15-LO在慢性髓系白血病中作用的研究進(jìn)展*

梅 芬， 李瑞瑋， 楊同華， 撒亞蓮△

(1昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院，云南省第一人民醫(yī)院臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，云南 昆明 650050；2云南省第一人民醫(yī)院國家臨床重點(diǎn)?？蒲嚎? 云南 昆明 650032)

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15-LO在慢性髓系白血病中作用的研究進(jìn)展*

梅 芬1， 李瑞瑋1， 楊同華2， 撒亞蓮1△

(1昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院，云南省第一人民醫(yī)院臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，云南 昆明 650050；2云南省第一人民醫(yī)院國家臨床重點(diǎn)?？蒲嚎? 云南 昆明 650032)

白血病是一組高度異質(zhì)性的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，有一種或幾種白細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)和量的異常，并在骨髓和其它器官中廣泛浸潤，導(dǎo)致正常血細(xì)胞減少。白血病按照細(xì)胞類型的不同，分為髓系白血病和淋巴細(xì)胞白血??；按自然病程和細(xì)胞的成熟度分為急性白血病和慢性白血病。其中，慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是造血干/祖細(xì)胞惡性增殖、分化和凋亡受阻的克隆性疾病，在成年白血病患者中占15%～20%[1-2]。當(dāng)前，酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)是治療CML的一線藥物，但面臨耐藥與復(fù)發(fā)。白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells，LSCs)是一群處于靜止/休眠期的細(xì)胞，具有自我更新和增殖分化的潛能，是白血病的起始細(xì)胞，也是白血病復(fù)發(fā)和耐藥的根源[3-4]。因此，尋找靶向LSCs的分子標(biāo)簽是治療CML的關(guān)鍵。已有研究表明，花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代謝通路中的關(guān)鍵酶15-脂氧合酶(15-lipoxygenase，15-LO)在CML的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色，決定著慢性髓系LSCs的自我更新、增殖、分化及凋亡等生物學(xué)特性，是治療CML的關(guān)鍵分子[5-6]。

1 15-LO的基本特點(diǎn)

15-LO根據(jù)作用底物的不同，分為15-LO-1和15-LO-2兩個亞型，但人類15-LO兩個亞型的氨基酸序列同源性僅為40%，其編碼基因花生四烯酸15-脂氧合酶(arachidonate 15-lipoxygenase，Alox15)定位于染色體17p13.3和17p13.1，分別編碼662個氨基酸的15-LO-1和676個氨基酸的15-LO-2[5, 7]。由于15-LO-1廣泛分布于網(wǎng)織紅細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、肺泡及支氣管上皮細(xì)胞、前列腺、乳腺、結(jié)腸、直腸、食管、胃和皮膚等組織細(xì)胞中，因此常用15-LO-1代表15-LO。15-LO-2局限表達(dá)于肺、皮膚、前列腺、角膜、食管等上皮組織。15-LO在生理?xiàng)l件下表達(dá)量較少，而在炎癥反應(yīng)、動脈粥樣硬化等病理過程中表達(dá)上調(diào)[5, 7-9]。

已有研究表明，15-LO在腫瘤中的作用具有組織特異性[5, 10-12]。例如在大腸癌，15-LO能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用[13-14]，而其在前列腺癌中發(fā)揮促癌作用[15]；Middleton等[16]在Alox15-/-老齡小鼠(48周以上)中觀察到Mac-1+巨噬細(xì)胞增多，推測15-LO在骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disorder，MPD)中作為“抑制子”發(fā)揮作用；但Chen等[6]認(rèn)為，Alox15-/-小鼠出現(xiàn)Mac-1+細(xì)胞增多是因?yàn)樵煅杉?xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)數(shù)量減少出現(xiàn)的代償性變化，Alox15-/-可靶向清除慢性髓系LSCs。

