基于人胚胎干細(xì)胞的藥物毒性測試替代法研究進(jìn)展

賈　栗，彭 輝，趙增明，烏瀚寶櫟爾，彭雙清（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評價研究中心，北京 100071）

基于人胚胎干細(xì)胞的藥物毒性測試替代法研究進(jìn)展

賈栗，彭 輝，趙增明，烏瀚寶櫟爾，彭雙清
（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制所毒理學(xué)評價研究中心，北京 100071）

傳統(tǒng)的藥物研發(fā)及安全性評價對實驗動物的需求量大，費(fèi)用高，周期長，種屬差異性問題難以克服。人胚胎干細(xì)胞（hESC）可自我更新及定向分化為多種類型的細(xì)胞，逐漸成為毒性測試體外替代法的新工具。hESC的體外替代模型預(yù)測受試物對人體各種靶器官的毒性及毒作用機(jī)制，如生殖毒性測試模型、神經(jīng)發(fā)育毒性測試模型及體外代謝模型等，結(jié)合基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等組學(xué)技術(shù)快速高效地分析多條代謝通路，尋找潛在的毒性生物標(biāo)志物。在藥物毒理學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

胚胎干細(xì)胞；毒性試驗；生殖毒性；神經(jīng)毒性；模型，代謝

傳統(tǒng)的藥物研發(fā)及安全性評價主要是基于動物實驗，動物需求量大，費(fèi)用昂貴，研發(fā)周期長，且種屬差異性難以克服，而基于人源性細(xì)胞的體外替代模型逐漸引起人們的關(guān)注。人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell，hESC）具有發(fā)育的全能性，可自我更新及定向分化為多種類型的細(xì)胞，如血細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞及腎細(xì)胞等，同時可進(jìn)一步誘導(dǎo)培養(yǎng)成人體特定的組織，用此可預(yù)測受試物對人體的各種靶器官毒性及毒作用機(jī)制［1］。近年來，國內(nèi)外已著手將hESC應(yīng)用于藥物研發(fā)及藥物安全性評價研究，美國國家研究委員會（National Research Council）提出的“21世紀(jì)毒性測試新策略”（Toxicity Testing in the 21st Century：a Vision and a Strategy）及歐洲委員會FP7綜合工程分項“基于胚胎干細(xì)胞新法替代測試策略”（Embryonic Stem Cell-based Novel Alternative Testing Strategies）等研究項目均大力加速了基于hESC新的毒性測試技術(shù)的發(fā)展?；趆ESC的毒性測試替代法可實現(xiàn)藥物研發(fā)及安全性評價的個性化，提高藥物治療及研發(fā)的針對性，同時避免動物實驗帶來的種屬差異，減少研發(fā)費(fèi)用，縮短研發(fā)周期，是藥物大規(guī)模篩選的理想手段［2］。

目前，基于hESC的毒性測試替代法的主要研究熱點在于通過定向誘導(dǎo)hESC培養(yǎng)成特定類型的細(xì)胞、組織、器官等體外模型來測定候選化合物的毒性，探討受試物可能作用的靶器官毒性和作用機(jī)制等，如肝毒性、心臟毒性、生殖發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性及致癌性等；結(jié)合各種組學(xué)技術(shù)快速高效地分析多條代謝通路，有助于定位靶器官及判定毒性程度，尋找潛在的毒性生物標(biāo)志物；同時考慮到未來工業(yè)化的發(fā)展，將力爭實現(xiàn)hESC的自動化培養(yǎng)及其工業(yè)化的擴(kuò)大生產(chǎn)［1］。

