順鉑誘導(dǎo)食管癌EC9706耐藥細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)

銀　瑞　董新偉　王　錚

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院 胸外科，河南　南陽(yáng)　473009)

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順鉑誘導(dǎo)食管癌EC9706耐藥細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)

銀瑞董新偉王錚

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院 胸外科，河南南陽(yáng)473009)

〔摘要〕目的探討凋亡抑制蛋白Bcl-2在順鉑(DDP)誘導(dǎo)食管癌EC9706耐藥細(xì)胞中的表達(dá)。方法建立EC9706/DDP細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞存活率，Western印跡檢測(cè)DDP處理后EC9706細(xì)胞及EC9706/DDP細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)，RT-PCR、熒光定量PCR檢測(cè)Bcl-2 mRNA水平。結(jié)果EC9706/DDP細(xì)胞對(duì)DDP誘導(dǎo)的凋亡不敏感，Western印跡檢測(cè)到EC9706/DDP細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)上調(diào)，與EC9706細(xì)胞相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-PCR、熒光定量PCR檢測(cè)到EC9706/DDP細(xì)胞中Bcl-2 mRNA水平上調(diào)，與EC9706細(xì)胞相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論Bcl-2表達(dá)上調(diào)可能為食管癌EC9706細(xì)胞對(duì)DDP耐藥的重要機(jī)制。

〔關(guān)鍵詞〕Bcl-2；食管癌；順鉑；耐藥

第一作者：銀瑞(1973-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事胸外科疾病的臨床診治和基礎(chǔ)研究。

食管癌的治療方案中，化療一直占有重要地位，但腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的原發(fā)或繼發(fā)性耐藥，以及腫瘤細(xì)胞的凋亡缺陷或受阻常導(dǎo)致化療的失敗〔1〕。已知Bcl-2家族在調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡及提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性方面發(fā)揮著重要作用，其重要成員Bcl-2基因在包括食管癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中可過度表達(dá)，并不同程度地抑制化療藥物介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔2〕。本研究觀察順鉑(DDP)誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞株EC9706耐藥細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，旨在探討EC9706細(xì)胞對(duì)DDP耐藥的機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料人EC9706細(xì)胞由河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室保存；RPMI-1640培養(yǎng)基、購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；小鼠抗人Bcl-2單抗購(gòu)自CST公司；小鼠抗人β-actin單抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司；β-actin 及Bcl-2 引物由上海生物公司合成；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)于Sigma公司；DDP購(gòu)于山東齊魯制藥有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)EC9706細(xì)胞在含有10%小牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中于37℃、5%CO2飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。將DDP溶于乙二胺四乙酸(DMSO)配成1 mmol/L的儲(chǔ)存液，于-20℃下保存。細(xì)胞傳代后24 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，對(duì)照組更換新鮮培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組加入DDP，收集備用。

1.3EC9706/DDP耐藥細(xì)胞的建立選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC9706細(xì)胞，DDP作用濃度從0.03 μmol/L開始，48 h后棄去培養(yǎng)液并加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，觀察無明顯死亡細(xì)胞后選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行傳代，增加25%~50% DDP藥物濃度，反復(fù)傳代，使之穩(wěn)定，直至該細(xì)胞株能在0.3 μmol/L的DDP濃度下長(zhǎng)期生存。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC9706與EC9706/DDP細(xì)胞接種于24孔板培養(yǎng)過夜，選擇不同劑量的DDP作用于EC9706、EC9706/DDP細(xì)胞。收集24孔板中上清液，各孔用PBS洗滌1遍，1 200 r/min離心10 min，棄去上清液，每孔再加入750 μl碘化丙啶(PI)染液，37℃避光，作用20 min后收集，4℃避光過夜，于流式儀檢測(cè)，用WinMDI 2.9軟件分析，有G1期DNA含量的細(xì)胞比例即細(xì)胞凋亡率。

1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC9706、EC9706/DDP細(xì)胞分別接種于96孔板，于37℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)3 d，加入不同濃度的DDP，每孔加MTT溶液20 μl，孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μl DMSO并振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長(zhǎng)，測(cè)定各孔吸光值，記錄結(jié)果。

1.6Western印跡法檢測(cè)Bcl-2蛋白表達(dá)收集細(xì)胞并使用預(yù)冷PBS洗滌2遍，加入裂解液，冰上孵育30 min，4℃、12 000 r/min離心30 min，吸取上清液。用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，將已定量好的細(xì)胞總蛋白與緩沖液等量混合，沸水煮3~5 min備用。20 μg總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，移至硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶/Tris鹽酸緩沖液(TBST)封閉2 h，加入一抗β-actin、小鼠抗人Bcl-2，按1∶1 000稀釋，室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次15 min，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次15 min。用電化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒進(jìn)行顯影曝光。

1.7RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Bcl-2 mRNA表達(dá)TRIzol法提取EC9706/DDP細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板建立反應(yīng)體系。β-actin引物序列：正義：5′-GACCTGACTGACTACCTCATGAAGAT-3′，反義：5′-GTCACACTTCATGA-TGGAGTTGAAGG-3′。Bcl-2引物序列：正義：5′-TTCGCCGAGTCCAGGC-3′，反義：5′-TCACTTGTG-GCCCAGATAGC-3′。95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30s，56℃退火45 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

