脊髓損傷豬模型建立的一般過程

符策崗 曾 艷 趙紅衛(wèi) 劉 揚 肖運祥 陳海丹

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院 宜昌市中心人民醫(yī)院脊柱外科脊柱微創(chuàng)中心 脊柱醫(yī)學與創(chuàng)傷研究所，湖北 宜昌 443000)

?

·綜 述·

脊髓損傷豬模型建立的一般過程

符策崗 曾 艷1趙紅衛(wèi) 劉 揚 肖運祥 陳海丹

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院 宜昌市中心人民醫(yī)院脊柱外科脊柱微創(chuàng)中心 脊柱醫(yī)學與創(chuàng)傷研究所，湖北 宜昌 443000)

脊髓損傷；豬模型

脊髓損傷(SCI)的發(fā)病率隨著現(xiàn)代交通和建筑事業(yè)的發(fā)展而逐年上升，給患者及患者家屬帶來極大的精神及經(jīng)濟負擔。盡管對于SCI患者的臨床處理已經(jīng)有一定提高且可采用多種手段限制繼發(fā)性損傷，但患者神經(jīng)功能的恢復(fù)依舊有限，眾多患者依然長期伴隨神經(jīng)功能不全或喪失。因此，科研工作者們嘗試從多方面找尋SCI治療的方式和方法，例如干細胞移植〔1〕、MicorRNA調(diào)節(jié)通路〔2〕、神經(jīng)再生〔3〕、低溫〔4〕、電刺激〔5〕、改良手術(shù)術(shù)式〔6〕或者一些其他后期護理強化療法〔7〕等等。但無論是上述哪一項研究，一個合適的SCI動物模型是其中必不可少的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。鼠因易于控制、均一性良好且經(jīng)濟方便等原因，成為構(gòu)建SCI首選的動物模型，但近年發(fā)現(xiàn)，豬相對于鼠在解剖、神經(jīng)生物學、心血管、胃腸道和基因組等方面與人類更為相似〔8〕。值得一提的是，豬脊柱脊膜的厚度與人類相似，可被用于脊柱壓力承受方面的研究，也可用于腦脊液壓力方面的研究〔9～11〕。此外，豬的病理生理變化也與人類相似，可用于研究SCI引起的局部代謝性變化〔12,13〕，同時豬體型相對較大，便于實施脊髓手術(shù)，也便于長期觀察脊髓損傷后肢體功能的恢復(fù)情況而常被用于SCI手術(shù)以及影像學分析方面的研究〔14,15〕。因此，豬在構(gòu)建SCI模型方面具有其獨特的優(yōu)勢，同時豬相比于靈長類動物也更為經(jīng)濟，均一性也較強，本文就SCI豬模型構(gòu)建的一般過程做一簡要綜述。

1 SCI豬模型構(gòu)建的一般過程

1.1 動物的選擇 大部分報道中選用體重15～20 kg雌性小型豬，病理生理狀況與人類相似，部分數(shù)據(jù)如下〔8～15〕：血液值：紅細胞數(shù)(6～7)×106cells/ml；血細胞比容30%～35%；血紅蛋白9～11 g/dl；網(wǎng)織紅細胞，2%～3%；白細胞數(shù)(16～17)×109/L；血小板數(shù)(300～400)×109/L；凝血酶時間25～30 s；凝血酶原時間11～12 s。血流動力學：平均收縮壓(140±15)mmHg；平均舒張壓(96±14)mmHg；心率(103±14)次/min；每日排尿量1.5～2 L；直腸體溫(38.9±2)℃。血漿生化指標：葡萄糖(101±2)mg/dl；總蛋白(4.5±3)g/dl；白蛋白(2.6±0.1)g/dl；肌酸酐(0.6±0.01)mg/dl；鈣離子(11.8±0.7)mg/dl；堿性磷酸酶(492±15)U/L。

1.2 麻醉 手術(shù)前禁食12 h，給予肌肉注射氯胺酮(35 mg/kg)、乙酰丙嗪(1.1 mg/kg)和阿托品(0.04 mg/kg)混合液鎮(zhèn)靜，麻醉實驗豬后行氣管插管，維持供氧和1%～3%異氟醚持續(xù)全身麻醉，麻醉完成后給實驗豬頭部和背部備皮。獸醫(yī)工作人員全程在旁監(jiān)測麻醉程度，檢測內(nèi)容：眼瞼和角膜反射、心跳和呼吸頻率、動脈血氧飽和度、直接/間接血壓，呼氣末二氧化碳分壓、肌張力以及對傷害性刺激的反應(yīng)等。