1　基于hESC的毒性測試體系

基于hESC的毒性測試體系相對于傳統(tǒng)的動物實驗體系能比較真實地反映藥物在人體內(nèi)的毒性發(fā)生發(fā)展過程，是更加安全、經(jīng)濟(jì)、高通量的藥物篩選模型。國內(nèi)外學(xué)者已利用hESC建立胚胎發(fā)育早期及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育各個階段的毒性測試模型［2］。hESC誘導(dǎo)分化的神經(jīng)發(fā)育毒性替代模型，可在體外模擬神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的整個生物學(xué)過程，如細(xì)胞增殖、遷移、凋亡、分化、神經(jīng)突生長、突觸發(fā)生、髓鞘形成及神經(jīng)遞質(zhì)合成等［3］。此外，利用3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將hESC誘導(dǎo)培養(yǎng)成心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)管組織、內(nèi)耳感覺上皮細(xì)胞等不同類型的細(xì)胞或組織，可重建體內(nèi)細(xì)胞間、細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用，進(jìn)一步縮小細(xì)胞水平與體內(nèi)水平的差異［4-6］。

這些毒性測試體系建立之后，需要用多種陽性化合物作驗證，如丙戊酸和甲基汞是目前公認(rèn)的神經(jīng)發(fā)育毒性化合物；同時方法/模型相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和指導(dǎo)原則也需要建立與完善，以支持這些方法/模型在更多的實驗室推廣應(yīng)用。此外，有關(guān)hESC的法規(guī)和倫理學(xué)方面的爭議問題也需要建立和解決［2］。

2　基于hESC毒性測試的應(yīng)用

2.1在生殖毒性評價中的應(yīng)用

生殖毒性是毒性評價實驗中最具技術(shù)挑戰(zhàn)性，其周期長，費(fèi)用高，使用的動物數(shù)較多，種屬間外推也存在很多不確定因素。因此，急需經(jīng)濟(jì)、快速和準(zhǔn)確的替代方法［7］。歐洲替代方法驗證中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods）已通過驗證的生殖發(fā)育毒性替代方法就包括ESC實驗，可通過檢測受試物對ESC生長分化的影響及已分化成纖維細(xì)胞活力的影響來預(yù)測受試物的胚胎毒性或致畸性，是目前唯一利用細(xì)胞系而無需懷孕動物的生殖發(fā)育毒性體外替代模型［7］。但該標(biāo)準(zhǔn)化的方法僅限于小鼠ESC，由于倫理學(xué)問題限制了hESC的進(jìn)一步發(fā)展。

hESC與人類生殖發(fā)育在生理上相關(guān)。已有報道，基于hESC的模型體系可模擬男性精子發(fā)育過程，這種模型有望用于男性生殖毒性體外實驗［8］。此外，Ye等［9］利用重組技術(shù)將新生小鼠子宮上皮細(xì)胞與綠色熒光蛋白標(biāo)記的hESC結(jié)合，最終誘導(dǎo)hESC分化成女性生殖道上皮細(xì)胞。這種上皮細(xì)胞能在外雌激素的刺激下增殖并分泌子宮特有的糖蛋白-妊娠相關(guān)子宮內(nèi)膜蛋白糖孕蛋白（glycodelin）A，為研究女性生殖道早期發(fā)育提供了一種新的體外模型。同時，將hESC與各種組學(xué)技術(shù)結(jié)合研究生殖發(fā)育毒性生物標(biāo)志物也成為關(guān)注的焦點。Krug等［10］用甲基汞和丙戊酸作為陽性化合物檢測hESC在生殖及神經(jīng)發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄組學(xué)的變化，提出從轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化的角度將毒性化合物分類，這種基于hESC的體外替代法可用于評價毒性效應(yīng)引起的細(xì)胞蛋白質(zhì)內(nèi)穩(wěn)態(tài)及轉(zhuǎn)錄水平的網(wǎng)絡(luò)變化。但是基于hESC的體外生殖毒性檢測模型依然存在許多問題，如影響配子發(fā)育關(guān)鍵時期的環(huán)境因素尚不清楚，實際操作和倫理問題還有待解決和完善［8］。

