犬致病性大腸桿菌分離與鑒定的臨床意義

暢麗芳

(吉林省五星動物保健藥廠吉林長春130062)

犬致病性大腸桿菌分離與鑒定的臨床意義

暢麗芳

(吉林省五星動物保健藥廠吉林長春130062)

為了探究犬致病性大腸桿菌的耐藥性，以對臨床上的用藥進行指導，本研究使用鑒別性的培養(yǎng)基將大腸桿菌從有腹瀉癥狀的犬肛拭子病料中分離出來，而后運用生理生化以及分子生物學鑒定法對分離出來的菌株進行鑒定，并且檢測它的致病性以及對藥物的敏感性。研究結果顯示，9份病料都分離出了大腸桿菌共9株，這其中的7株大腸桿菌都有致病性，其他們對臨床上一些常見的藥物（16種）有程度不一的耐藥性，有2株耐受16種抗生素，這值得臨床上高度重視。這些大腸桿菌菌株對復方新諾明、氨芐西林以及四環(huán)素等早期使用的藥物耐藥性更強，而對頭孢西丁、阿米卡星以及磷霉素則較為敏感，所以建議使用這3種藥治療有腹瀉癥狀的犬。

犬；大腸桿菌；分離；耐藥性當前，腹瀉已經(jīng)是威脅犬類健康的一種重大疾病，特別是由犬瘟熱以及犬細小病毒導致的大腸桿菌繼發(fā)性感染嚴重降低了患病犬的存活率而在這兩種病的發(fā)展以及傳播中繼發(fā)性的細菌感染起到了主要的作用。有研究顯示[1]，在此過程中，繼發(fā)性感染的主要細菌是大腸桿菌與沙門菌。而在我國，對于寵物的臨床治療工作中使用抗生素方面往往不謹慎不合理，使得大腸桿菌具有耐藥性且其耐藥性在不斷的變強。而寵物身體攜帶的耐藥性較強的菌在寵物和人接觸的過程中可能會傳染給人，進而危害到人的健康。所以，分離和堅定犬致病性大腸桿菌在臨床上有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 采集樣品

從本動物醫(yī)院采集出現(xiàn)腹瀉癥狀的犬9只，其中有5只犬是患有細小病毒病，2只是患了犬瘟熱，另外2只是普通腹瀉。使用滅過菌的棉拭子從每只犬的肛門處進行糞便的采集工作，將采集物放置到試管中，加入適量的經(jīng)過滅菌處理的生理鹽水，而后將試管放置在搖床上進行為期4 h的震蕩操作，而后放置備用。

1.2 主要試劑

營養(yǎng)肉湯（可用瓊脂替代），伊紅美蘭、麥康凱以及三糖鐵培養(yǎng)基，藥敏紙片，大腸桿菌ATCC29213以及ATCC25922，金黃色葡萄球菌ATCC25923以及細菌生化反應管

1.3 實驗動物

購買清潔級的ICR小鼠。

1.4 細菌的分離培養(yǎng)按照一定的比例稀釋采集得到的樣品，將稀釋液涂在麥康凱瓊脂平板上，在37℃的恒溫條件下培養(yǎng)48 h以后仔細查看菌落的生長狀況。從中挑呈粉紅色的單個的菌落接種到伊紅美蘭培養(yǎng)基中，在恒溫37℃的環(huán)境下培養(yǎng)48 h。仔細觀察菌落的生長情況，從中挑選單個的顏色呈紫黑色并且?guī)в薪饘俟鉂傻木渲谱骷毦耐科?，而后進行革蘭氏染色，進行顯微鏡檢測。

1.5 PCR鑒定

按照煮沸法來進行PCR模板的制備工作，首先挑取單個的菌落接種到營養(yǎng)肉湯中，37℃恒溫環(huán)境下培養(yǎng)一夜，取1 mL的培養(yǎng)物在每分鐘10 000轉的離心機上離心1 min，棄掉上清液并加200μL超純水，進行重懸并15 min的沸水浴，每分鐘10 000轉的離心機上進行2分鐘離心后上清液就是DNA模板。

在PCR反應體系中加入足量的引物、DNA模板、PCR Mix以及超純水，在一定的條件下進行反應，得到的產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠電泳上進行檢測。將大腸桿菌ATCC29213和金黃葡萄球菌ATCC25923分別作為陽性和陰性的對照物。

1.6 小鼠致病性試驗

將經(jīng)過鑒定的9株大腸桿菌接種在營養(yǎng)肉湯中，37℃恒溫下培養(yǎng)一夜，進行離心操作以后加入等量的經(jīng)過滅活的生理鹽水進行重懸，而后進行梯度稀釋并計數(shù)菌落。把細菌的濃度調到107 CFU/mL左右，接種在每只平均重量在20 g左右的小鼠的腹腔中，劑量為每只接種0.2 mL，每10只分成一組。對照組則給小鼠接種相同劑量的經(jīng)過滅菌處理過的生理鹽水。隔離喂養(yǎng)接種的小鼠，觀察和記錄其發(fā)病和死亡的情況。一旦發(fā)現(xiàn)死亡的小鼠馬上進行解剖在無菌條件下取肝及脾在麥康凱平板上劃線培養(yǎng)[2]。