2 15-LO對正常造血干細(xì)胞的影響

15-LO和Alox15 mRNA在正常造血干細(xì)胞(HSCs)和造血干/祖細(xì)胞(hematopoietic stem/progenitor cells，HSPCs)有表達(dá)[6,17]。Kinder等[17]報道15-LO是維持HSCs功能的關(guān)鍵因子，敲除Alox15(Alox15-/-)使HSCs的造血重建能力受損。Chen等[6]用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測野生型小鼠(Alox15+/+)和Alox15-/-小鼠的HSCs(GFP-Lin-Sca-1+c-Kit+)、長期造血干細(xì)胞(long-term hematopoietic stem cells, LT-HSCs)、短期造血干細(xì)胞(short-term hematopoietic stem cells, ST-HSCs)和多能祖細(xì)胞(multipotent progenitor cells, MPPs)，觀察到其在Alox15-/-組的細(xì)胞數(shù)量減少，而百分比例基本一致；同時觀察到Alox15-/-組的細(xì)胞周期分布中S 期和G2/M 期的百分比例增加，骨髓中的普通髓系祖細(xì)胞(common myeloid progenitors，CMPs)、粒/巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞(granulocyte/macrophage progenitors，GMPs)和巨核細(xì)胞/紅系祖細(xì)胞(megakaryocytic/erythroid progenitors，MEPs)以及外周血中成熟Gr-1+中性粒細(xì)胞、Mac-1+巨噬細(xì)胞所占百分比例增加[6]。提示細(xì)胞增殖活躍，推測是Alox15-/-小鼠HSCs數(shù)量減少引起的代償性反應(yīng)。但Alox15-/-對HSCs長期造血重建能力的影響尚不清楚。

Chen等[6]將野生型(CD45.1)與Alox15-/-(CD45.2)小鼠的骨髓細(xì)胞以1∶1混合經(jīng)尾靜脈或骨髓腔移植給受致死劑量射線處理的受體鼠，12周檢測到外周血中Alox15-/-(CD45.2)小鼠來源細(xì)胞的百分比例明顯低于野生型(CD45.1)小鼠來源的細(xì)胞。隨后，將不同數(shù)量級別的野生型(CD45.1)與Alox15-/-(CD45.2)小鼠的骨髓細(xì)胞分別移植給受致死劑量射線處理的受體鼠，發(fā)現(xiàn)接受1×104野生型(CD45.1)小鼠骨髓細(xì)胞的受體鼠存活下來，造血重建得到恢復(fù)；而接受Alox15-/-(CD45.2)小鼠骨髓細(xì)胞的受體鼠需要植入更多的骨髓細(xì)胞才能重建造血，且僅有部分小鼠存活。另外，將MSCV-GFP分別轉(zhuǎn)染野生型(CD45.1)與Alox15-/-(CD45.2)小鼠骨髓細(xì)胞后移植給受致死劑量射線處理的受體鼠，4個月檢測到HSCs的細(xì)胞數(shù)量及百分比例在接受Alox15-/-(CD45.2)小鼠骨髓細(xì)胞的受體鼠中明顯少于野生型(CD45.1)組[6]。上述結(jié)果表明，Alox15-/-小鼠HSCs的“干性”有缺陷，骨髓造血重建功能受到影響。

3 15-LO對慢性髓系白血病的影響

據(jù)報道，15-LO 的代謝產(chǎn)物15S-HPETE抑制人白血病K562細(xì)胞和Jurkat細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[18-19]。Maccarrone等[20]報道15-LO的中間代謝產(chǎn)物氫過氧化物誘導(dǎo)人白血病K562細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果提示15-LO在白血病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，但15-LO在體內(nèi)的抗白血病作用及其機(jī)制并不清楚。

Chen等[6]報道，Alox15 mRNA和5-LO蛋白在Bcr-Abl逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的CML 樣小鼠來源的LSCs中高表達(dá)，且不受酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼的影響。Bcr-Abl逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的CML 樣小鼠(野生型，Alox15+/+)的存活時間僅為4周。而接受Bcr-Abl逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的Alox15-/-小鼠骨髓細(xì)胞的受體鼠可長期存活，在外周血中僅有一過性的白血病細(xì)胞(GFP+Gr-1+)出現(xiàn)，并逐漸消失；在回復(fù)實(shí)驗(yàn)中，將攜帶Bcr-Abl和Alox15的重組質(zhì)粒(Bcr-Abl-IRES-ALOX15-pMSCV)轉(zhuǎn)染Alox15-/-小鼠骨髓細(xì)胞后移植給受體鼠，受體鼠出現(xiàn)CML的典型表現(xiàn)。上述結(jié)果提示Alox15是Bcr-Abl誘發(fā)CML樣小鼠模型的必需基因，但其作用及機(jī)制尚不清楚。