1.3 固定 實驗豬以俯臥位安置于模仿脊柱外科手術(shù)臺制作的平臺上。將可調(diào)式吊具固定于動物的胸部和骨盆下放，保持下腹部自由懸掛，這樣做能最大限度地減少腹部和胸部的壓力以及術(shù)中有可能隨之而來的硬膜外靜脈出血。此外，平臺還可起脊柱手術(shù)外固定的作用〔16〕。此外，實驗豬應(yīng)被安置在循環(huán)熱墊上以保持體溫，應(yīng)行耳緣靜脈穿刺以保證手術(shù)過程中藥物的給予和必要的補液。最后，手術(shù)區(qū)域用酒精與氯或碘溶液消毒后鋪巾，整個過程中需保證充分的手術(shù)區(qū)域暴露。

1.4 椎板切除術(shù) 選定手術(shù)位點后，做10～15 cm的手術(shù)切口，剝離脊柱兩側(cè)的肌肉組織。充分暴露椎骨后，使用咬骨鉗移除棘突和椎板，充分暴露下部的脊髓。常選用的手術(shù)位點是C3～C5或L2～L4。

1.5 安置脊柱吊桿 脊柱吊桿的安置是脊髓注射(基因或細胞)治療的必要裝置。此項裝置由Riley等〔17〕在2011年成功研發(fā)并使用。

安全放置好的患者，在安裝固定桿的位點做1 cm的切口并在切口處蓋上薄板。使用兩個拉鉤拉住4個經(jīng)皮切口位點，牽拉并充分暴露脊髓區(qū)域(行椎板切除區(qū)域)。

1.6 硬膜開口 使用Woodson(牙科工具)在硬膜上做一個2.5 cm的切口，暴露脊髓。使用4-0的尼龍縫線將硬膜縫于脊柱兩旁肌肉組織上。如有條件也可行外科手術(shù)前貼膜，以保證脊髓液不會流至手術(shù)巾內(nèi)造成污染。此外，在人類的手術(shù)中，軟膜表面應(yīng)在外殼顯微鏡放大的條件下進行分離。

1.7 脊柱脊髓注射以及脊柱旁側(cè)路注射 在給藥前，靜脈注射甲潑尼松龍(125 mg)以防止脊髓腫脹。

將平臺上的軌制和側(cè)軌系統(tǒng)調(diào)節(jié)到適合的長度，在吊桿的上方，將2個桿子和Z字形驅(qū)動器裝在通用接頭上。將金屬管道安裝到微型硬盤內(nèi)，將連接管連接到微量注射器上，調(diào)整通用接頭的方向并確保金屬管道垂直于脊髓注射的表面。將針定位于背跟刺入?yún)^(qū)(DREZ)。DREZ通過3.5×外科手術(shù)放大鏡定位，定位后將針從脊髓正中刺入<1 mm的深度。

液體可以注入軟脊膜約4 mm的深度，可在進針前放置一個塑料護翼在軟脊膜的表面，以防止入針過深。到達目標位置后可將金屬套管拔出，露出內(nèi)部的管道。注射完成后，針需要留置約1 min，以防止細胞順著入針軌跡流出。

穿刺時盡量避開表面的血管系統(tǒng)，但穿刺位點的少許出血在所難免。一旦發(fā)生出血，應(yīng)立即使用微型吸引器吸取干凈，盡力防止血液順穿刺位點流入脊髓內(nèi)。如確定不會流入脊髓，也可以燒灼促使血液凝固。

隨著針管拔出，立體定向儀應(yīng)當順著尾椎的方向遷移至下一個位點，兩位點之間相隔2～4 mm并避開背部表面可見的血管，這個過程根據(jù)實驗需要可以重復(fù)多次。

