化植物體內(nèi)的合成酶(主要為醛羧酶和轉(zhuǎn)化酶)，促進(jìn)可溶性碳水化合物積累，讓細(xì)胞滲透壓改變。此外，F(xiàn)A還對(duì)過(guò)氧歧化酶、過(guò)氧化氫酶、脂合酶等都有活化或抑制作用〔10〕。

2.3FA的金屬離子絡(luò)合作用眾所周知，自由基的另一重要來(lái)源是機(jī)體內(nèi)過(guò)渡金屬離子。絕大多數(shù)過(guò)渡金屬離子都含有未配對(duì)的電子，它們可以催化機(jī)體產(chǎn)生自由基，對(duì)機(jī)體造成氧化損傷。而FA對(duì)金屬離子具有一定的絡(luò)合作用，從而可以很大程度地抑制自由基產(chǎn)生。FA的羧基、酚羥基以及很多含O、P、N、S等的基團(tuán)都是電子給予體，所以是一類(lèi)天然的絡(luò)合劑或者螯合劑，較容易與金屬離子配位。因至今很難分辨到底哪些是螯合，哪些是絡(luò)合，故統(tǒng)稱(chēng)為絡(luò)合反應(yīng)。

王將等〔11〕利用電子自旋共振(ESR)波譜技術(shù)，分析鐵離子影響下杏仁皮中黃酮類(lèi)化合物抗自由基的效應(yīng)。結(jié)果證明：杏仁皮中黃酮類(lèi)化合物對(duì)鐵影響下自由基誘發(fā)的紅細(xì)胞膜過(guò)氧化有一定保護(hù)作用。分析其機(jī)制，一是杏仁皮中黃酮類(lèi)化合物對(duì)鐵的絡(luò)合作用，減弱了鐵的活性而抑制自由基的過(guò)渡產(chǎn)生；二是對(duì)膜脂質(zhì)過(guò)氧化啟動(dòng)因子·OH的高效清除及對(duì)次級(jí)產(chǎn)生的脂自由基的清除，從而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化鏈的啟動(dòng)與增長(zhǎng)。而李寶才等〔12〕則認(rèn)為茶褐素和黃腐酸具有相似的結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)，由此生理藥理活性相近。Gao等〔13〕研究茶多酚對(duì)鐵誘導(dǎo)的突觸小體脂質(zhì)過(guò)氧化的保護(hù)作用，結(jié)果表明，茶多酚的抗氧化作用不僅與其清除自由基有關(guān)，而且也與其絡(luò)合鐵離子的能力密切相關(guān)。有學(xué)者的實(shí)驗(yàn)證明，茶黃素是通過(guò)與銅離子及鐵離子的絡(luò)合而降低細(xì)胞中低密度脂蛋白(LDL)的氧化程度，并抑制體內(nèi)Fenton反應(yīng)，從而起到抑制活性氧自由基產(chǎn)生的作用。

FA的絡(luò)合能力很強(qiáng)，雖然不知道具體的絡(luò)合形式和配位數(shù)，但其對(duì)自由基產(chǎn)生和消除有影響是毋庸置疑的。據(jù)報(bào)道，X光電子能譜(XPS)可以鑒別元素的種類(lèi)和化合價(jià)態(tài)、測(cè)定元素相對(duì)含量，了解中心原子與配位原子的相互作用，可能是研究電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物最有利的手段之一。如有學(xué)者〔14〕利用XPS研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A-La的O1S結(jié)合能比FA-K高，對(duì)自由基的抑制程度可能就會(huì)更高。

2.4FA抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)脂質(zhì)過(guò)氧化是一種自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，可反復(fù)進(jìn)行，并伴隨有大量中間產(chǎn)物產(chǎn)生(如：O2、H2O2、·OH等自由基和過(guò)氧化物)；損害細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)其中間產(chǎn)物及終產(chǎn)物丙二醛(MDA)對(duì)細(xì)胞也具毒性。脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中發(fā)生ROS氧化生物膜的過(guò)程，即ROS與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)形成LPO，如MDA和4-羥基壬烯酸(HNE)，從而使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變〔15〕。

機(jī)體內(nèi)的自由基可以攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，并引發(fā)脂質(zhì)自由基過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。FA可與脂質(zhì)鏈?zhǔn)降闹虚g產(chǎn)物脂氧自由基反應(yīng)，從而終止鏈反應(yīng)，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。曾述之〔16〕研究表明，北京風(fēng)化煤黃腐酸鈉對(duì)體內(nèi)不飽和脂肪酸氧化抑制率達(dá)到92.7%，對(duì)應(yīng)激紅細(xì)胞過(guò)氧化(生成MDA)抑制率92.4%，對(duì)·OH 誘導(dǎo)溶血A540抑制率73.2%，對(duì)紅細(xì)胞釋放抑制率和紅細(xì)胞膜膽堿酯酶(AchE)的滅活抑制率均增加了1倍左右。王偉等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)，大骨節(jié)病(KBD)病人體內(nèi)存在脂質(zhì)過(guò)氧化和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力降低，由此，F(xiàn)A的自由基清除機(jī)制在保護(hù)生物膜成分和組織損傷的臨床應(yīng)用中得到初步證實(shí)。

2.5FA激活機(jī)體抗氧化體系機(jī)體自身的抗氧化體系分為酶抗氧化系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)。體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)主要有超氧化物歧化酶(SOD)、GSH-Px以及過(guò)氧化氫酶(CAT)、細(xì)胞色素氧化酶(CCO)等，這些酶可以抵抗自由基，防止衰老，保護(hù)生物體免疫損傷，因此也稱(chēng)為防御酶〔18〕。非酶系統(tǒng)則包括維生素A、維生素E、維生素C等。