1.8實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Bcl-2基因在細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)Bcl-2檢測(cè)引物如上述，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因?yàn)閮?nèi)參，正義：5′-CCACATCGCTCAGACACCAT-3′，反義：5′-ACGGTGCCATGGAAT-TTGCC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度 196 bp，反應(yīng)體系為10 μl，含上、下游引物各1 μl，模板DNA 1 μl，雙蒸水6 μl，熒光定量PCR反應(yīng)混合液10 μl。應(yīng)用ABI7500 Fast型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，并設(shè)定運(yùn)行參數(shù)：95℃ 3 min預(yù)變性，然后95℃ 5 s變性，60℃ 25 s退火與延伸，40個(gè)循環(huán)，并使用軟件分析相對(duì)表達(dá)量(RQ)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1EC9706/DDP與EC9706細(xì)胞形態(tài)比較顯微鏡觀察EC9706細(xì)胞呈圓形，大小均一，形態(tài)規(guī)則。而EC9706/DDP大小不均一，形態(tài)不規(guī)則，可見瘤巨細(xì)胞和凹陷。

2.2DDP誘導(dǎo)EC9706/DDP與EC9706凋亡率比較用不同濃度(0.2、0.3、0.4 μmol/L)DDP誘導(dǎo)EC9706/DDP與EC9706細(xì)胞48 h，兩組細(xì)胞的凋亡率分別為(2.08±0.99)%、(7.52±0.86)%、(9.25±1.02)%和(4.56±0.56)%、(25.35±1.22)%、(40.21±0.93)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3DDP對(duì)EC9706/DDP與EC9706的增殖抑制作用比較分別采用不同濃度的DDP(0.2、0.3、0.4 μmol/L)作用于EC9706/DDP與EC9706細(xì)胞48 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率分別為(95.23±2.32)%、(92.03±2.88)%、(88.23±2.96)%和(89.53±0.88)%、(82.13±1.96)%、(78.52±3.11)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4DDP作用于EC9706/DDP和EC9706后對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)的影響B(tài)cl-2在EC9706細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，與0 h蛋白表達(dá)量比較，在6 h后開始降低(P<0.05)；同時(shí)Bcl-2在EC9706/DDP細(xì)胞株中表達(dá)明顯上調(diào)，與0 h蛋白表達(dá)量比較，在6 h后開始升高(P<0.05)。兩組間比較差異顯著(P<0.05)。Bcl-2在兩組細(xì)胞中的表達(dá)差異說明抗凋亡蛋白Bcl-2變化可能在DDP耐藥機(jī)制中起重要作用。

2.5DDP誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞株EC9706/DDP中Bcl-2 mRNA表達(dá)水平變化在明確了DDP作用EC9706/DDP后Bcl-2蛋白水平是上調(diào)的，進(jìn)一步探討mRNA水平的變化。采用特異性引物通過RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)Bcl-2 mRNA水平也是上調(diào)的，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明Bcl-2的變化受到轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR計(jì)算相對(duì)定量結(jié)果顯示，Bcl-2 mRNA在EC9706細(xì)胞、EC9706/DDP細(xì)胞中RQ分別為0.032±0.002、0.481±0.001，EC9706/DDP細(xì)胞mRNA的表達(dá)水平明顯高于EC9706細(xì)胞(P<0.05)。

3討論

細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，指細(xì)胞在一定條件下通過啟動(dòng)內(nèi)部機(jī)制，經(jīng)過一連串的細(xì)胞變性，最終發(fā)生死亡的過程〔2〕。目前對(duì)Bcl-2、p53、bax等凋亡調(diào)控基因研究較多，通常認(rèn)為bax和p53誘導(dǎo)凋亡，而Bcl-2則抑制凋亡〔3〕。Bcl-2基因是1984年Tsujimoto等〔3〕從與濾泡性淋巴細(xì)胞瘤相關(guān)的染色體易位的斷裂點(diǎn)克隆到的一種癌基因，Bcl-2蛋白過度表達(dá)，可抑制細(xì)胞的凋亡并延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，參與腫瘤發(fā)生，Bcl-2的這一作用通常認(rèn)為是通過封閉細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高等途徑實(shí)現(xiàn)的。Bcl-2作為細(xì)胞凋亡的強(qiáng)抑制基因，在許多腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，臨床研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2基因的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管損害、p53異常表達(dá)和細(xì)胞凋亡的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，在中、晚期癌癥中Bcl-2的表達(dá)更強(qiáng)〔4〕。

化療藥物耐藥是影響化療效果的重要因素，凋亡抑制基因Bcl-2能抑制化療藥物介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，被視為一種新的耐藥相關(guān)基因〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，在Bcl-2過度表達(dá)的細(xì)胞，藥物仍能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，但這種損傷不能有效地轉(zhuǎn)換成凋亡信號(hào)，從而使腫瘤細(xì)胞的生理性凋亡受抑制，增加了腫瘤細(xì)胞的生存時(shí)間，以致在化療期間表達(dá)Bcl-2的腫瘤細(xì)胞能以較快的速率重新生長(zhǎng)，造成細(xì)胞過多堆積，從而參與了耐藥的發(fā)生〔6〕。

本實(shí)驗(yàn)提示Bcl-2作為抗凋亡Bcl-2家族中的重要一員，其在DDP誘導(dǎo)的EC9706凋亡中起抑制作用。因此，Bcl-2的表達(dá)上調(diào)可能是EC9706細(xì)胞對(duì)DDP耐藥的重要機(jī)制，Bcl-2可作為食管癌基因治療的靶點(diǎn)，通過各種途徑抑制Bcl-2基因的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，減少耐藥將為本課題后續(xù)研究重點(diǎn)。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-03-25修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號(hào)〕R735.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)03-0562-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.03.020