白細(xì)胞介素-18在糖尿病腎病大鼠模型中的表達(dá)水平及其對(duì)尿液腎損傷分子-1的影響

張孟姝　劉金磊　張春梅　劉學(xué)政

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧　錦州　121001)

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白細(xì)胞介素-18在糖尿病腎病大鼠模型中的表達(dá)水平及其對(duì)尿液腎損傷分子-1的影響

張孟姝劉金磊張春梅1劉學(xué)政2

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121001)

〔摘要〕目的探討白細(xì)胞介素(IL)-18在糖尿病腎病(DN)患者以及2型DN大鼠中的表達(dá)水平及其對(duì)尿液腎損傷分子(KIM)-1的影響機(jī)制。方法通過對(duì)高脂高糖高能量飼料喂養(yǎng)加小劑量注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)2型DN大鼠，檢測(cè)大鼠血清及組織中IL-18的表達(dá)水平以及尿液中KIM-1的水平。并通過對(duì)2型DN大鼠注射IL-18的中和抗體后，觀察血清及組織中IL-18的表達(dá)水平。結(jié)果與正常大鼠比較，STZ誘導(dǎo)的2型DN大鼠血清中IL-18的表達(dá)水平均顯著增加，且外周血單核細(xì)胞表達(dá)IL-18的mRNA水平顯著增加(均P<0.001)；此外，2型DN大鼠尿液中KIM-1的水平顯著增加(P<0.001)。對(duì)2型DN大鼠注射IL-18的中和抗體后，大鼠尿液中KIM-1的水平顯著降低(P<0.001)。結(jié)論IL-18可能對(duì)DN的發(fā)生發(fā)展有著一定的促進(jìn)作用，該作用機(jī)制可能是通過影響尿液中KIM-1水平實(shí)現(xiàn)的。

〔關(guān)鍵詞〕白細(xì)胞介素-18；尿液腎損傷分子-1；糖尿病腎病

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最重要的微血管并發(fā)癥之一，已成為糖尿病患者致死的主要原因〔1〕。白細(xì)胞介素(IL)-18具有多種多樣的生物學(xué)活性〔2〕。多項(xiàng)研究提示了IL-18在糖尿病患者的發(fā)病及發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用〔3～6〕，然而，關(guān)于IL-18在DN中的作用研究尚不完全。本文旨在研究 IL-18 在DN患者中的表達(dá)水平，探討其與DN的關(guān)系。此外，通過采用DN大鼠的研究模型探討IL-18對(duì)腎臟損害的分子機(jī)制。

1資料與方法

1.1動(dòng)物模型建立雄性SD大鼠(n=6)禁食15 h后，高脂高糖高能量飼料喂養(yǎng)大鼠，并使用鏈脲佐菌素(臨用前以0.1 mol/L，pH=4.2檸檬酸緩沖液溶解新鮮配置)按劑量60 mg/kg體重腹腔注射1次，于注射后72 h后取大鼠尾靜脈血測(cè)血糖，凡血糖≥16.7 mmol/L確定為糖尿病大鼠模型制作成功。

1.2主要試劑采用Trizol試劑盒(Life Technologies)提取組織及血清中的RNA；采用美國(guó)PROMEGA公司cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；PCR試劑盒購(gòu)于北京天恩澤公司。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。

1.3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)對(duì)于外周血標(biāo)本：將新鮮的抗凝血用無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)以1∶2體積比混勻稀釋。緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液中，2 000 r/min離心20 min，小心吸取中間層的外周血單核細(xì)胞。取1×106外周血單核細(xì)胞，加入到1 ml的Trizol后，按照說明書的要求抽提總RNA，所得RNA溶于25 μl焦碳酸乙二酯(DEPC)處理水。提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。進(jìn)一步對(duì)所得RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并將其于-20℃保存?zhèn)溆谩L-18引物序列為正義：5′-GCTTGAATCTAAATTATCAGTC-3′，反義：5′-GAAGATTCAAATTGCATCTTAT-3′〔7〕。對(duì)照采用 U6作為內(nèi)參：序列為正義：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃變性20 s，然后60℃ 20 s和70℃ 1 s進(jìn)行50個(gè)循環(huán)。采用美國(guó)ABI公司的7900型號(hào)Real-Time PCR儀器進(jìn)行分析，最終結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析〔8〕。

1.4ELISA法檢測(cè)血清IL-18采用上海拜力生物科技有限公司的人和大鼠的ELISA試劑盒檢測(cè)血清中IL-18的水平，具體步驟參考試劑盒說明書。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)分析。