1.7 藥敏試驗

利用制片擴散法對9株大腸桿菌對于16種抗生素的敏感性進行檢測。

2 結果

2.1 細菌分離培養(yǎng)

采集到的9份樣品中分離出9株細菌，它們在麥康凱培養(yǎng)基上出現(xiàn)邊緣整齊的直徑在1～2 mm的圓形菌落，四周為粉紅色而中心呈深紅色。在伊紅美蘭培養(yǎng)基上出現(xiàn)邊緣整齊的圓形菌落，呈現(xiàn)紫黑色并伴有金屬光澤。進行革蘭氏染色后鏡檢可以看見中等大小兩端鈍圓且無芽孢，呈紅色多分散的桿菌。這與大腸桿菌的培養(yǎng)結果相符。

2.2 PCR鑒定

分離出的9株菌與大腸桿菌ATCC29213一樣都能擴增出262bp的目的基因，而金黃色葡萄球菌則沒有擴增。說明分離出來的9株菌是大腸桿菌。

2.3 小鼠致病性試驗

接種生理鹽水的對照組小鼠沒有任何癥狀，十分健康。而實驗組小鼠中，接種5、7號菌株的小鼠無異常癥狀。其他小鼠在接種后2 h出現(xiàn)拉稀癥狀，且出現(xiàn)厭食、昏睡以及扎堆等癥狀，還有部分出現(xiàn)抽搐以及癱瘓的癥狀。第2～3天有死亡小鼠出現(xiàn)。解剖后在無菌條件下取肝脾在培養(yǎng)基上劃線重新分離得到了紅色的大腸桿菌。9菌株中有7株是致病性的大腸桿菌，2株未引起病變可能是犬腸道內的正常菌群里的大腸桿菌。

2.4 藥敏試驗

藥敏試驗結果顯示，在7株致病性的大腸桿菌里，6及8號菌株對全部的抗生素（16種）都表現(xiàn)出了耐藥性，且有超過半數(shù)的菌株都對慶大霉素、阿莫西林、四環(huán)素、氨芐西林、哌拉西林以及磺胺異惡唑和復方新諾明出現(xiàn)耐藥性。而對阿米卡星、磷霉素、頭孢西丁則較為敏感。

3 討論

導致犬發(fā)生腹瀉的因素十分的復雜，臨床上可將主要的病因劃分為細菌性和病毒性，而細菌性的病原體又分為大腸桿菌、彎曲桿菌等[3]，最常見的則是大腸桿菌導致的腹瀉。病毒性腹瀉中常見的有犬瘟熱以及犬細小病毒病，二者的誘因又是以大腸桿菌和沙門菌為主。本實驗中的7株致病菌導致小鼠出現(xiàn)嚴重程度不一的腹瀉以及死亡。

研究結果顯示，分離得到的大腸桿菌對早期使用的包括復方新諾明、氨芐西林以及四環(huán)素在內的抗生素有極其強的耐藥性，而對于磺胺類藥物和慶大霉素也有較強的耐藥性，這與以往的一些報道相符。分離得到的菌株對頭孢西丁、阿米卡星和磷霉素都比較敏感，故而建議首先選擇這3種藥治療犬腹瀉癥。

分離得到的菌株表現(xiàn)出的耐藥性比較嚴重，甚至有多重買藥性的表現(xiàn)，有4株菌對超過10種以上的藥都有耐藥性，且有2株菌對本次試驗選用的16種藥都有耐藥性，這應當引起廣泛的重視。因為大腸桿菌自身帶有耐藥的質粒，而且這一質粒能夠在菌體之間傳遞，故而菌株極容易對藥物產(chǎn)生耐藥性[4]。有學者研究發(fā)現(xiàn)誘發(fā)菌株的耐藥譜多種多樣的主要因素使寵物患病的時候不正確的用藥觀念和不合理的用藥做法[5]。故而，在臨床實踐上要謹慎的用藥，如果條件允許要先做藥敏試驗，以保證疾病得到治療的同時避免細菌出現(xiàn)耐藥性的概率以及減少其傳遞?！?/p>

（編輯：趙曉松）

[1]胡曉辰,孫艷敏,郭鳳英,趙婷婷.犬源大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].當代畜牧,2015,18(3):42-44.

[2]趙相勝,孫洋,紀雪,劉軍,祝令偉,佟盼盼,馮書章.犬源大腸桿菌分離鑒定及耐藥性分析[J].中國人獸共患病學報, 2014,30(3):268-272.

[3]崔耀明,宋笑顏,王玲飛,劉保光,田亞凱,胡功政.犬源大腸桿菌分離株對四環(huán)素類藥物耐藥性的檢測[J].江西農(nóng)業(yè)學報,2015,27(10):104-107.

[4]曹旭.淺談犬腹瀉的幾種常見原因和防治[J].山東畜牧獸醫(yī),2015,36(12): 30-31.

[5]高新菊,侯羽濃,姚大偉,丁陽,楊德吉.犬致病性大腸桿菌的分離與鑒定[J].畜牧與獸醫(yī),2014,46(11):87-89.

10.3969/j.issn.1008-4754.2016.12.044