Chen等[6]將Bcr-Abl轉(zhuǎn)染Alox15+/+(CD45.1)和Alox15-/-(CD45.2)小鼠骨髓細(xì)胞后分別移植給受體鼠，觀察到Alox15-/-組LSCs(GFP+Lin-Sca-1+c-Kit+)、CMPs、GMPs和MEPs的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，小鼠長期存活，而正常HSCs的數(shù)量僅輕度減少；隨后分別將受體鼠(Alox15+/+組和Alox15-/-組)骨髓細(xì)胞以1∶1混合后移植給第2代受體鼠，移植后14和20 d，在受體鼠的外周血中檢測到80%白血病細(xì)胞(GFP+Gr-1+)來自Alox15+/+(CD45.1)組，小鼠死于CML。其次，觀察到Alox15-/-組小鼠源LSCs在細(xì)胞周期分布S+G2/M的百分比例高于Alox15+/+組，推測是LSCs減少引起的代償性增加。另外，Alox15-/-使LSCs凋亡增加，而HSCs基本不受影響。上述結(jié)果表明，Alox15-/-使Bcr-Abl逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的CML樣小鼠源LSCs的自我更新、增殖和分化潛能受損，致LSCs在第2代小鼠體內(nèi)不能連續(xù)傳遞、不能誘發(fā)CML樣小鼠模型，而其對正常HSCs的影響較??；因此，Alox15-/-對LSCs的影響程度大于HSCs，存在靶向敲除Alox15治療CML的時間窗。上述結(jié)果表明，在基因水平敲除Alox15(Alox15-/-)可靶向清除LSCs，但15-LO的酶活性受抑制后是否也有相似的作用尚不清楚。

4 15-LO抑制劑對慢性髓系白血病的作用

PD146176是15-LO特異性抑制劑[6, 21]。Chen等[6]用15-LO抑制劑PD146176(3 μmol/L)孵育Bcr-Abl逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的CML樣小鼠骨髓細(xì)胞3 d，觀察到LSCs(GFP+LSK)和CMPs的增殖受到抑制。隨后在Bcr-Abl逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的CML 樣小鼠建模第8天進(jìn)行PD146176(100 mg·kg-1·d-1，0.3 mL)灌胃治療；建模14 d，檢測到PD146176抑制LSCs增殖，誘導(dǎo)其凋亡，血漿中15-LO代謝產(chǎn)物15S-HETE的濃度降低，外周血中白血病細(xì)胞(GFP+Gr-1+)的數(shù)量減少，且隨著治療時間的延長，白血病細(xì)胞(GFP+Gr-1+)在外周血、骨髓中幾乎檢測不到；白血病細(xì)胞浸潤肺、脾的程度減輕，小鼠幾乎是全部存活下來；而安慰劑治療的CML樣小鼠4周內(nèi)死亡。結(jié)果提示，PD146176對Alox15編碼產(chǎn)生的15-LO酶活性有抑制作用。其次，PD146176治療CML樣小鼠90 d時，LSCs(GFP+LSK)降至0.0016%，而正常HSCs(GFP-LSK)數(shù)量為其10倍之多。結(jié)果提示PD146176對LSCs的清除作用遠(yuǎn)大于對正常HSCs的影響。再次，在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中觀察到PD146176抑制骨髓白血病前體細(xì)胞的克隆形成能力，但對LSCs、HSCs的歸巢能力無明顯影響；另外，將PD146176治療CML樣小鼠的骨髓細(xì)胞移植給第2代受體鼠，觀察到受體鼠出現(xiàn)CML樣癥狀的時間延遲，外周血白血病細(xì)胞的數(shù)量減少，而正常HSCs基本不受影響。上述結(jié)果表明，PD146176對Bcr-Abl逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的CML樣小鼠源LSCs和白血病細(xì)胞的生長有抑制作用。

目前治療CML的臨床一線用藥是伊馬替尼、尼洛替尼等TKIs藥物[22-23]，那么，PD146176與TKIs是否有協(xié)同作用呢？分別將PD146176單藥、伊馬替尼單藥或PD146176與伊馬替尼聯(lián)合治療Bcr-Abl逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的CML樣小鼠，觀察到PD146176單藥組和聯(lián)合用藥組受體鼠的外周血和骨髓中LSCs的百分比例及細(xì)胞數(shù)量均顯著減少，但聯(lián)合治療組與PD146176單藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，推測PD146176單藥對LSCs的抑制效果大于伊馬替尼單藥[6]。由于上述研究結(jié)果是基于CML樣小鼠模型，但PD146176對人源髓系LSCs和白血病細(xì)胞的作用并不清楚。