2結(jié)果

2.1DN大鼠血清IL-18與尿液KIM-1的水平DN大鼠血清IL-18水平顯著高于正常大鼠〔(57.41±12.63)pg/ml vs(8.31±1.47)pg/ml，t=9.46，P<0.001〕；同時(shí)，DN大鼠外周血單核細(xì)胞IL-18的mRNA水平顯著高于正常大鼠(7.11±2.33 vs 1.11±0.27,P<0.001)。此外，2型DN大鼠尿液中KIM水平顯著高于正常大鼠〔(97.27±23.12)pg/ml vs(13.45±3.45)pg/ml，t=8.78，P<0.001〕。

2.2DN大鼠中和IL-18后抑制尿液KIM-1的水平注射了IL-18的抗體后，大鼠體內(nèi)的IL-18顯著降低〔(51.23±11.45)pg/ml vs(15.23±5.41)pg/ml〕(P<0.05)，且大鼠尿液中KIM的水平顯著降低〔(42.26±16.23)ng/ml vs(93.45±21.33)ng/ml，t=8.78，P<0.001〕。

3討論

DN是糖尿病的主要慢性并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要病因之一。目前，研究認(rèn)為DN受多方面因素(血流動(dòng)力學(xué)因素、代謝因素、遺傳因素、氧化應(yīng)激等)影響。近年來，DN亦被認(rèn)為是一種由糖脂代謝紊亂引發(fā)的炎性反應(yīng)性疾病。越來越多的證據(jù)表明，固有免疫細(xì)胞的活化與慢性炎性反應(yīng)是DN 的一個(gè)公認(rèn)的發(fā)病因素〔9〕。細(xì)胞的激活和炎性分子的釋放，協(xié)同其他機(jī)制促使炎性反應(yīng)的發(fā)生，是DN持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵性因素。研究認(rèn)為，腎臟固有細(xì)胞在病理狀態(tài)下可以產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1、一氧化氮(NO)及IL-6等多種細(xì)胞因子，從而參與DN的發(fā)病與發(fā)展〔10〕。然而其他的炎癥因子與DN的關(guān)系研究尚不完全明確。

IL-18是另一類在人體內(nèi)的多種細(xì)胞、多種組織器官中表達(dá)的細(xì)胞因子，其在正常狀態(tài)下濃度很低，然而在某些應(yīng)急狀態(tài)下會(huì)產(chǎn)生高表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，將DN患者與非糖尿病患者進(jìn)行比較，DN患者腎臟組織中的 IL-18 表達(dá)顯著升高〔11〕，提示了IL-18可能會(huì)在DN的致病過程中發(fā)揮重要的功能，且炎癥因子IL-18在DN的發(fā)病及發(fā)展中極其重要。Giunti等〔12〕發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者血清中IL-18水平增加，并且發(fā)現(xiàn)IL-18水平可以增加糖化血紅蛋白(HbA1C)及空腹血糖(FPG)的濃度，從而進(jìn)一步佐證了本研究的結(jié)果。

KIM-1是腎臟近曲小管上皮細(xì)胞一種跨膜糖蛋白，其在正常肝、脾、腎中微量表達(dá)，而在受損后再生的近曲小管上皮細(xì)胞中表達(dá)顯著增強(qiáng)〔13〕，并能迅速、靈敏、特異地反映各種腎臟疾病的損傷及恢復(fù)過程。本研究結(jié)果提示炎癥因子IL-18可能與腎臟損傷有著密切關(guān)系。這與之前研究的人群結(jié)果一致〔14〕。而且IL-18可能參與DN損傷的發(fā)生，而抑制細(xì)胞因子IL-18對(duì)于糖尿病患者的腎損傷可能有著直接的治療作用。分析IL-18對(duì)DN的致病機(jī)制可能是通過促進(jìn)TNF-α、IL-1β及干擾素(IFN)-γ等細(xì)胞因子的產(chǎn)生從而引起腎小球微循環(huán)發(fā)生改變、基質(zhì)膨脹以及腎小球系膜細(xì)胞活化與增殖等病理過程〔15〕。

綜上所述，IL-18的高表達(dá)在DN的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，其可能通過促進(jìn)KIM-1水平來影響腎臟功能。抑制IL-18可能是臨床上治療糖尿病腎損傷的有效手段，值得臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。

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〔2015-08-10修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔中圖分類號(hào)〕R517.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)06-1308-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.013

通訊作者：劉學(xué)政(1962-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病視網(wǎng)膜病變治療方面的研究。

1錦州石化醫(yī)院2遼寧醫(yī)學(xué)院

第一作者：張孟姝(1982-)，女，碩士，主管護(hù)師，主要從事糖尿病并發(fā)癥方面的研究。