2.2在神經(jīng)發(fā)育毒性評價中的應(yīng)用

hESC可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下被誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞，如神經(jīng)前體細(xì)胞、各種類型的神經(jīng)原和膠質(zhì)細(xì)胞等。誘導(dǎo)ESC形成神經(jīng)細(xì)胞有2個過程，先是生物物理狀態(tài)的ESC聚集，形成類胚體；然后經(jīng)過生物化學(xué)信號誘導(dǎo)，ESC就可分化為神經(jīng)細(xì)胞。目前常用的誘導(dǎo)方法有維A酸誘導(dǎo)、生長因子誘導(dǎo)、PA6基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)和直接分化法等［11］。而hESC作為一項體外實驗方法評價神經(jīng)發(fā)育毒性已備受關(guān)注。此類模型的主要優(yōu)點是結(jié)構(gòu)相對簡單，易于檢測，能檢測到神經(jīng)發(fā)育毒性中的細(xì)微變化。另外，還可對模型進(jìn)行相應(yīng)改造，如某些對神經(jīng)毒物易感的基因以便進(jìn)行針對性的研究［11］。

評價神經(jīng)發(fā)育毒性的檢測終點往往不需要用細(xì)胞死亡來判定，而更應(yīng)關(guān)注神經(jīng)細(xì)胞分化及通訊功能的改變［12］。Krug等［12］用人LUHMES細(xì)胞的神經(jīng)突生長實驗評價神經(jīng)發(fā)育毒性，在40余種候選化合物中，多種化合物可抑制神經(jīng)突的生長，如秋水仙堿、長春新堿、魚藤酮和環(huán)乙酰亞胺等。而有些化合物可促進(jìn)神經(jīng)突的生長，如γ激酶途徑的修飾物Ⅱ型肌球蛋白抑制劑（blebbistatin）或thiazovivin。這種以hESC的功能性（神經(jīng)突生長）作為終點考察的實驗?zāi)芨犹禺愋缘刈R別和描述神經(jīng)毒性。Nayernia等［13］用多能干細(xì)胞誘導(dǎo)出人神經(jīng)組織，再與惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，2周后惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞入侵神經(jīng)組織，在體外成功模擬了體內(nèi)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞入侵神經(jīng)組織的過程，并利用此模型確定了在腫瘤細(xì)胞與神經(jīng)組織的相互作用中發(fā)揮誘導(dǎo)或上調(diào)作用的100余個基因。Colleoni等［14］將hESC暴露于不同劑量的維A酸，將玫瑰花結(jié)形成作為形態(tài)學(xué)參數(shù)，同時結(jié)合分子參數(shù)作為檢測指標(biāo)來測試早期神經(jīng)發(fā)育毒性。結(jié)果表明，神經(jīng)花結(jié)的形成形態(tài)與維A酸暴露有明顯的濃度依賴性，且與之相關(guān)的誘導(dǎo)基因表達(dá)變化與體內(nèi)的神經(jīng)管發(fā)育非常相似，證實此細(xì)胞模型可用于測試早期神經(jīng)發(fā)育的致畸及毒性機(jī)制。眾所周知，神經(jīng)脊功能受損是引起畸形的一個重要因素。Zimmer等［15］用hESC分化出神經(jīng)脊細(xì)胞，成功模擬出人神經(jīng)脊細(xì)胞的遷移過程，并用已知的發(fā)育毒性化合物，如甲基汞、丙戊酸和醋酸鉛等作用于該細(xì)胞模型。結(jié)果證明，該實驗系統(tǒng)對發(fā)育毒性檢測具有良好的敏感性和特異性。

hESC用于神經(jīng)發(fā)育毒性體外測試方法已備受關(guān)注，但同時也有許多問題尚待完善，如缺少整體水平細(xì)胞間的相互作用、缺少毒物在體內(nèi)的代謝過程以及其他一些因素（激素或免疫功能）的影響等。

2.3基于hESC的毒理基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)