將PD146176孵育人白血病K562細(xì)胞(Bcr-Abl陽性)48和96 h，觀察到細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，細(xì)胞增殖受到抑制，且伴有PTEN、ICSBP和caspase-9蛋白表達(dá)上調(diào)，而β-catenin、PI3K和AKT蛋白表達(dá)減少[6, 24]；PD146176對人白血病HL60細(xì)胞(Bcr-Abl陰性)有抑制作用，但作用較弱[6]。這提示PD146176對Bcr-Abl陽性的人源髓系白血病細(xì)胞株的抑制效果更好。其次，觀察到shRNA沉默人白血病BV-173細(xì)胞株Alox15基因表達(dá)后，細(xì)胞的生長受到抑制，凋亡增加。再次，用PD146176、伊馬替尼、尼洛替尼單獨(dú)或聯(lián)合用藥孵育Bcr-Abl陽性的CML患者外周血CD34+細(xì)胞24和72 h后檢測細(xì)胞的生長狀況、凋亡及克隆形成能力，觀察到PD146176單藥組使細(xì)胞的存活率顯著降低、凋亡增加以及細(xì)胞的克隆形成能力受到顯著抑制，但聯(lián)合治療組僅在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中有輕微的協(xié)同作用；然而PD146176與尼洛替尼聯(lián)合作用72 h，抑制細(xì)胞克隆形成的能力優(yōu)于PD146176單藥組；而健康對照組CD34+細(xì)胞的克隆形成能力幾乎不受影響。另外，PD146176孵育臨床CML患者的CD34+CD38-CD90+細(xì)胞(LSCs)24 h，檢測到LSCs的數(shù)量減少，凋亡增加。而尼洛替尼對CML患者源LSCs無清除作用，與PD146176聯(lián)合用藥對LSCs的清除作用無協(xié)同效應(yīng)。上述結(jié)果與某些研究中TKIs殺傷白血病細(xì)胞、但不能根除LSCs的結(jié)論相一致[25-26]。在長期培養(yǎng)起始細(xì)胞(long-time culture-initiating cell，LTC-IC)試驗(yàn)中觀察到PD146176使CML患者源LSCs的數(shù)量明顯減少，細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞凋亡增加。隨后，用流式檢測CFSE標(biāo)記的人CD34+CML細(xì)胞的分裂潛能，觀察到PD146176單藥組或聯(lián)合伊馬替尼，或聯(lián)合尼洛替尼組的細(xì)胞增殖明顯受到抑制，幾乎檢測不到細(xì)胞分裂相；而其對健康對照組CD34+HSCs的增殖能力沒有明顯影響[6]。上述的研究結(jié)果表明，15-LO抑制劑PD146176可清除CML患者的LSCs和白血病細(xì)胞，但其作用機(jī)制及其臨床有效濃度、安全性有待進(jìn)一步觀察。

5 15-LO在慢性髓系白血病中的作用機(jī)制

Selp(又稱為P選擇素，P-selectin)基因在Alox15-/-小鼠HSCs中表達(dá)上調(diào)[6]。將PD146176孵育人白血病K562細(xì)胞后，Selp表達(dá)上調(diào)，而用15-LO代謝產(chǎn)物15-羥基二十碳四烯酸和脂氧素A4(lipoxin A4，LXA4)孵育人白血病K562細(xì)胞后，Selp表達(dá)下調(diào)，結(jié)果提示Selp在15-LO調(diào)控LSCs生物學(xué)特性中發(fā)揮作用，Selp是Alox15的下游靶基因。其次，將Alox15-/-小鼠與Selp-/-小鼠交配產(chǎn)生Alox15-/-Selp-/-雙基因敲除的純合子小鼠， Bcr-Abl轉(zhuǎn)染Alox15-/-Selp-/-小鼠的骨髓細(xì)胞后移植給受致死劑量射線處理的受體鼠，觀察到受體鼠出現(xiàn)CML樣小鼠典型的骨髓象(LSCs增加)、外周血象(白血病細(xì)胞)和組織學(xué)改變(肺、脾有白血病細(xì)胞浸潤)，骨髓細(xì)胞的克隆形成能力得到恢復(fù)(克隆形成的數(shù)量增加)，骨髓細(xì)胞凋亡減少。結(jié)果提示Selp-/-使Alox15-/-靶向清除LSCs的作用得到恢復(fù)，但調(diào)控機(jī)制及其對HSCs的影響尚不清楚。

Chen等[6]將MSCV-Selp-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓細(xì)胞后移植給受體鼠，120 d時，與不攜帶Selp的對照組比較，實(shí)驗(yàn)組受體鼠外周血GFP+細(xì)胞和骨髓HSCs的百分比值降低，推測過表達(dá)Selp對正常HSCs的功能有抑制作用。另外，用DNA芯片分析Selp+/+HSCs(野生型)和Selp-/-HSCs的基因譜，與野生型組比較，Selp-/-對HSCs的影響主要是與細(xì)胞黏附和凋亡相關(guān)基因有關(guān)，推測Selp通過影響細(xì)胞的運(yùn)動能力和凋亡來調(diào)節(jié)HSCs的功能[6, 27-28]，但相關(guān)信號通路有待進(jìn)一步研究。