1.8 懸掛的注射導(dǎo)管 常常使用小直徑的金屬導(dǎo)管注射藥物。將一個30號的可調(diào)式柔性硅橡膠管套上一個長度固定的30號金屬套管斜針中，末端裝有泵漢密爾頓魯爾鎖并與微量注射器連接。近端的硅橡膠管用24號鋼性金屬管道包裹，放于注射器邊緣的尾部。翼樣的結(jié)構(gòu)都被安在金屬管道的外部，發(fā)揮停針指示作用。每一次注射，實驗用藥都以適當?shù)牧客ㄟ^微量注射泵注射。

1.9 縫合 一旦注射完成則移開脊柱吊架并分四層縫合切口。使用4-0號的尼龍線縫合硬脊膜，0號可吸收式線密閉縫合肌肉層。筋膜層依然使用0號可吸收式線密閉縫合，然后使用2-0號可吸收線縫合以連續(xù)縫合最外層，最后使用3-0尼龍線縫合皮膚。

1.10 術(shù)后恢復(fù)和疼痛控制 實驗豬在完成手術(shù)后應(yīng)監(jiān)控2 h，觀察麻醉后恢復(fù)情況。隨后將動物送回自己的籠中，每天觀察動物的攝食量，排便和排尿情況。

術(shù)后3 d，可用芬太尼貼劑(75 mg)局部貼覆手術(shù)區(qū)域，幫助緩解術(shù)后疼痛或用丁丙諾啡(0.05 mg/kg)肌注幫助緩解緩解術(shù)后疼痛。

1.11 癥狀和結(jié)果 在手術(shù)前記錄實驗豬的基本情況，術(shù)后再按實驗要求觀察1～7 w，收集行為數(shù)據(jù)并做神經(jīng)病學分析〔18〕。采用機械性刺激腳趾或者后肢觀察無收縮反應(yīng)是否缺失以判定感覺系統(tǒng)的功能情況。使用塔洛夫評分標準，判斷運動功能，評分等級如下0：麻痹，無運動；1：可觀察到肌緊張，輕微移動；2：可以移動后肢但是不能坐和移動；3：能做短暫的站立和行走但是存在共濟失調(diào)；4：完全恢復(fù)，具備正常步態(tài)。

操作的安全性由實驗豬術(shù)后機體功能是否能恢復(fù)到術(shù)前的基線決定。短暫性神經(jīng)性功能缺失在手術(shù)后1～7 d內(nèi)基本恢復(fù)，這一過程與動物的品種和手術(shù)操作有關(guān)(注射的次數(shù)或其他參數(shù))，永久性神經(jīng)功能缺失不能隨時間的推移而恢復(fù)。

2 前景展望

SCI模型在SCI相關(guān)研究中扮演重要的角色，準確的選擇良好的動物模型對實驗具有重要的指導(dǎo)意義。豬在病理生理、解剖、心血管、神經(jīng)病學等等方面和人類有明顯的相似之處。豬模型運用于SCI研究有自己的特點和優(yōu)勢，尤其在了解脊髓實質(zhì)性注射的耐受力，對脊柱相關(guān)脫髓鞘、退行性變以及外傷性脊柱疾病實驗的設(shè)計和實行具有獨特的優(yōu)勢。此外，有些實驗室在脊髓損傷方面已經(jīng)做了很長期的研究，前期用的都是小鼠模型，但是近年轉(zhuǎn)而使用豬模型。在老鼠身上得到研究成果，在轉(zhuǎn)向人體之前，都需要在更高級的哺乳動物身上做進一步實驗，嚙齒類動物的神經(jīng)系統(tǒng)相對比較簡單，我們需要更高級的實驗動物以獲得更為準確的實驗數(shù)據(jù)〔15〕。但是豬模型構(gòu)建到目前為止依然不清楚能引起短暫性或永久性神經(jīng)功能缺失的最大注射劑量，同時注射的位置也會影響發(fā)病率。此外，脊髓宏觀的(如不經(jīng)意地轉(zhuǎn)動)或微觀的(如心臟搏動的震動)無意識運動有可能在脊髓注射時造成風險。了解大型實驗動物發(fā)病率的閾值，將有助于所有脊髓治療方案劑量的計算。本文闡述的脊髓模型構(gòu)建方式希望能在脊髓模型應(yīng)用設(shè)計和實驗上發(fā)揮一定作用。

1 Gutierrez J,Lamanna JJ,Grin N,etal.Preclinical validation of multilevel intraparenchymal stem cell therapy in the porcine spinal cord〔J〕.Neurosurgery,2015;77(4):604-12.