系統(tǒng)生物學(xué)是近10年來發(fā)展起來的一門前沿學(xué)科，包括基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)。多數(shù)藥物的毒性反應(yīng)都涉及到DNA、RNA、蛋白質(zhì)和代謝產(chǎn)物水平的變化及相互作用。因此，了解藥物毒性作用的分子機(jī)制及作用方式非常必要。而利用各種組學(xué)技術(shù)就可從不同分子水平來檢測毒性反應(yīng)過程中的基因和蛋白的表達(dá)差異，可尋找出特異的毒性生物標(biāo)志物，同時有助于闡明藥物毒性作用機(jī)制。有學(xué)者將hESC體外暴露于不同濃度的發(fā)育毒性藥物沙利度胺（反應(yīng)停），利用全基因組表達(dá)譜及蛋白質(zhì)圖譜技術(shù)檢測轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平的變化來探討該藥的毒性作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hESC分化14 d后POU域5級轉(zhuǎn)錄因子1（POU domain，class 5，transcription factor 1，POU5F1）、調(diào)控蛋白M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2）和RNA結(jié)合基元蛋白（RNA binding motif protein 14，RBM14）均缺失，而與神經(jīng)發(fā)育相關(guān)的p21蛋白活化激酶2（p21 protein-activated kinase 2）、血小板活化因子乙酰水合酶1b催化亞單位2（plateletactivating factor acetylhydrolase 1b，catalytic subunit 2，PAFAH1B2）和PAFAH1B3等蛋白表達(dá)上調(diào)；與四肢、心和胚胎發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及生物學(xué)過程的基因組和蛋白質(zhì)組表達(dá)水平均有差異，同時發(fā)現(xiàn)沙利度胺阻止谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)，從而在細(xì)胞內(nèi)水平探測沙利度胺的發(fā)育毒性機(jī)制［16］?；趆ESC的這種篩選方法具有高通量、高靈敏性和高特異性等優(yōu)點，且通過檢測hESC分化的中間產(chǎn)物可篩選一些用于預(yù)測和檢測藥效及毒性反應(yīng)的生物標(biāo)志物。

2.4代謝模型

眾所周知，許多化合物的毒性反應(yīng)往往不是由原型藥物引起的，而是由其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物引起的。因此，在體外替代實驗中，代謝模型一直都是關(guān)注的焦點。肝是人體新陳代謝的重要器官，用體外培養(yǎng)肝細(xì)胞研究藥物代謝也是近年來的研究熱點。近年來，人們已將hESC分化成具有一定功能的肝細(xì)胞［11］。研究表明，將hESC置于含丁酸鈉的培養(yǎng)基中，當(dāng)大部分細(xì)胞死亡后換到常規(guī)肝細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)剩余存活細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其中許多細(xì)胞能表達(dá)肝細(xì)胞特異性蛋白。研究表明，H1和H9 hESC分化的肝樣細(xì)胞均有細(xì)胞色素p450酶活性［17］。同時，3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也為hESC分化為肝細(xì)胞后體外重建肝細(xì)胞間的相互作用提供支持［11］。

但人源性肝原代細(xì)胞不易獲得且增殖困難，人們開始探討從其他細(xì)胞來源獲取原代肝細(xì)胞。如Gabriel等［18］建立了一種懸浮的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段，用轉(zhuǎn)基因大鼠ESC選擇分化出肝原代細(xì)胞。Seeliger等［19］用阿扎胞苷（5-氮雜胞苷，azacitidine）誘導(dǎo)脂肪間葉細(xì)胞分化出肝細(xì)胞，經(jīng)驗證明具有肝細(xì)胞特征。還有研究將人皮膚原代細(xì)胞中加入肝細(xì)胞生長因子培養(yǎng)，最終獲得的肝原代細(xì)胞具有與成人肝細(xì)胞相同的一些典型特征，該模型也許可用于藥物臨床前的體外毒性實驗［20］。

這種用于體外代謝的肝細(xì)胞也有其局限性。①在細(xì)胞3D培養(yǎng)過程中，一些受試物的生理生化特征會影響吸收特征，并與3D體系中的其他細(xì)胞相互作用；②新鮮分離的細(xì)胞與保存24 h的細(xì)胞會有很大的差異；③干細(xì)胞分化的肝細(xì)胞在損傷后不能像體內(nèi)肝細(xì)胞那樣自我調(diào)整和修復(fù)，可能是因為體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞缺乏血管系統(tǒng)［2］。