Wnt/β-catenin信號通路是維持健康穩(wěn)態(tài)造血的關(guān)鍵信號，在LSCs中Wnt通路呈現(xiàn)異常活化[29-30]。Kinder等[17]報道，與野生型(Alox15+/+)造血干/祖細(xì)胞比較，Alox15-/-造血干/祖細(xì)胞的裂解液中β-catenin蛋白量及其在核內(nèi)的定位減少。Heidel等[29]通過遺傳失活或靶向藥物調(diào)節(jié)使β-catenin缺失，再聯(lián)合伊馬替尼治療CML，可有效清除LSCs，阻止疾病復(fù)發(fā)。李慶昌等[31]報道，在Bcr-Abl誘導(dǎo)形成的髓系白血病細(xì)胞中，β-catenin表達(dá)缺失可抑制Bcr-Abl蛋白表達(dá)及Stat-5α磷酸化。上述研究提示，Wnt/β-catenin信號通路介導(dǎo)Alox15對HSCs和CML源LSCs的調(diào)控作用。但15-LO及其編碼基因Alox15在Bcr-Abl陽性的CML中的詳細(xì)作用機(jī)制及其它相關(guān)信號通路還有待進(jìn)一步闡述。

6 小結(jié)與展望

LSCs是白血病復(fù)發(fā)和耐藥的根源。當(dāng)前，TKIs是CML的臨床一線用藥，但其僅能殺死白血病細(xì)胞，不能根除LSCs，不能治愈CML[23]。因此，發(fā)現(xiàn)靶向LSCs的分子標(biāo)簽是當(dāng)前的研究重點(diǎn)。已有研究表明，15-LO通過影響慢性髓系LSCs的自我更新、增殖、分化及凋亡發(fā)揮促癌作用，是識別慢性髓系LSCs的分子標(biāo)簽[6, 22]；15-LO抑制劑(PD146176)或Alox15-/-通過調(diào)控下游靶基因Selp發(fā)揮靶向清除慢性髓系LSCs的作用，但其相關(guān)的調(diào)控機(jī)制以及PD146176的臨床有效濃度和安全性尚需進(jìn)一步評價，從而為未來臨床開展15-LO抑制劑治療CML奠定理論基礎(chǔ)。其次，Alox15-/-使HSCs的數(shù)量減少，“干性”有缺陷，但與其對LSCs的清除作用相比較，作用較弱，存在治療時間窗，為CML的靶向治療拓展了新的思路和策略。另外，Alox15在其它類型白血病中的作用需要更深入、廣泛的研究。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Roles of 15-lipoxygenases in chronic myeloid leukemia

MEI Fen1, LI Rui-wei1, YANG Tong-hua2, SA Ya-lian1

(1TheAffiliatedHospitalofKunmingUniversityofScienceandTechnology,InstituteofClinicalandBasicMedicalSciences,YunnanProvincialFirstPeople’sHospital,Kunming650050,China;2StateKeyClinicalDepartmentofHematology,YunnanProvincialFirstPeople’sHospital,Kunming650032,China.E-mail:sayalian@126.com)

Tyrosine kinase inhibitors (TKIs) are now advocated as the first-line treatment for chronic myeloid leukemia (CML), but facing resistance and relapse. Leukemia stem cells (LSCs) are leukemia-initiating cells as the source of resistance and relapse. It is therefore important to discover the molecular biomarker of LSCs for developing anti-LSC strategies in leukemic therapy. 15-Lipoxygenase (15-LO) is a key enzyme in the pathway of arachidonic acid and plays an important role in the occurrence and development of CML, which is specifically required for chronic myeloid LSCs. This review summarizes the influence of 15-LO on the chronic myeloid LSC characteristics of marked survival, self-renewal, proliferation, differentiation and apoptosis.

15-脂氧合酶； 花生四烯酸15-脂氧合酶基因； 慢性髓系白血??； 白血病干細(xì)胞

15-Lipoxygenase; Arachidonate 15-lipoxygenase gene; Chronic myeloid leukemia; Leukemia stem cells

1000- 4718(2016)10- 1916- 05

2016- 05- 11

2016- 07- 18

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31460298; No.81460073)；云南省科技廳-昆明醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合專項(xiàng)應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(No.2014FZ070; No.2014FB092)；云南省衛(wèi)生和計劃生育委員會內(nèi)設(shè)機(jī)構(gòu)資助項(xiàng)目(No.2014NS271)

△通訊作者Tel： 0871-63648772; E-mail: sayalian@126.com

R730.231

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.030

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