Frimmel等〔19〕的研究報(bào)道，F(xiàn)A的施加可以影響植物的氧化過(guò)程，促進(jìn)氧的吸收，提高生理代謝能力和酶的活力。Rezacova等〔18〕認(rèn)為，F(xiàn)A螯合金屬離子影響植物細(xì)胞膜通透性和膜上載體的性質(zhì)，增加ATP酶的活性。正是由于FA的綜合刺激活性，才促使植物各種酶〔包括多酚氧化酶(FOD)、蛋白分解酶、過(guò)氧化氫酶(CAD)、過(guò)氧化物酶(POD)等〕的合成及生理活性增強(qiáng)。Anjum等〔20〕的研究表明，F(xiàn)A具有激活細(xì)胞保護(hù)酶活性，延緩衰老的作用?；卣颀埖取?1〕也報(bào)道稱(chēng)，F(xiàn)A可以同時(shí)提高SOD、CAD和POD等酶的活性，清除活性自由基，激發(fā)作物生命活性。

在農(nóng)業(yè)上，植物體中加入FA之后也可以增加維生素C的含量，使FA對(duì)自由基的清除進(jìn)一步加強(qiáng)，而FA本身可能也含有一些維生素類(lèi)物質(zhì)可以起到作用。

3研究前景展望

近年來(lái)，茶多酚、蜂膠、殼聚糖、橙皮素等許多天然抗氧化物質(zhì)均得到了較好的應(yīng)用，如國(guó)外天然蜂膠的生產(chǎn)工藝已比較成熟〔22〕,橙皮素在歐洲被廣泛作為一種具有食品補(bǔ)充劑使用〔23〕。但抗氧化活性物質(zhì)的研究及運(yùn)用總體上還處在初級(jí)階段，這也意味著對(duì)它們的研究有著廣闊的前景，具有很大的潛力〔24〕。據(jù)相關(guān)資料證實(shí)，在人們經(jīng)常食用的產(chǎn)品中，天然抗氧化劑的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人工合成抗氧化劑，因此，從自然界中尋找天然抗氧化劑已引起越來(lái)越多科學(xué)家的高度重視。FA具有高效的天然抗氧化活性成分，如果能對(duì)其抗氧化作用進(jìn)行深入研究與開(kāi)發(fā)，或許可以產(chǎn)生豐富的商業(yè)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。

而FA相關(guān)生物活性基礎(chǔ)研究工作的難點(diǎn)和重點(diǎn)依舊是其自身的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性問(wèn)題。大量的研究數(shù)據(jù)表明,不同產(chǎn)地來(lái)源,甚至同一產(chǎn)地不同分級(jí)成分FA的生物活性作用都可能大不相同，正如Senesi等〔25〕所說(shuō)：“應(yīng)當(dāng)先研究簡(jiǎn)單的確定了的腐植酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)和醫(yī)療效果，再推進(jìn)更艱難的天然腐植酸研究” 。作為食品添加、醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)或者臨床試驗(yàn)的FA產(chǎn)品，必須在嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以原料產(chǎn)地固定產(chǎn)品來(lái)源，固定生產(chǎn)技術(shù)工藝，并對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量嚴(yán)格控制。只有穩(wěn)定的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和穩(wěn)定性，才能使FA的生物活性基礎(chǔ)研究更加明朗。

就目前而言，不同產(chǎn)地FA抗氧化作用的研究以證明其具備抗氧化作用為多，但對(duì)其抗氧化作用實(shí)現(xiàn)的途徑及其作用機(jī)制的研究報(bào)道相對(duì)較少。筆者認(rèn)為，首先，在FA影響酶產(chǎn)生及活性方面，已知生物體中存在多達(dá)100種以上的氧化酶，而FA中也有多種類(lèi)別的酶，但對(duì)兩者之間相互關(guān)系的研究不多，需多開(kāi)展這方面的相關(guān)研究工作。其次，在提高機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能性方面，有關(guān)FA增強(qiáng)機(jī)體抗氧化酶活性的研究較少，對(duì)不同性質(zhì)及結(jié)構(gòu)的FA對(duì)不同的抗氧化酶活性影響的規(guī)律尚缺乏認(rèn)識(shí)。再次，F(xiàn)A的抗氧化性與其組分、結(jié)構(gòu)或聚合度都有密切關(guān)系，目前這方面的研究尚需要進(jìn)一步探究。最后，和已研究成熟的天然抗氧化劑相比較，在分子水平層面，應(yīng)對(duì)FA是否可以提高抗氧化酶m-RNA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量，對(duì)抗氧化酶基因表達(dá)是否可以呈現(xiàn)相關(guān)的調(diào)節(jié)作用來(lái)研究；而在細(xì)胞水平層面，則應(yīng)該建立可行的細(xì)胞損傷模型和動(dòng)物損傷模型對(duì)其進(jìn)行深入的探討；同時(shí)，還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)FA發(fā)揮抗氧化作用的內(nèi)源性分子靶點(diǎn)的研究，以找到問(wèn)題的本質(zhì)〔26〕。上述方面必將成為今后黃腐酸抗氧化作用機(jī)制研究的重要發(fā)展方向。

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〔2015-10-10修回〕

(編輯曲莉)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21166013)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R2

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)10-2532-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.10.106

1昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院

第一作者：宋游行(1989-)，男，在讀碩士，主要從事腐植酸醫(yī)藥應(yīng)用研究。