3　展望

利用hESC構(gòu)建藥物安全性評價模型，可提高藥物研發(fā)的針對性，減少經(jīng)費(fèi)，縮短研發(fā)周期，同時可避免種屬差異，是藥物大規(guī)模篩選的理想技術(shù)手段。雖然目前很多基于hESC毒性測試替代法還未經(jīng)過完整的驗證，適用性有限，但仍可用于早期的藥物篩選及毒性預(yù)測。今后將繼續(xù)致力于這項研究，如利用3D技術(shù)培養(yǎng)多能干細(xì)胞分化誘導(dǎo)的神經(jīng)組織可廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)的眾多領(lǐng)域，可用來研究人腦的發(fā)育及惡性膠質(zhì)瘤入侵的病理生理過程。hESC的自動化大規(guī)模生產(chǎn)也是未來努力的方向。此外，鑒定和驗證hESC應(yīng)答化合物引起的氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物也將是關(guān)注點之一［2］。

隨著hESC技術(shù)的不斷進(jìn)步與完善，基于hESC毒性測試替代法研究需要多領(lǐng)域的共同合作來推進(jìn)其迅速發(fā)展，如毒理學(xué)、ESC研究、基因組學(xué)、模型分析及自動化等。目前該項目發(fā)展的局限性在于：①已知的具有發(fā)育神經(jīng)毒性的化合物較少；②需要更多的實驗系統(tǒng)對神經(jīng)發(fā)育毒性和發(fā)育毒性進(jìn)行準(zhǔn)確的分類；③需要更多高效精確的各種組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于預(yù)測毒理學(xué)分子機(jī)制及作用方式；④3D培養(yǎng)技術(shù)及更加復(fù)雜的長期慢性暴露毒性研究等薄弱領(lǐng)域需要更好的發(fā)展［2］。此外，有關(guān)hESC倫理方面的相關(guān)法律、法規(guī)應(yīng)盡快出臺，hESC技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化及相關(guān)技術(shù)方法的規(guī)范性指導(dǎo)原則也應(yīng)建立與完善，使基于hESC的毒性測試能得到正確的引導(dǎo)，在未來的新藥研發(fā)與安全性評價中發(fā)揮巨大的作用。

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Progress in alternative testing strategies for human embryonic stem cell-based drug toxicity

JIA Li，PENG Hui，ZHAO Zeng-ming，WUHAN Bao-lier，PENG Shuang-qing
（Evaluation and Research Center for Toxicology，Institute of Disease Control and Prevention，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071，China）

Traditional drug development and pre-clinical tests are based on animals and involve large numbers of animals，costs and long periods.Meanwhile，inter-species differences are difficult to overcome.Human embryonic stem cells（hESCs），which can self-renew and directly differentiate to types of cells，have become a new tool for toxicity alternative testing.hESC-Based alternative testing models，such as the reproductive toxicity test system，neuro development toxicity test system and metabolic model，can be used to predict target organ toxicity and toxic mechanisms of chemicals，analyze metabolic pathways and to search for potential toxicity biomarkers，when combined with omics such techiniques as metabonomics，proteomicsand genomics.Therefore，hESC-based alternative testing models have extensive application to toxicology.

embryonic stem cells；toxicity tests；preconception injuries；neurotoxicity；models，metabolism

The project supported by National International Scientific and Technological Cooperation Projects （2011DFA32190）

PENG Shuang-qing，E-mail：pengsq@hotmail.com，Tel：（010）66948462

R965.3

A

1000-3002-（2016）02-0173-05

10.3867/j.issn.1000-3002.2016.02.013

2015-04-15接受日期：2015-08-27）

（本文編輯：齊春會）

國家國際科技合作專項項目（2011DFA32190）

賈 栗，女，碩士，實驗師，主要從事藥物毒理與安全性評價研究，E-mail：jiali1230@aliyun.com，Tel：（010）66948463

彭雙清，E-mail：pengsq@hotmail.com，Tel：（010）66948462