2 Nieto-Diaz M,Esteban FJ,Reigada D,etal.MicroRNA dysregulation in spinal cord injury:causes,consequences and therapeutics〔J〕.Front Cell Neurosci,2014;8(9):53-53.

3 Zhao YZ,Jiang X,Xiao J,etal.Using NGF heparin-poloxamer thermosensitive hydrogels to enhance the nerve regeneration for spinal cord injury〔J〕.Acta Biomaterialia,2015;(15):30143-4.

4 Tracy B,Armola R,Micham J.The “Cold Cord”:a review of therapeutic hypothermia for traumatic spinal cord injuries〔J〕.Am J Crit Care,2015;24(6):540-3.

5 Kanchiku T,Suzuki H,Imajo Y,etal.The efficacy of neuromuscular electrical stimulation with alternating currents in the kilohertz frequency to stimulate gait rhythm in rats following spinal cord injury〔J〕.Biomed Online,2015;14(1):1-14.

6 Yang Z,Zhang Y,Xu D,etal.Percutaneous vertebroplasty combined with interstitial implantation of 125I seeds in banna mini-pigs〔J〕.World J Surg Oncol,2013;11:46.

7 Natalia Padula,Mariana Costa,Alexsandro Batista,etal.Long-term effects of an intensive interventional training program based on activities for individuals with spinal cord injury:a pilot study〔J〕.Phys Theory Prac,2015;31(8):568-74.

8 Bendixen E,Danielsen M,Larsen K,etal.Advances in porcine genomics and proteomics-a toolbox for developing the pig as a model organism for molecular biomedical research〔J〕.Brief Func Genom,2010;9(3):208-19.

9 Lee JHT,Jones CF,Okon EB,etal.A novel porcine model of traumatic thoracic spinal cord injury〔J〕.J Neurotrau,2013;30(3):142-59.

10 Jones CF,Lee JHT,Burstyn U,etal.Cerebrospinal fluid pressures resulting from experimental traumatic spinal cord injuries in a pig model〔J〕.J Biomech Engin,2013;135(10):101005.

11 Jones CF,Newell RS,Lee JHT,etal.The pressure distribution of cerebrospinal fluid responds to residual compression and decompression in an animal model of acute spinal cord injury〔J〕.Spine,2012;37(23):E1422-31.

12 Okon EB,Streijger F,Lee JHT,etal.Intraparenchymal microdialysis after acute spinal cord injury reveals differential metabolic responses to contusive versus compressive mechanisms of injury〔J〕.J Neurotrau,2013;30(18):1564-76.

13 Zurita M,Aguayo C,Bonilla C,etal.The pig model of chronic paraplegia:a challenge for experimental studies in spinal cord injury〔J〕.Prog Neurobiol,2012;97(3):288-303.

14 Jones C F,Cripton PA,Kwon BK.Gross morphological changes of the spinal cord immediately after surgical decompression in a large animal model of traumatic spinal cord injury〔J〕.Spine,2012;37(15):E890-9.

15 Zurita M,Aguayo C,Bonilla C,etal.The pig model of chronic paraplegia:a challenge for experimental studies in spinal cord injury〔J〕.Prog Neurobiol,2012;97(3):288-303.

16 Usvald D,Vodicka P,Hlucilova J,etal.Analysis of dosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinal stem cells in immunosuppressed minipigs〔J〕.Cell Transpl,2010;19(9):1103-22.

17 Riley JP,Raore B,Taub JS,etal.Platform and cannula design improvements for spinal cord therapeutics delivery〔J〕.Neurosurgery,2011;69:147-54.

18 Raore B,Federici T,Taub J,etal.Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy:assessment of surgical risks in Gottingen minipigs〔J〕.Spine,2011;36(3):E164-71.

〔2016-02-19修回〕

(編輯 郭 菁)

國家自然科學基金(No.81302346)；宜昌市科技研究基金(A12301-06)；宜昌市中心人民醫(yī)院基金(KFJ2011009)

陳海丹(1982-)，男，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事免疫學研究。

符策崗(1991-)，男，碩士，主要從事骨外科研究。

R744

A

1005-9202(2016)20-5182-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.121

1 三峽大學醫(yī)學院